Name: in vivo immunofluorescence localization for assessment of therapeutic and diagnostic antibody biodistribution in cancer research
Uploaded: 2019-09-16T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research at JoVE.com

Vi tackar Dr Andrew Olson (Stanford neurovetenskap Microscopy service) för diskussioner och utrustning användning. Vi tackar Dr. Juergen K. Willmann för hans mentorskap. Denna studie stöddes av NIH R21EB022214 Grant (KEW), NIH R25CA118681 Training Grant (KEW) och NIH K99EB023279 (KEW). Stanford neurovetenskap Microscopy tjänsten stöddes av NIH NS069375.

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella administrativa panelen för laboratoriedjur omsorg (APLAC) vid Stanford University.
1. transgen musmodell av bröstcancer utveckling
<ol><li>Observera möss från önskad cancer modell för lämplig tumörtillväxt via palpation eller bromsmått innan du fortsätter. Anmärkning: här, den transgena murina modell av bröstcancer utveckling (FVB/N-TG (MMTV-PyMT) 634Mul/J) (MMTV-PyMT) användes. Dessa djur utvecklar spontan...

<ol>
	<li>Forthal, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+Antibodies.">Functions of Antibodies.</a> Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).</li><li>Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+antibody+fragments+with+monovalent+femtomolar+antigen-binding+affinity.">Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>Lonberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+human+antibodies+from+mice+comprising+four+distinct+genetic+modifications.">Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications.</a> Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).</li><li>McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+antibodies:+filamentous+phage+displaying+antibody+variable+domains.">Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains.</a> Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).</li><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+incidence+and+mortality+worldwide:+sources,+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012.">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).</li><li>Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+trends+for+monoclonal+antibody+cancer+therapeutics.">Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).</li><li>Kircher, M. F., Willmann, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Body+Imaging:+MR+Imaging,+CT,+and+US.+Part+I.+Principles.">Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles.</a> Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).</li><li>Fleuren, E. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theranostic+applications+of+antibodies+in+oncology.">Theranostic applications of antibodies in oncology.</a> Molecular Oncology. 8 (4), 799-812 (2014).</li><li>Forsstr&#246;m, B., Bis&#322;awska Axn&#228;s, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Antibodies+with+Regards+to+Linear+and+Conformational+Epitopes.">Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes.</a> PLoS ONE. 10 (3), (2015).</li><li>Woof, J. M., Burton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody-Fc+receptor+interactions+illuminated+by+crystal+structures.">Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).</li><li>Brooks, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+genomics:+The+challenge+of+developing+cancer+biomarkers.">Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers.</a> Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).</li><li>Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+Mechanisms+of+Therapeutic+Monoclonal+Antibodies+in+Health+and+Disease.">Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease.</a> The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).</li><li>Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+immunohistochemistry.">Applications of immunohistochemistry.</a> Journal of Pharmacy &amp; Bioallied Sciences. 4 (Suppl 2), S307-S309 (2012).</li><li>Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+cancer+with+positron+emission+tomography.">Molecular imaging of cancer with positron emission tomography.</a> Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).</li><li>Freise, A. C., Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+with+Antibodies+and+Engineered+Fragments.">In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments.</a> Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).</li><li>Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Tumor+Penetration+and+Single-Cell+Targeting+of+Antibody-Drug+Conjugates+Increases+Anticancer+Efficacy+and+Host+Survival.">Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival.</a> Cancer Research. 78 (3), 758-768 (2018).</li><li>Wilson, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+Photoacoustic+Molecular+Imaging+of+Breast+Cancer+using+a+B7-H3-targeted+ICG+Contrast+Agent.">Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent.</a> Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).</li><li>Wischhusen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+molecular+imaging+as+a+non-invasive+companion+diagnostic+for+netrin-1+interference+therapy+in+breast+cancer.">Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer.</a> Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).</li><li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene:+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease.">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).</li><li>Hober, S., Nord, K., Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+A+chromatography+for+antibody+purification.">Protein A chromatography for antibody purification.</a> Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Bachawal, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Earlier+detection+of+breast+cancer+with+ultrasound+molecular+imaging+in+a+transgenic+mouse+model.">Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model.</a> Cancer Research. 73, 1689-1698 (2013).</li><li>Fitamant, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin-1+expression+confers+a+selective+advantage+for+tumor+cell+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78 (3), 425-435 (1994).</li><li>Ryman, J. T., Meibohm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+Monoclonal+Antibodies.">Pharmacokinetics of Monoclonal Antibodies.</a> CPT: Pharmacometrics &amp; Systems Pharmacology. 6 (9), 576-588 (2017).</li><li>Scalia, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Masking+During+Fixation+and+Embedding,+Dissected.">Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).</li><li>Robertson, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+labeled+tomato+lectin+for+imaging+vasculature+structures.">Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures.</a> Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).</li><li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+reprograms+lymphatic+vessels+to+blood+vessels.">Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li><li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Fluorescence+Immunohistochemistry:+Localization+of+Fluorescently+Labeled+Cetuximab+in+Squamous+Cell+Carcinomas.">In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li><li>Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+resistance+to+immune+checkpoint+inhibitors.">Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors.</a> British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).</li><li>Rexer, B. N., Arteaga, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+acquired+resistance+to+HER2-targeted+therapies+in+HER2+gene-amplified+breast+cancer:+mechanisms+and+clinical+implications.">Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications.</a> Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).</li></ol>

