Name: real-time, semi-automated fluorescent measurement of the airway surface liquid ph of primary human airway epithelial cells
Uploaded: 2019-06-13T15:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af to CF Trust Strategic Research Centre (SRC003 og SRC013) og et medicinsk Forskningsråd (MRC) tillid til Concept-tilskud (MC_PC_15030). JG blev støttet af et tilskud fra den medicinske forskningsfond (MRF-091-0001-RG-GARNE). MB blev støttet af en medicinsk Forskningsråd kliniker Fellowship (MR/M008797/1). IH blev støttet af en Wellcome Trust klinisk uddannelse stipendium (203520/Z/16/Z). Forskningen blev støttet af det nationale Institut for sundhedsforskning Newcastle Biomedical Research Centre baseret på Newcastle hospitals NHS Foundation Trust og Newcastle University. De synspunkter, der udtrykkes er dem af forfatteren (r) og ikke nødvendigvis dem af NHS, NIHR eller Department of Health. Primære celler fra Dr. Randell blev støttet af Cystic Fibrosis Foundation Grant (BOUCHE15R0) og NIH Grant (P30DK065988).

Primære ikke-CF (n = 3 donorer, alder 34, 27 og 23 år gammel) og CF (n = 3 donorer, alle F580del/F508del; alder 40, 41, ukendt) haecs var en slags gave fra Dr. Scott H. Randell (marsico Lung Institute, University of North Carolina på Chapel Hill, USA) og var Sion ned under protokol #03-1396 godkendt af University of North Carolina på Chapel Hill Biomedical institutions Review Board. Cellerne blev dyrket efter tidligere offentliggjorte metoder ved hjælp af vækst-og differentierings mediet beskrevet af fulcher og Randell35,36.
1. forberedelse af prøver
<ol><li>Grow primære haecs på 6,5 mm diameter semi-permeable understøtninger (tabel af materialer) på luft-flydende grænseflade i mindst 28 dage, som tidligere beskrevet35,36.</li>
	<li>Der tilberedes 50 ml steril opløsning af HCO3- holdige Krebs bufferopløsning (HCO3- KRB, koncentrationer i mm NaHCO3 (25) NaCl (115), KCl (5), CaCl2 (1), mgcl2 (1), D-glucose (5)) og filter-sterilisere ved hjælp af et 0,2 μm sprøjte filter.</li>
	<li>Ændre det basolaterale medium til det friske differentierings medium som beskrevet i 1,135,36. Bemærk: det er påvist, at den basolaterale glucosekoncentration påvirker ASL pH33. På dette stadium kan glucoseindholdet i det basolaterale rum styres ved at udskifte mediet med bufferopløsninger af kendte glukose koncentrationer.</li>
	<li>Cellernes apiske overflade vaskes ved tilsætning af 150 μl HCO3- KRB og inkube i 20 min ved 37 °c, 5% Co2.</li>
	<li>Fjern den apiske vask uden at forstyrre epitel ved at aspirere det forsigtigt ved hjælp af et sterilt glas Pasteur pipet og en steril P200 pipet spids knyttet til en Aspirations pumpe, der skaber et vakuum i opsamlings flasken. På dette stadium, bør der være så lidt væske tilbage på den apiske overflade som muligt for at genoprette luft-flydende grænseflade.</li>
	<li>Cellerne inkurueres i yderligere 30 min ved 37 °C, 5% CO2.</li>
</ol>2. baggrunds måling
<ol><li>Tænd for plade læseren og computeren.</li>
	<li>Åbn dashboardet.</li>
	<li>Klik på spark 10M, Åbn temperaturstyringen og sæt den til 37 °c. Åbn gasstyringen, og Indstil CO2 til 5%.</li>
	<li>Vent indtil temperatur og CO2 har nået deres mål.</li>
	<li>Åbn plade læserens skuffe, sæt fugt kassetten fyldt med 6 mL dH2O på hver side. Sørg for, at låget og bunden af pladen er rene – hvis ikke, Rengør med 70% ethanol på et stykke væv – og Anbring pladen i fugt kassetten. Bemærk: i hele eksperimentet holdes vævskultur plade låget på pladen og fjernes kun, når der tilsættes stoffer eller ændres det basolaterale medium, som udføres i en vævskultur laminar flow hætte for at holde kulturerne i et sterilt miljø.</li>
	<li>Åbn spark Method Editor, og Konfigurer parametrene på softwaren på følgende måde:<ol>
<li>Vælg den relevante plade skabelon (for 6,5 mm diameter semi-permeable understøtninger, Vælg den 24 brønd plade) og brøndene, der vil blive overvåget i løbet af dette eksperiment.</li>
