Name: in vivo immunofluorescence localization for assessment of therapeutic and diagnostic antibody biodistribution in cancer research
Uploaded: 2019-09-16T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research at JoVE.com

Мы благодарим д-ра Эндрю Олсона (Стэнфордская служба микроскопии) за обсуждения и использование оборудования. Мы благодарим д-ра Juergen К. Виллманн за его наставничество. Это исследование было поддержано грантом NIH R21EB022214 (KEW), грантом на обучение NIH R25CA118681 (KEW) и NIH K99EB023279 (KEW). Служба микроскопии нейронауки в Стэнфорде была поддержана NIH NS069375.

Все описанные здесь методы были одобрены Институциональной административной группой по лабораторному уходу за животными (APLAC) Стэнфордского университета.
1. Трансгенная модель мыши развития рака молочной железы
<ol><li>Наблюдайте мышей от пожеланной модели рака для соотв...

<ol>
	<li>Forthal, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+Antibodies.">Functions of Antibodies.</a> Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).</li><li>Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+antibody+fragments+with+monovalent+femtomolar+antigen-binding+affinity.">Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>Lonberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+human+antibodies+from+mice+comprising+four+distinct+genetic+modifications.">Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications.</a> Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).</li><li>McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+antibodies:+filamentous+phage+displaying+antibody+variable+domains.">Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains.</a> Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).</li><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+incidence+and+mortality+worldwide:+sources,+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012.">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).</li><li>Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+trends+for+monoclonal+antibody+cancer+therapeutics.">Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).</li><li>Kircher, M. F., Willmann, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Body+Imaging:+MR+Imaging,+CT,+and+US.+Part+I.+Principles.">Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles.</a> Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).</li><li>Fleuren, E. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theranostic+applications+of+antibodies+in+oncology.">Theranostic applications of antibodies in oncology.</a> Molecular Oncology. 8 (4), 799-812 (2014).</li><li>Forsstr&#246;m, B., Bis&#322;awska Axn&#228;s, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Antibodies+with+Regards+to+Linear+and+Conformational+Epitopes.">Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes.</a> PLoS ONE. 10 (3), (2015).</li><li>Woof, J. M., Burton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody-Fc+receptor+interactions+illuminated+by+crystal+structures.">Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).</li><li>Brooks, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+genomics:+The+challenge+of+developing+cancer+biomarkers.">Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers.</a> Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).</li><li>Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+Mechanisms+of+Therapeutic+Monoclonal+Antibodies+in+Health+and+Disease.">Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease.</a> The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).</li><li>Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+immunohistochemistry.">Applications of immunohistochemistry.</a> Journal of Pharmacy &amp; Bioallied Sciences. 4 (Suppl 2), S307-S309 (2012).</li><li>Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+cancer+with+positron+emission+tomography.">Molecular imaging of cancer with positron emission tomography.</a> Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).</li><li>Freise, A. C., Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+with+Antibodies+and+Engineered+Fragments.">In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments.</a> Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).</li><li>Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Tumor+Penetration+and+Single-Cell+Targeting+of+Antibody-Drug+Conjugates+Increases+Anticancer+Efficacy+and+Host+Survival.">Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival.</a> Cancer Research. 78 (3), 758-768 (2018).</li><li>Wilson, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+Photoacoustic+Molecular+Imaging+of+Breast+Cancer+using+a+B7-H3-targeted+ICG+Contrast+Agent.">Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent.</a> Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).</li><li>Wischhusen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+molecular+imaging+as+a+non-invasive+companion+diagnostic+for+netrin-1+interference+therapy+in+breast+cancer.">Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer.</a> Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).</li><li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene:+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease.">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).</li><li>Hober, S., Nord, K., Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+A+chromatography+for+antibody+purification.">Protein A chromatography for antibody purification.</a> Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Bachawal, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Earlier+detection+of+breast+cancer+with+ultrasound+molecular+imaging+in+a+transgenic+mouse+model.">Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model.</a> Cancer Research. 73, 1689-1698 (2013).</li><li>Fitamant, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin-1+expression+confers+a+selective+advantage+for+tumor+cell+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78 (3), 425-435 (1994).</li><li>Ryman, J. T., Meibohm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+Monoclonal+Antibodies.">Pharmacokinetics of Monoclonal Antibodies.</a> CPT: Pharmacometrics &amp; Systems Pharmacology. 6 (9), 576-588 (2017).</li><li>Scalia, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Masking+During+Fixation+and+Embedding,+Dissected.">Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).</li><li>Robertson, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+labeled+tomato+lectin+for+imaging+vasculature+structures.">Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures.</a> Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).</li><li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+reprograms+lymphatic+vessels+to+blood+vessels.">Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li><li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Fluorescence+Immunohistochemistry:+Localization+of+Fluorescently+Labeled+Cetuximab+in+Squamous+Cell+Carcinomas.">In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li><li>Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+resistance+to+immune+checkpoint+inhibitors.">Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors.</a> British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).</li><li>Rexer, B. N., Arteaga, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+acquired+resistance+to+HER2-targeted+therapies+in+HER2+gene-amplified+breast+cancer:+mechanisms+and+clinical+implications.">Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications.</a> Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).</li></ol>