Den här metoden har flera kritiska steg och kräver potentiella ändringar för att säkerställa en lyckad implementering. För det första måste doseringen och tidpunkten för den intravenösa injektionen av antikroppar/antikroppar anpassas till den specifika appliceringen. Generellt, doser bör användas som är förenliga med hur antikropps konjugaten normalt kommer att användas, dvs, matchande doser av den terapeutiska antikroppen eller antikroppsbaserade kontrastmedel. Också, tidpunkten för insamlingen av mål...

Monoklonala antikroppar (mAb) är stora glykoproteiner (ca 150 kDa) av den immunglobulin superfamiljen som utsöndras av B-celler och har en primär funktion i immunsystemet för att identifiera och antingen hämma den biologiska funktionen av, eller mark för förstörelse, bakteriella eller virala patogener, och kan känna igen onormala proteinuttryck på cancerceller1. Antikroppar kan ha en extremt hög affinitet till sina specifika epitoper ner till femtomolar koncentrationer vilket gör dem mycket lovande verktyg i biomedicin2. Med utvecklingen av Hybridomteknik teknologi av Milstein och Köhler (tilldelat Nobel priset i 1984), blev produktionen av Mabs möjligheten3. Senare, mänskliga Mabs genererades med hjälp av fagdisplay teknik eller transgena mus stammar och revolutionerade deras användning som nya forskningsverktyg och Therapeutics4,5.
Cancer är en global hälsofråga och en viktig dödsorsak som skapar behovet av nya metoder för att förebygga, upptäcka och terapi6. Hittills har Mabs tillåtit losstagning av rollen av gener och deras proteiner i tumorigenes och när riktas mot cancer biomarkörer, kan möjliggöra tumör detektering och karakterisering för patientens stratifiering. För cancerbehandling, bispecific mAbs, antikropp-läkemedel konjugat, och mindre antikroppar fragment utvecklas som Therapeutics, och för riktade läkemedelsleverans för att förbättra terapeutisk effekt7. Dessutom används antikroppar för biomarkör inriktning av kontrastmedel för molekylära avbildningsmetoder såsom fluorescensstyrd kirurgi, Fotoakustisk (PA) avbildning, ultraljud (US) molekylär avbildning, och kliniskt använda positron emission tomografi (PET) eller singelfotonemission datortomografi (SPECT)8. Slutligen, antikroppar kan också användas som theranostic agenter möjliggör stratifiering av patienter och respons övervakning för riktade terapier9. Därför, nya mAbs börjar spela en kritisk roll i cancer upptäckt, diagnos, och behandling.
Trots kritiska framsteg i utvecklingen och produktionen av nya och mycket specifika mAbs, diagnostiska och terapeutiska tillämpningar kan göras ineffektiva på grund av komplexiteten i tumör miljön. Antikropps interaktioner är beroende av vilken typ av epitop, dvs,om det är linjär eller överensstämande10. Förutom erkännandet av antigener, antikroppar måste övervinna naturliga barriärer såsom kärlväggar, basalmembran, och tumören stroma att nå målceller som uttrycker antigen. Antikroppar interagera med vävnaden inte bara genom variabeln fragment antigen binding (fab) domän utan också genom konstant kristallint fragment (FC) som ytterligare leder till off-site interaktioner11. Inriktning kompliceras också av det heterogena uttrycket av tumörmarkörer i hela tumören bulk och heterogenitet i tumör vaskularisering och lymfkärlen systemet12,13. Dessutom, tumören mikromiljö består av cancerassocierade fibroblaster som stöder tumörceller, tumör immunceller som hämmar anti-tumör immunreaktioner, och tumörendotelet som stöder transport av syre och näringsämnen, alla av som stör penetrationen, distributionen och tillgängligheten av antikroppsbaserade Therapeutics eller diagnostik. Sammantaget kan dessa överväganden begränsa terapeutisk eller diagnostisk effekt, minska behandlingssvaret, och kan resultera i tumör resistens.