		<li>Tilsæt en temperatur og CO2 Kontrolpanel og sæt dem til 37 °c og 5%, hhv. Markér afkrydsningsfeltet vent på temperatur/gaskasser .</li>
		<li>Tilføj et kinetisk sløjfe panel, og vælg varighed som loop-type, og Indstil den til 5-10 min. Vælg ikke defineret som interval type for at aktivere kontinuerlig aflæsning. Bemærk: timingen af kontinuerlig aflæsning afhænger af antallet af brønde/betingelser. 5 min er lang nok til 6-12 brønde, hvorimod en fuld plade indeholdende 24 betingelser vil kræve 10 min af kontinuerlige målinger.</li>
		<li>Inden for den kinetiske sløjfe, tilsættes to "fluorescens intensitet" paneler, ved hjælp af træk og slip-funktion, der vil blive oprettet for pH-følsom og pH ufølsom fluorescerende farvestoffer hhv. Indstil excitation og emission bølgelængder til henholdsvis 560 og 590 nm for henholdsvis pH-følsom farve og 495 og 520 nm for pH-følsom farve.</li>
		<li>Indstil antallet af blink til 30 og z-positionen til 33200 for hver fluorophore. Bemærk: indstillingerne for z-position og Gain afhænger af plade læserens karakteristika. Indstil Gain manuelt til en værdi, der vil give høj nok tæller, så forskelle mellem prøverne vil blive afhentet, men lav nok, således at tilføjelsen af en agonist ikke vil generere værdier ud af området for påvisning.</li>
		<li>Indstil multiple læse per brønd til brugerdefineret som en cirkel type af 3 × 3 størrelse med en ramme på 4750 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klik på Start knappen for at foretage en baggrunds måling og OK for at bekræfte låget på fugt kassetten er på plads.</li>
	<li>I slutningen af målingen, skal du åbne pladen læser skuffen, tage pladen ud og Pplace celllæn tilbage i inkubator under forberedelsen af fluorescerende farvestof mix opløsning.</li>
	<li>Opløsningen fremstilles af fluorescerende farvestof blanding ved tilsætning af 2 μl 1 mg/ml dextran-koblet pH-følsom (phsens) fluorescerende farvestof til 0,2 μl af 10 mg/ml dextran-koblet pH-ufølsom (phins) fluorescerende farvestof og 0,8 μl steril HCO3- KRB til en endelig volumen på 3 μL pr. tilstand. Bemærk: det totale rumfang af farve blandings opløsning skal forberedes til n brønde + 1, hvis der er mellem 1 og 10 prøver, eller n brønde + 2, hvis der er mellem 11 og 24 prøver. Dextran-koblede farvestoffer rekonstitueres i filtreret-steril HCO3- KRB-opløsning, aliciteres og opbevares ved-20 °c. Ethvert kemikalie kan tilsættes på dette stadium for en 16-24 h inkubationsperiode37 på den apiske overflade. Kemikalier skal fremstilles som 0,1 x, da den endelige volumen, efter absorption af den overskydende væske af kulturen, vil være omkring 0,3 μL for en 6,5 mm diameter semi-permeable støtte.</li>
	<li>Tilsæt forsigtigt 3 μL farvestof sammensætning (Se 2,8) til cellernes apiske overflade og inkube natten ved 37 °C, 5% CO2.</li>
</ol>3. kinetisk måling
<ol><li>Gentag trin 2,1 til 2,4 for at forberede plade læseren.</li>
	<li>Klik på ikonet Åbn og vælg den metode fil, der bruges til baggrunds målingerne</li>
	<li>I det kinetiske sløjfe panel skal du holde sløjfe typen som varighed og indstille den til 08 timer. Skift interval typen til fast, og Indstil den til 5 minutter. Hold fluorescens Intensitets paneler på samme som for baggrunds målingerne Bemærk: interval typen for baggrundsmålinger er indstillet til "ikke defineret" for at tillade kontinuerlig aflæsning. For kinetiske såvel som kalibrerings eksperimenter er intervaltypen indstillet til "fast" med et interval på 5 min. Dette kan justeres i henhold til eksperimentets design og antallet af betingelser.</li>
	<li>Åbn skuffen til plade læseren; sæt fugt kassetten fyldt med 6 mL dH2O på hver side. Sørg for, at låget og bunden af pladen er rene – hvis ikke, Rengør med 70% ethanol på et stykke væv – og Anbring pladen i fugtigheds kassetten med dens dæksel.</li>