Этот метод имеет несколько важных шагов и требует потенциальных изменений для обеспечения успешной реализации. Во-первых, дозировка и сроки антитела / антитела конъюгированных внутривенных инъекций должны быть адаптированы к конкретному применению. Как правило, дозы должны быть испо?...

Моноклональные антитела (mAb) являются крупными гликопротеином (приблизительно 150 кДа) суперсемейства иммуноглобулина, которые выделяются В-клетками и имеют первичную функцию в иммунной системе для выявления и либо ингибирования биологической функции, либо знака для разрушение, бактериальных или вирусных патогенов, и может распознать ненормальное выражение белка на раковых клетках1. Антитела могут иметь чрезвычайно высокое сродство к их специфическим эпитопов вплоть до фемтомолярных концентраций, что делает их весьма перспективными инструментами в биомедицине2. С развитием технологии гибридомы Мильштейном и Кёлером (награжден Нобелевской премией в 1984 году), производство mAbs стало возможным3. Позже, человеческие mAbs были созданы с использованием технологии фагового дисплея или трансгенных штаммов мыши и революционизировали их использование в качестве новых исследовательских инструментов и терапевтических средств4,5.
Рак является проблемой здравоохранения во всем мире и основной причиной смерти, создающих необходимость новых подходов к профилактике, выявлению и терапии6. На сегодняшний день mAbs позволили вывести из роли генов и их белков в tumorigenesis и, когда направлены против рака биомаркеров, может позволить обнаружение опухоли и характеристики для стратификации пациента. Для терапии рака, биспецифические mAbs, антитела-наркотики конъюгирует, и меньше фрагменты антител разрабатываются в качестве терапии, и для целевой доставки наркотиков для повышения терапевтической эффективности7. Кроме того, антитела служат для биомаркера ориентации контрастных агентов для молекулярных методов визуализации, таких как флуоресцентная хирургия, фотоакустическая (PA) визуализация, ультразвуковая (US) молекулярная визуализация, и клинически используемые позитронное излучение томография (ПЭТ) или однофотонные эмиссионные компьютерная томография (SPECT)8. Наконец, антитела также могут быть использованы в качестве тераностических агентов, позволяющих стратификации пациентов и мониторинга ответов для целевых методов лечения9. Таким образом, новые mAbs начинают играть важную роль в выявлении рака, диагностике и лечении.
Несмотря на критические достижения в разработке и производстве новых и высокоспецифических mAbs, диагностическое и терапевтическое применение может оказаться неэффективным из-за сложности опухолевой среды. Взаимодействия антител зависят от типа эпитопа,т.е. ли это линейное или конформационное10. В дополнение к признанию антигенов, антитела должны преодолеть естественные барьеры, такие как стенки сосудов, базальные мембраны, и строма опухоли для достижения целевых клеток, выражающих антиген. Антитела взаимодействуют с тканью не только через переменный фрагмент антигена связывания (Fab) домена, но и через постоянный кристаллический фрагмент (Fc), который далее приводит к вне участка взаимодействия11. Ориентация также осложняется неоднородным выражением опухолевых маркеров по всей опухолевой массе и неоднородности в опухолевой васкуляризации и лимфатической системы12,13. Кроме того, микроокружение опухоли состоит из связанных с раком фибробластов, которые поддерживают опухолевые клетки, опухолевые иммунные клетки, которые подавляют противоопухолевые иммунные реакции, и опухолевый эндотелий, который поддерживает транспортировку кислорода и питательных веществ, все которые мешают проникновению, распространению и доступности антител на основе терапии или диагностики. В целом, эти соображения могут ограничить терапевтическую или диагностическую эффективность, уменьшить реакцию на лечение, и может привести к устойчивости к опухоли.
Поэтому для развития эффективных антител на основе терапии и диагностики, имеет решающее значение для оценки биораспределения и взаимодействия антител на основе конъюгировать в микроокружении опухоли. В настоящее время в доклинических исследованиях экспрессия маркеров в моделях исследования опухолей анализируется ex vivo по иммунофлуоресценции (ИФ) окрашивания опухолевых секций14. Стандартное окрашивание ЕСЛИ выполняется с первичными маркерными антителами, которые затем подчеркиваются вторичными флуоресцентно помеченными антителами на ломтиках опухолевой ткани ex vivo, которые были выделены от животного. Этот метод подчеркивает статическое расположение маркера во время фиксации тканей и не дает представления о том, как антитела на основе терапии или диагностики могут распространять или взаимодействовать в физиологических условиях. Молекулярная визуализация по ПЭТ, SPECT, США, и PA может предоставить информацию о антитела химки-конъюгированный контрастный агент распределения в живых доклинических моделей8,15. Поскольку эти методы визуализации являются неинвазивными, продольные исследования могут быть выполнены и чувствительные к времени данные могут быть собраны с минимальным количеством животных в группе. Однако эти неинвазивные подходы к молекулярной визуализации недостаточно чувствительны и не имеют достаточного разрешения для локализации распределения антител на клеточном уровне. Кроме того, физические и биологические характеристики первичного антитела могут быть резко изменены путем спряжения контрастного агента16.
Для того, чтобы принять in vivo физиологических и патологических условий во внимание, как антитела на основе терапии и диагностики взаимодействуют в опухолевой среде и получить высокое разрешение клеточной и даже суб-клеточной распределения профили неконъюгированных антител, мы предлагаем if подход, считается В Иво иммунофлуоресценции Локализация (IVIL), в котором антиген-специфические антитела внутривенно вводятся в vivo. Антитела на основе терапевтических или диагностических, действуя в качестве основного антитела, циркулирует в функциональных кровеносных сосудов и связывается с его целевой белок в высокоточной, живой среде опухоли. После изоляции опухолей с первичными антителами, вторичное антитело используется для локализации накопленных и сохраненных конъюгатов антител. Этот подход аналогичен ранее описанного подхода IF гистологии инъекционных флуоресцентно помеченных антител17. Хотя здесь, использование неконъюгированных антител позволяет избежать потенциального изменения в характеристиках биораспределения, вызванных модификацией антител. Кроме того, применение ex vivo флуоресцентных вторичных антител позволяет избежать возможной потери сигнала флуоресценции во время сбора и обработки тканей и обеспечивает усиление интенсивности флуоресценции. Наш подход к маркировке отражает биораспределение в vivo антител на основе лекарств и целевых агентов и может обеспечить важную информацию для разработки новых диагностических и терапевтических агентов.