Därför, för utveckling av effektiva antikroppsbaserade terapier och diagnostik, det är viktigt att bedöma biodistribution och interaktion av antikropp-baserade konjugatet inom tumören mikromiljö. För närvarande, i prekliniska studier, är markör uttryck i tumör forskningsmodeller analyseras ex vivo av immunofluorescens (om) färgning av tumör avsnitt14. Standard om färgning utförs med primära markör-specifika antikroppar som sedan markeras med sekundär överföras märkta antikroppar på ex vivo tumörvävnad skivor som har isolerats från djuret. Denna teknik belyser den statiska placeringen av markören vid tidpunkten för vävnadfixering och ger inte insikt i hur antikroppsbaserade Therapeutics eller diagnostik kan distribuera eller interagera i fysiologiska förhållanden. Molekylär avbildning av PET, SPECT, US och pa kan ge information om den antikroppskonjugerade kontrasten agent fördelningen i levande prekliniska modeller8,15. Eftersom dessa avbildningsmetoder är icke-invasiva, kan longitudinella studier utföras och tidskänsliga data kan samlas in med ett minimalt antal djur per grupp. Dessa icke-invasiva metoder för molekylär avbildning är dock inte tillräckligt känsliga och har inte tillräcklig upplösning för lokalisering av antikropps distribution på cellnivå. Dessutom kan de fysiska och biologiska egenskaperna hos den primära antikroppen ändras drastiskt genom konjugering av ett kontrastmedel16.
För att ta in vivo fysiologiska och patologiska tillstånd i beaktande av hur antikroppsbaserade Therapeutics och diagnostik samverkar i tumör miljön och för att få högupplöst cellulära och även sub-cellulära distribution profiler av icke-konjugerade antikroppar, föreslår vi en om-metod, som bedöms i vivo Immunofluorescenslokalisering (IVIL), där den antigen-specifika antikroppen injiceras intravenöst in vivo. Den antikroppsbaserade terapeutiska eller diagnostiska, fungerar som en primär antikropp, cirkulerar i funktionella blodkärl och binder till dess målprotein i mycket noggrann, levande tumör miljö. Efter isolering av in vivo-märkta tumörer med den primära antikroppen, en sekundär antikropp används för att lokalisera ackumulerade och balanserade antikroppar konjugat. Denna metod liknar en tidigare beskrivits om histologisk metod injicera Fluorescent märkt antikroppar17. Även här, användning av icke-konjugerade antikroppar undviker en potentiell förändring i biodistribution egenskaper induceras av antikropps modifiering. Dessutom undviker ex vivo applicering av fluorescerande sekundär antikropp en möjlig förlust av fluorescenssignal vid vävnads uppsamling och-bearbetning och ger amplifiering av fluorescenssignalintensitet. Vår märkningsmetod återspeglar in vivo biodistribution av antikroppsbaserade läkemedel och riktade medel och kan ge viktiga insikter för utvecklingen av nya diagnostiska och terapeutiska agenter.
Här beskriver vi två tillämpningar av IVIL-metoden som tillämpas i tidigare studier som undersöker bio distributionen och tillgängligheten av antikroppsbaserade kontrastmedel för molekylär avbildningsmetoder för bröstcancer detektion. För det första, bio distributionen av en antikropp-nära infraröd Dye konjugat (anti-B7-H3 antikropp bunden till Near Infrared fluorescens Dye, indocyaningrönt Green, B7-H3-ICG) och isotypen kontroll agent (ISO-ICG) för fluorescens och Fotoakustisk molekylär Imaging utforskas18. Det här programmets metod beskrivs i protokollet. Därefter kvantifieras bio distributions resultaten av en överensstämningsmässigt känslig antikropp till netrin-1, som vanligtvis inte är detekterbar med traditionell om avbildning, som används med ultraljud molekylär avbildning, och presenteras i representativa resultat19. Vid avslutningen av detta protokoll papper, bör läsarna känna sig bekväma att anta IVIL-metoden för sina egna antikroppsbaserade forskningsapplikationer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:990px;" width="990">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animal Model</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td style="width:334px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J</td>
			<td style="width:196px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:166px;">002374</td>
			<td>Females, 4-6 weeks of age</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animal Handling Supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">27G Catheter</td>