	<li>Start fluorescens aflæsninger ved at klikke på Start. Klik på OK efter at have sikret, at låget på fugt kassetten er på plads.</li>
	<li>Efter n-cyklusser, normalt mellem til 12 og 24, hvilket svarer til 1 til 2 timer, skal du klikke på pause for at afbryde eksperimentet. Tag pladen ud og anvende alle lægemidler/agonister basolaterally til de forskellige prøver. Bemærk: når cellerne er taget ud af plade læseren, CO2 undslipper, og dette vil medføre en stigning i ASL pH som vist ved et fald i pH-følsom farve fluorescens. Denne CO2-induceret pH-ændring reverserer inden for 10-15 minutter efter at have placeret kulturerne tilbage i plade læseren.</li>
	<li>Sæt pladen tilbage i fugt kassetten på bakken, Placer fugt kassette låget, og klik på Fortsæt for yderligere at registrere ASL ph og overvåge virkningen af lægemidler/agonister på ASL ph.</li>
</ol>4. pH-kalibrering på stedet
<ol><li>Tag pladen ud af plade læseren.</li>
	<li>Aspirer det basolaterale medium/opløsningen.</li>
	<li>Der tilsættes 750 μL og 1 μL meget buffer baserede standardkurve opløsninger til det basolaterale rum og den apiske overflade. Bemærk: meget buffer baserede standardkurve opløsninger indeholder (i mM) NaCl (86), KCl (5), CaCl2 (1,2), mgcl2 (1,2), NAHEPES eller MES eller tris (100 mm). Brug MES til bufferopløsninger med en pH-værdi på under 7, NaHEPES til opløsninger af pH 7-7,5 og Tris til opløsning med pH 8. Fastgør pH-værdien til den ønskede værdi ved hjælp af HCl.</li>
	<li>Sluk for CO2 -pladen på plade læseren, eller sæt den til 0,1%, og Anbring pladen tilbage i fugt kassetten.</li>
	<li>Indstil plade læseren med de samme parametre som beskrevet tidligere, men uden CO2 som i trin 3,2.</li>
	<li>Start fluorescens aflæsninger, hver 5 min for 1-1.5 h.</li>
</ol>5. vurdering af virkningen af farvestof koncentration og affjedrings volumen på kalibreringsdata
<ol><li>Der forberedes tilstrækkelig pH-følsom og ufølsom farveblanding til at registrere fluorescens ved mindst 4 forskellige pH-værdier i 3 forskellige volumener. Bemærk: Bland 1 blev fremstillet med 26 μL pH-følsom (1 mg/mL) og 2,6 μL pH-infølsom (10 mg/mL) og bland 2 med 13 μL pH-følsom (1 mg/mL) og 1,3 μL pH-ufølsom (10 mg/mL).</li>
	<li>Fordel 2,2 μL eller 1,1 μL Bland 1 eller Bland 2 i 12 brønde af en 96 brønd plade og tilsæt nok kalibreringsopløsninger til at opnå den endelige mængde 50, 100 eller 200 μL og bland godt. Bemærk: i denne opsætning registreres der fluorescens tællinger for farve koncentrationer på 5 μg/mL (i 200 μL), 10 μg/mL (i 100 eller 200 μL), 20 μg/mL (i 50 eller 100 μL) eller 40 μg/mL (i 50 μL).</li>
	<li>Tænd for plade læseren, Indstil temperaturen til 37 °C, og sæt pladen i plade læseren. Tænd ikke for CO2 -controlleren. Bemærk: da dette er et kort eksperiment og kun kræver tilstrækkelig tid til at ækvilibrere temperaturen, er fugt kassetten ikke påkrævet.</li>
	<li>Juster z-positionen og Gain for 96 brønd pladen og brug de samme parametre som for eksperimentet udført på semi-permeable understøtninger.</li>
</ol>6. data analyse
<ol><li>Gem alle data i regneark, og Opret en ny fil.</li>
	<li>I baggrunds filen skal du vælge alle gennemsnitlige data for hver prøve/betingelse for begge bølgelængder, kopiere og indsætte til den nye fil. Beregn den gennemsnitlige baggrund for hver brønd og hver bølgelængde.</li>
	<li>Gentag dette med kalibrerings-og kinetiske data, og træk baggrunden fra hvert datapunkt for hver bølgelængde.</li>
	<li>For hvert tidspunkt og hver prøve beregnes forholdet mellem pH-følsom og pH-ufølsom fluorescens</li>
	<li>Hvis alle prøverne er udtaget fra en individuel donor, beregnes middelværdien af ratioen på hvert tidspunkt på kalibreringskurven Bemærk: det er vigtigt at generere så mange kalibreringskurver som donorer eller basolaterale opløsninger. Disse parametre kan faktisk påvirke baggrunds målingerne eller absorptionshastigheden af væsken, som igen vil påvirke farve koncentrationen og derfor den beregnede pH.</li>