Здесь мы описываем два применения метода IVIL, применяемых в предыдущих исследованиях, исследующих биораспределение и доступность контрастных агентов на основе антител для молекулярной визуализации подходов к обнаружению рака молочной железы. Во-первых, биораспределение антител ближнего инфракрасного красителя конъюгированных (анти-B7-H3 антитела связаны с ближней инфракрасной флуоресценции красителя, индоцианин зеленый, B7-H3-ICG) и изотип ный агент управления (Iso-ICG) для флуоресценции и фотоакустических молекулярных изображение исследуется18. Метод этого приложения описан в протоколе. Далее, результаты биораспределения конформистски чувствительных антител к нетрин-1, как правило, не обнаруживаемые с помощью традиционных IF изображений, используемых с ультразвуковой молекулярной визуализации, количественно и представлены в репрезентативных результатах19. В конце этого протокола документ, читатели должны чувствовать себя комфортно принятия метода IVIL для своих собственных антител на основе научно-исследовательских приложений.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:990px;" width="990">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animal Model</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td style="width:334px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J</td>
			<td style="width:196px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:166px;">002374</td>
			<td>Females, 4-6 weeks of age</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animal Handling Supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">27G Catheter</td>
			<td style="width:196px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:166px;">Please call to order</td>
			<td>Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Alcohol Wipes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">22-246073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Gauze Sponges (4&#34; x 4&#34; 16 Ply)</td>
			<td style="width:196px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:166px;">2913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Heat Lamp</td>
			<td style="width:196px;">Morganville Scientific</td>
			<td style="width:166px;">&#160;HL0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:196px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:166px;">29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">NC0490117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Surgical Tape</td>
			<td style="width:196px;">3M</td>
			<td style="width:166px;">1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue Collection</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Disposable Base Molds</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">22-363-556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Surgical London Forceps</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11080-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:166px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antibodies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A-11006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A-11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-594 goat anti-human IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A11014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human IgG Isotype Control</td>
			<td style="width:196px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:166px;">NBP1-97043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Humanized anti-netrin-1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Netris Pharma</td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td>contact@netrispharma.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td style="width:166px;">ab134161</td>
			<td>EPNCIR122 Clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rat anti-Mouse CD31</td>
			<td style="width:196px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:166px;">550274</td>
			<td>MEC 13.3 Clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Reagents</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Clear Nail Polish</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td>Any local drug store</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Indocyanine Green - NHS</td>
			<td style="width:196px;">Intrace Medical</td>
			<td style="width:166px;">ICG-NHS ester</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mounting Medium</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">TA-006-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">ICN19135680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Adhesion Glass Slides</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:166px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Desalting Columns</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">45-000-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Glass Cover Slips</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">12-544G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td style="width:196px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:166px;">22311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Slide Staining Tray</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:166px;">87000-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Software</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">FIJI</td>
			<td style="width:196px;">LOCI, UW-Madison.</td>
			<td style="width:166px;">Version 4.0</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo immunofluorescence localization for assessment of therapeutic and diagnostic antibody biodistribution in cancer research