			<td style="width:196px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:166px;">Please call to order</td>
			<td>Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Alcohol Wipes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">22-246073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Gauze Sponges (4&#34; x 4&#34; 16 Ply)</td>
			<td style="width:196px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:166px;">2913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Heat Lamp</td>
			<td style="width:196px;">Morganville Scientific</td>
			<td style="width:166px;">&#160;HL0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:196px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:166px;">29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">NC0490117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Surgical Tape</td>
			<td style="width:196px;">3M</td>
			<td style="width:166px;">1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue Collection</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Disposable Base Molds</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">22-363-556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Surgical London Forceps</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11080-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:166px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antibodies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A-11006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A-11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-594 goat anti-human IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A11014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human IgG Isotype Control</td>
			<td style="width:196px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:166px;">NBP1-97043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Humanized anti-netrin-1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Netris Pharma</td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td>contact@netrispharma.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td style="width:166px;">ab134161</td>
			<td>EPNCIR122 Clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rat anti-Mouse CD31</td>
			<td style="width:196px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:166px;">550274</td>
			<td>MEC 13.3 Clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Reagents</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Clear Nail Polish</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td>Any local drug store</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Indocyanine Green - NHS</td>
			<td style="width:196px;">Intrace Medical</td>
			<td style="width:166px;">ICG-NHS ester</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mounting Medium</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">TA-006-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">ICN19135680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Adhesion Glass Slides</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:166px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Desalting Columns</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">45-000-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Glass Cover Slips</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">12-544G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td style="width:196px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:166px;">22311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Slide Staining Tray</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:166px;">87000-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Software</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">FIJI</td>
			<td style="width:196px;">LOCI, UW-Madison.</td>
			<td style="width:166px;">Version 4.0</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo immunofluorescence localization for assessment of therapeutic and diagnostic antibody biodistribution in cancer research