Моноклональные антитела (mAbs) являются важными инструментами в выявлении, диагностике и лечении рака. Они используются для распутывания роли белков в опухолевом игенезе, могут быть направлены на раковые биомаркеры, позволяющие выявлять и характеризовать его, и могут быть использованы для терапии рака в качестве mAbs или антител-наркотики, чтобы активировать клетки иммунного эффектора, ингибировать сигнальные пути, или непосредственно убить клетки, несущие конкретный антиген. Несмотря на клинические достижения в разработке и производстве новых и высокоспецифических mAbs, диагностическое и терапевтическое применение может быть нарушено сложностью и неоднородностью микроокружения опухоли. Таким образом, для развития эффективных антител на основе терапии и диагностики, имеет решающее значение для оценки биораспределения и взаимодействия антител на основе конъюгировать с живой микросреды опухоли. Здесь мы описываем In Vivo Иммунофлуоресценция Локализация (IVIL) как новый подход к изучению взаимодействия антител на основе терапии и диагностики в in vivo физиологических и патологических условиях. В этом методе, терапевтические или диагностические антиген-специфические антитела внутривенно вводят в vivo и локализованы ex vivo со вторичным антителом в изолированных опухолях. IVIL, таким образом, отражает in vivo биораспределение антител на основе наркотиков и целевых агентов. Описаны два применения IVIL, оценивающих биораспределение и доступность контрастных агентов на основе антител для молекулярной визуализации рака молочной железы. Этот протокол позволит будущим пользователям адаптировать метод IVIL для своих собственных исследовательских приложений на основе антител.

Метод IVIL был использован здесь для изучения биораспределения in vivo и взаимодействия тканей B7-H3-ICG и Iso-ICG, позволяя агентам после внутривенной инъекции в живое животное взаимодействовать с целевой тканью в течение 96 ч, а затем, как только ткани собраны, чтобы выступать в к...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research at JoVE.com

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Метод локализации иммунофлуоресценции in vivo (IVIL) может быть использован для изучения биораспределения антител и антител в vivo для онкологических целей в живых организмах, используя сочетание таргетинга опухоли in vivo и иммунодефицита ex vivo Методы.