Monoklonala antikroppar (mAbs) är viktiga verktyg för att upptäcka, diagnostisera och behandla cancer. De används för att riva upp den roll som proteiner i tumorigenes, kan riktas till cancer biomarkörer som möjliggör tumör detektion och karakterisering, och kan användas för cancerbehandling som mAbs eller antikropp-läkemedel konjugat för att aktivera immun effektorceller, att hämma signalvägar, eller direkt döda celler som bär det specifika antigenet. Trots kliniska framsteg i utvecklingen och produktionen av nya och mycket specifika mAbs, diagnostiska och terapeutiska tillämpningar kan försämras av komplexiteten och heterogenitet av tumören mikromiljö. Således, för utveckling av effektiva antikroppsbaserade terapier och diagnostik, det är viktigt att bedöma biodistribution och interaktion av antikropp-baserade konjugatet med levande tumör mikromiljö. Här beskriver vi in vivo Immunofluorescenslokalisering (IVIL) som en ny metod för att studera interaktioner mellan antikroppsbaserade Therapeutics och diagnostik i in vivo fysiologiska och patologiska tillstånd. I denna teknik injiceras en terapeutisk eller diagnostisk antigen-specifik antikropp intravenöst in vivo och lokaliserad ex vivo med en sekundär antikropp i isolerade tumörer. IVIL återspeglar därför in vivo biodistribution av antikroppsbaserade läkemedel och riktade medel. Två IVIL applikationer beskrivs bedömning av biodistribution och tillgänglighet av antikroppsbaserade kontrastmedel för molekylär avbildning av bröstcancer. Detta protokoll kommer att göra det möjligt för framtida användare att anpassa IVIL-metoden för sina egna antikroppsbaserade forskningstillämpningar.