В Vivo Иммунофлуоресценция Локализация для оценки терапевтического и диагностического антитела биораспределения в онкологических исследований

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Этот протокол для локализации иммунофлюоресценции in vivo, или IVIL, оценивает биораспределяние диагностических и терапевтических антител или антител на основе агентов для исследования, обнаружения и лечения рака. В отличие от обычного иммунофлюоресцентного окрашивания, при котором клеточная экспрессия антигенов раскрывается ex vivo, метод IVIL разъясняет, как антитела и антитела на основе агентов распределяются в живом животном. Это видео поможет понять общий рабочий процесс метода IVIL.Он показывает важные детали для успешного воспроизведения протокола для других применений и антител. Наблюдайте мышей от пожеланную модель рака для сооместительного роста тумора через palpation или измерение caliper перед продолжать. Очистить кролика против мыши B7-H3 и кролика IgG изотипа контроля антител на опресняющие колонки для удаления консервантов и буферов хранения в соответствии с инструкциями производителя.Aliquot дозировки 33 микрограммов каждого антитела конъюгировать в отдельных микроцентрифуг труб. После анестезии, как описано в текстовом протоколе, подготовьтесь к прививке хвостовых вен антител. Дезинфицировать хвост животного, вытирая три раза спиртовой салфеткой.Расширяют вены хвоста, нагревая тепловой прокладкой в течение примерно 30 секунд. Избегайте нагревания всего животного. Используя катетер хвостовой вены 27-го калибра, вставьте иглу бабочки в одну из двух вен бокового хвоста.Визуализуть приток крови обратно в катетер, чтобы убедиться, что игла правильно размещены так, что решения будут полностью войти в животное по сравнению с захватили в хвосте. Используйте кусок хирургической ленты, чтобы тщательно исправить хвост с вставленной иглой на сцену. Промыть катетер 25 микролитров стерильного фосфатно-буферного солевого раствора.Затем ввимите раствор антител в катетер с помощью инсулиновых шприцев. Промыть катетер еще раз с 25 микролитров стерильных PBS. Снимите иглу с хвоста и нанесите давление, чтобы остановить кровотечение.Выполните гуманную эвтаназию мыши, как описано в текстовом протоколе, и положите мышь в положение лежа. Используйте хирургические ножницы и типсы для акцизных опухолевых тканей. Используйте типсы, чтобы схватить только внешний слой кожи между набором молочных желез ближе всего к хвосту, и сделать небольшой разрез с парой хирургических ножниц.Ввести закрытые ножницы в разрез, и медленно открыть кончик, чтобы тщательно отделить кожу от основной мембраны брюшной стенки, сохраняя его нетронутыми. Сделайте вертикальный разрез вверх по животу, продолжая отделять кожу от внутренней мембраны. Между третьим и четвертым молочных желез, сделать горизонтальный разрез по всему животу, чтобы опровержение кожи и визуализации молочных желез.Хватая каждую опухоль или нормальную железу типсами, тщательно обрезайте прикрепленную кожу хирургическими ножницами. Поместите вырезанные ткани в ткани одноразовые базовые формы, которые предварительно помечены и заполнены оптимальной температурой резки встраивания среды. Быстро заморозить формы путем размещения на сухом льду.Для изучения внецелевых поставок, акцизных других тканей или органов, представляющих интерес. Используя криостат, раздел замороженных блоков ткани на 10-микрон толщиной, и место смежных разделов на предварительно помеченные адгезии стеклянные слайды. Промыть замороженные ткани слайды с комнатной температурой PBS в течение пяти минут, чтобы удалить встраивание среды.Демаркировать секции тканей гидрофобной заградительной ручкой, чтобы уменьшить объем растворов, необходимых во время окрашивания. Зафиксировать секции тканей с 4%paraformaldehyde раствор в течение пяти минут. После полоскания слайдов в PBS в течение пяти минут, пронизывают секции тканей с 0,5%Triton X-100 в PBS в течение 15 минут.Промыть слайды снова в PBS в течение пяти минут. Блок тканей с PBS, содержащих 3%weight на объем крупного рогатого скота сыворотки альбумин и 5%volume на объем козьей сыворотки в течение одного часа при комнатной температуре. После полоскания слайдов в PBS в течение пяти минут, инкубировать разделы с учета первичных антител, таких как общий ядерный, сосудистый или цитоплазмический маркер.Здесь крыса анти-мышь CD31 используется на один-к-100 разбавления в блокирующий раствор. Слайды с первичными антителами остаются на ночь при четырех градусах Цельсия, защищенных от обезвоживания на подносе для слайдов. После инкубации, промыть слайды в PBS в течение пяти минут три раза.Изменение PBS каждый раз. Инкубировать слайды со вторичными антителами для обозначения основных антител. Для этого приложения, визуализировать анти-B7-H3 антитела с помощью Alexa Fluor 546 конъюгированных коз анти-кролик антитела, и визуализировать CD31 с Alexa Fluor 488 коза анти-крысы вторичного антитела в блокирующий раствор.Защитите горки от света и обезвоживания на подносе для слайдов в течение одного часа при комнатной температуре. После полоскания слайдов в PBS, как и прежде, применить одну каплю монтажной среды в центр ткани ломтик. Аккуратно поместите крышку, избегая захвата пузырьков воздуха.Печать края крышки с четким лаком для ногтей, и дайте высохнуть. Продолжить конфокалиптического микроскопического изображения и количественного анализа изображений, как описано в текстовом протоколе. Представительные конфокальные микрографы показывают сравнение специфических антител B7-H3-ICG конъюгированных и неспецифических изотипных антител-ICG конъюгированных локализаций в муриновых молочных железах, содержащих нормальные или карциномные ткани.Нормальные молочные железы мурина от животного внутривенно вводили с Iso-ICG или B7-H3-ICG и противопоявленные CD31 не показывают окрашивания конъюгированных антител. Нормальные ткани, как было показано, не имеют выражения B7-H3 стандартным ex vivo иммунофторесценции окрашивания. При инвазивных опухолях молочной железы, B7-H3-ICG сильно связывается с сосудами, первой точкой контакта in vivo, а затем способен экстравазать из сосуда в неоднородно испачкать эпителий опухоли.Iso-ICG показывает неспецифическое накопление в опухолевых тканях. Стандартное иммунофлуоресцентное окрашивание ex vivo показывает равномерное выражение маркера B7-H3 на эпителиальных и эндотелиальных клетках. Репрезентативные конфокальные микрографы показывают метод локализации иммунофлюоресценции in vivo для обнаружения экспрессии netrin-1 или экспрессии контроля изотипа в муриновой карциноме и нормальных молочных железах.Виво иммунофлюоресценции локализации подтверждает эпителиальный сигнал для нетрина-1 в опухолях MMTV-PyMT, но не в нормальных молочных желез. Кроме того, существует сильный сигнал нетрина-1 на эндотелиальных клетках опухолей молочной железы, о чем свидетельствует колокализованный желтый сигнал. Сигнал значительно слабее в нормальных молочных желез.Метод IVIL необходимо оптимизировать с точки зрения дозировки антител, сроков сбора тканей и вторичного разбавления антител для успешной реализации. IVIL позволяет таргетирование конформных эпитопов, которые не могут быть обнаружены с помощью стандартного иммунофлуоресценции окрашивания, которое требует обработки тканей. Кроме того, здоровые органы опухолевых мышей могут быть собраны для оценки внецелевой доставки терапевтических антител.С расширением использования антител на основе терапии и контрастных агентов в исследованиях рака и управления, метод IVIL является весьма применимым к фармацевтическим исследованиям и разработкам. Исследователи в области лечения рака, молекулярной визуализации, воспаления и других областях могут обнаружить, что метод IVIL предоставляет полезную информацию.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Имаджинальное Disc Опухоль Модель: Визуализация и Количественная экспрессии генов и опухолевой инвазии с использованием генетических Мозаики

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

В естественных условиях ЭПР Оценка рН, pO2, окислительно-восстановительного состояния и концентрации фосфатов и глутатиона в микроокружения опухоли

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Оценка сопротивления ингибитора киназы тирозина путем допроса сигнальных путей, антитела массивы

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

С помощью 22 c 3 антитела анти PD-L1 сосредоточиться на биопсию и цитологических мазков из больных раком легкого немелкоклеточного

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Создание желудка рака пациента полученных Ксенотрансплантат Модели и первичные линии клеток

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Полуавтоматический PD-L1 Характеристика и перечисление циркулирующих опухолевых клеток от немелкоклеточных больных раком легких по иммунофлуоресценции

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Анализ опухоли и распределения тканей целевого антигена специфических терапевтических антител

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Улучшенная жизнеспособность для Ex vivo 3D гидрогелевых культур ксенотрансплантатов, полученных пациентами, в переливной микрофлюидной платформе

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Иммунофлуоресценция Визуализация повреждения ДНК и ремонт Фочи в раковых клетках толстой кишки человека

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...