Den IVIL metoden användes här för att undersöka in vivo biodistribution och vävnad interaktion av B7-H3-ICG och ISO-ICG, genom att låta agenterna, efter intravenös injektion i ett levande djur, att interagera med målvävnaden för 96 h, och sedan när vävnaderna är som primär antikroppar under ex vivo immunofärgning. Den IVIL metoden jämfördes också med standard ex vivo om färgning av vävnader för B7-H3 markör. Normala murina bröstkörtlar inte uttrycker B7-H3 markör,...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research at JoVE.com

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Metoden in vivo immunofluorescenslokalisering (IVIL) kan användas för att undersöka in vivo biodistribution av antikroppar och konjugat av antikroppar för onkologiska ändamål i levande organismer med hjälp av en kombination av in vivo tumör inriktning och ex vivo immunofärgning Metoder.

In vivo Immunofluorescenslokalisering för bedömning av terapeutisk och diagnostisk antikropps biodistribution i cancer forskning

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Detta protokoll för in vivo immunofluorescens lokalisering, eller IVIL, bedömer in vivo biodistribution av diagnostiska och terapeutiska antikroppar eller antikroppsbaserade medel för cancerforskning, detektion och behandling. I motsats till konventionella immunofluorescerande färgning där cellulära uttryck av antigener avslöjas ex vivo, klarläggas IVIL-metoden hur antikroppar och antikroppsbaserade medel distribuerar i det levande djuret. Denna video kommer att stöd förståelse för den övergripande arbetsflödet för IVIL-metoden.Det visar viktiga detaljer för framgångsrik reproduktion av protokollet för andra applikationer och antikroppar. Observera möss från önskad cancermodell för lämplig tumörtillväxt via palpation eller bromsoksmätning innan du fortsätter. Rena kanin anti-mus B7-H3 och kanin IgG isotyp kontroll antikroppar på en desalting kolumn för att avlägsna konserveringsmedel och buffertar lagring efter tillverkarens instruktioner.Alikvotdoser på 33 mikrogram av varje antikroppskonjugat i enskilda mikrocentrifugrör. Efter anesthetization som beskrivs i textprotokollet, förbereda sig för svansvenen inokulation av antikroppslösningarna. Desinficera djurets svans genom att torka tre gånger med en alkoholtorkning.Vidga svansvenerna genom att värma med en värmedyna i ungefär 30 sekunder. Undvik att värma upp hela djuret. Med hjälp av en 27-gauge svans ven kateter, sätt in fjärilsnålen i en av de två laterala svansvener.Visualisera blodbakflöde in i katetern för att säkerställa att nålen är korrekt placerad så att lösningarna kommer in helt i djuret kontra fångas i svansen. Använd en bit av kirurgisk tejp för att noggrant fixa svansen med den insatta nålen till scenen. Spola katetern med 25 mikroliter av sterilfosfatbuffrad koksaltlösning.Injicera sedan antikroppslösningen i katetern med hjälp av insulinsprutor. Spola katetern ännu en gång med 25 mikroliter sterila PBS. Ta bort nålen från svansen, och utöva påtryckningar för att stoppa eventuella blödningar.Utför human dödshjälp av musen som beskrivs i textprotokollet, och lägg musen i ryggläge. Använd kirurgiska saxar och tuppar till punktskatt tumör vävnader. Använd forceps för att förstå endast det yttre lagret av huden mellan uppsättningen av bröstkörtlar närmast svansen, och göra ett litet snitt med ett par kirurgiska saxar.Införa den slutna saxen i snittet, och långsamt öppna spetsen för att noggrant separera huden från den underliggande bukväggen membran, hålla den intakt. Gör ett vertikalt snitt upp buken, fortsätter att separera huden från det inre membranet. Mellan den tredje och fjärde bröstkörtlarna, gör en horisontell snitt över buken för att möjliggöra upprullning av huden och visualisering av bröstkörtlarna.Gripa tag i varje tumör eller normal körtel med tuten, försiktigt trimma bort den bifogade huden med hjälp av kirurgisk sax. Placera strukna vävnader i vävnad disponibel bas formar som är prelabeled och fylld med optimal skärtemperatur inbäddning medium. Frys snabbt in formar genom placering på torris.För att studera leverans utanför målet, punktskatt andra vävnader eller organ av intresse. Med hjälp av en kryostat, avsnitt fryst vävnad block på 10-mikron tjocklek, och placera intilliggande sektioner på prelabeled vidhäftning glas diabilder. Skölj frysta vävnadsglas med rumstemperatur PBS i fem minuter för att avlägsna inbäddningsmediet.Avgränsa vävnadssektioner med en hydrofoba barriärpenna för att minska volymen av lösningar som behövs under färgning. Fixera vävnadssektionerna med 4%paraformaldehydlösning i fem minuter. Efter sköljning av objektglasen i PBS i fem minuter, permeabilize vävnad sektioner med 0,5%Triton X-100 i PBS i 15 minuter.Skölj objektglasen igen i PBS i fem minuter. Blockera vävnaderna med PBS innehållande 3%vikt per volym bovint serumalbumin och 5%volym per volym get serum i en timme vid rumstemperatur. Efter sköljning av bilderna i PBS i fem minuter, inkubera sektionerna med journalföring primära antikroppar såsom en gemensam nukleär, vaskulär eller cytoplasmatisk markör.Här används rat anti-mouse CD31 vid en en-till-100-utspädning i blockeringslösningen. Diabilderna med primär antikropp lämnas över natten vid fyra grader Celsius, skyddade från uttorkning på en glidbricka. Efter inkubationen sköljer du objektglasen i PBS i fem minuter tre gånger.Byt PBS varje gång. Inkubera objektglasen med sekundära antikroppar för att märka de primära antikropparna. För denna ansökan, visualisera anti-B7-H3 antikropp med Alexa Fluor 546 konjugerad get anti-kanin antikropp, och visualisera CD31 med Alexa Fluor 488 get anti-råtta sekundär antikropp i blockerande lösning.Skydda objektglasen mot ljus och uttorkning på en glidbricka i en timme i rumstemperatur. Efter sköljning av objektglasen i PBS som tidigare, applicera en droppe av monteringsmediet i mitten av vävnadsskivan. Placera försiktigt en täckplatta, undvika entrapment av luftbubblor.Täta kanterna på täcket med klar nagellack, och låt torka. Fortsätt med konfokalmikroskopiavbildning och kvantitativ bildanalys enligt beskrivningen i textprotokollet. Representativa konfokala mikrografir visar jämförelsen av specifika B7-H3 antikropp-ICG konjugat och nonspecific isotype kontroll antikropp-ICG konjugat lokalisering i murine bröst körtlar som innehåller normala eller carcinoma vävnader.Normala murin bröstkörtlar från ett djur intravenöst injiceras med Iso-ICG eller B7-H3-ICG och motverkas med CD31 visar ingen färgning av antikroppen konjugat. Normala vävnader visade sig ha något uttryck för B7-H3 av standard ex vivo immunofluorescens färgning. I invasiva mammary tumörer, B7-H3-ICG starkt binder till vasculature, den första kontaktpunkten in vivo, och sedan är kunna extravasera från vasculature till heterogeneously fläck tumör epitel.Iso-ICG visar ospecifik ackumulering inom tumörvävnaderna. Standard ex vivo immunofluorescent färgning visar enhetlig uttryck för B7-H3 markören på epitelial och endotelceller. Representativa confocal micrographs visar in vivo immunofluorescens lokaliseringsmetoden att upptäcka netrin-1 uttryck eller isotype kontroll uttryck i murine carcinom och normala bröstkörtlar.In vivo immunofluorescens lokalisering bekräftar epitelial signal för netrin-1 i MMTV-PyMT tumörer men inte i normala bröstkörtlar. Vidare finns det en stark netrin-1 signal på endotelceller i brösttumörer, vilket indikeras av den colocalized gula signalen. Signalen är betydligt svagare i normala bröstkörtlar.IVIL-metoden kommer att behöva optimeras i termer av antikroppsdosering, uttagstiming av vävnader och sekundär antikroppsspädning för ett framgångsrikt genomförande. IVIL möjliggör målinriktning av konformationella epitoper som inte kan detekteras med hjälp av vanlig immunofluorescensfärgning, vilket kräver vävnadsbearbetning. Också, friska organ av tumörbärande möss kan samlas in för att bedöma off-target leverans av terapeutiska antikroppar.Med ökad användning av antikroppsbaserad terapi och kontrastmedel inom cancerforskning och cancerhantering är IVIL-metoden mycket tillämplig på läkemedelsforskning och läkemedelsutveckling. Forskare i cancerterapier, molekylär avbildning, inflammation, och andra områden kan finna att IVIL metoden ger användbar information.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal skiva Tumör Modell: Visualisering och kvantifiering av genuttryck och tumör invasiv använda genetiska mosaiker

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR bedömning av pH, pO2, Redox Status, och koncentrationer av fosfat och glutation i den tumör mikromiljö

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Bedömning av resistens mot tyrosinkinashämmare av ett förhör av cellsmedierade reaktioner av antikropp matriser

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Använda 22C 3 Anti-PD-L1 antikropp koncentreras biopsi och cytologi prover från icke-small Cell Lung cancerpatienter

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Inrättande av patienter med Ventrikelhärledd xenograft-modell och primära cellinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering och uppräkning av cirkulerande tumörceller från icke-småcellig Lung cancer patienter genom Immunofluorescensering

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analysera tumör och vävnad distribution av Target Antigen specifik terapeutisk antikropp

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Förbättrad livskraft för Ex vivo 3D Hydrogel Kulturer av patient-derived Xenografts i en Perfused mikrofluidisk plattform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescens imaging av DNA-skador och reparation foci i mänskliga kolon cancerceller

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...