	<li>For hvert tidspunkt skal du generere en standardkurve ud fra forholdet og afbilde de kendte pH-værdier på x-aksen og forholdet på y-aksen.</li>
	<li>Bestem det tidspunkt, hvor forholdet er stabilt, Tilpas en lineær regressionslinje, og få ligningen for denne linje.</li>
	<li>Ud fra de kinetiske data skal pH-værdien beregnes for hvert tidspunkt, og pH-værdien skal afbildes på y-aksen og klokkeslættet på x-aksen Bemærk: hvile/basal pH kan beregnes ved at gennemsnit datapunkter over den stabile måling af pH før tilsætning af en agonist eller enhver anden intervention. Virkningen af en agonist kan karakteriseres ved at beregne forskellen i pH før og efter (en vis mængde tid) behandlingen eller ved at montere en ikke-lineær kurve til datapunkterne umiddelbart efter interventionen. Dette vil give yderligere oplysninger om t1/2 og den maksimale værdi. Endelig kan forsuring eller alkalinisering også opnås fra hældningen af en lige linje monteret på de første punkter efter intervention.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+ion+transport.+Part+one.">Human airway ion transport. Part one.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 150 (1), 271-281 (1994).</li><li>Roomans, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+airway+surface+liquid+height+and+mucus+transport+by+fluorescence+microscopy,+and+of+ion+composition+by+X-ray+microanalysis.">Measurements of airway surface liquid height and mucus transport by fluorescence microscopy, and of ion composition by X-ray microanalysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 3, 135-139 (2004).</li><li>Haq, I. J., Gray, M. A., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+surface+liquid+homeostasis+in+cystic+fibrosis:+pathophysiology+and+therapeutic+targets.">Airway surface liquid homeostasis in cystic fibrosis: pathophysiology and therapeutic targets.</a> Thorax. 71 (3), 284-287 (2016).</li><li>Martin, S. L., Saint-Criq, V., Hwang, T. C., Csanady, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+as+targets+to+treat+cystic+fibrosis+lung+disease.">Ion channels as targets to treat cystic fibrosis lung disease.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2S), S22-S27 (2018).</li><li>Garland, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+pH-dependent+mucosal+dehydration+in+cystic+fibrosis+airways.">Molecular basis for pH-dependent mucosal dehydration in cystic fibrosis airways.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15973-15978 (2013).</li><li>Torres, I. M., Patankar, Y. R., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+exacerbates+in+vivo+IL-1-dependent+inflammatory+responses+and+neutrophil+recruitment+during+pulmonary+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Acidosis exacerbates in vivo IL-1-dependent inflammatory responses and neutrophil recruitment during pulmonary Pseudomonas aeruginosa infection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (2), L225-L235 (2018).</li><li>Berkebile, A. R., McCray, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+airway+surface+liquid+pH+on+host+defense+in+cystic+fibrosis.">Effects of airway surface liquid pH on host defense in cystic fibrosis.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 52, 124-129 (2014).</li><li>Tang, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+increases+airway+surface+liquid+viscosity+in+cystic+fibrosis.">Acidic pH increases airway surface liquid viscosity in cystic fibrosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 879-891 (2016).</li><li>Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+impaired+bicarbonate+secretion+and+mucoviscidosis.">Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis.</a> Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).</li><li>Hunt, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+airway+acidification.+Implications+for+asthma+pathophysiology.">Endogenous airway acidification. Implications for asthma pathophysiology.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161, 694-699 (2000).</li><li>Kostikas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+in+expired+breath+condensate+of+patients+with+inflammatory+airway+diseases.">pH in expired breath condensate of patients with inflammatory airway diseases.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 165 (10), 1364-1370 (2002).</li><li>Ojoo, J. C., Mulrennan, S. A., Kastelik, J. A., Morice, A. H., Redington, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+breath+condensate+pH+and+exhaled+nitric+oxide+in+allergic+asthma+and+in+cystic+fibrosis.">Exhaled breath condensate pH and exhaled nitric oxide in allergic asthma and in cystic fibrosis.</a> Thorax. 60 (1), 22-26 (2005).</li><li>Cho, D. Y., Hajighasemi, M., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+secretion+in+freshly+excised+sinonasal+mucosa+from+asthma+and+sinusitis+patients.">Proton secretion in freshly excised sinonasal mucosa from asthma and sinusitis patients.</a> American Journal of Rhinology &amp; Allergy. 23 (6), e10-e13 (2009).</li><li>Cho, D. Y., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+and+base+secretion+in+freshly+excised+nasal+tissue+from+cystic+fibrosis+patients+with+DeltaF508+mutation.">Acid and base secretion in freshly excised nasal tissue from cystic fibrosis patients with DeltaF508 mutation.</a> International Forum of Allergy &amp; Rhinology. 1 (2), 123-127 (2011).</li><li>Coakley, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+surface+liquid+pH+regulation+by+cultured+cystic+fibrosis+bronchial+epithelium.">Abnormal surface liquid pH regulation by cultured cystic fibrosis bronchial epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 16083-16088 (2003).</li><li>Pezzulo, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+airway+surface+pH+impairs+bacterial+killing+in+the+porcine+cystic+fibrosis+lung.">Reduced airway surface pH impairs bacterial killing in the porcine cystic fibrosis lung.</a> Nature. 487 (7405), 109-113 (2012).</li><li>Shah, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+acidification+initiates+host+defense+abnormalities+in+cystic+fibrosis+mice.">Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice.</a> Science. 351 (6272), 503-507 (2016).</li><li>Saint-Criq, V., Gray, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CFTR+in+epithelial+physiology.">Role of CFTR in epithelial physiology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (1), 93-115 (2017).</li><li>. ECFS Patient Registry Annual Data Report Available from: <a target="_blank" href="https://www.ecfs.eu/sites/default/files/general-content-images/working-groups/ecfs-patient-registry/ECFSPR_Report2016_06062018.pdf">https://www.ecfs.eu/sites/default/files/general-content-images/working-groups/ecfs-patient-registry/ECFSPR_Report2016_06062018.pdf</a> (2016)</li><li>. Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry Annual Data Report 2017 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cff.org/Research/Researcher-Resources/Patient-Registry/2017-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf">https://www.cff.org/Research/Researcher-Resources/Patient-Registry/2017-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf</a> (2017)</li><li>Abou Alaiwa, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonates+with+cystic+fibrosis+have+a+reduced+nasal+liquid+pH;+a+small+pilot+study.">Neonates with cystic fibrosis have a reduced nasal liquid pH; a small pilot study.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 13 (4), 373-377 (2014).</li><li>Abou Alaiwa, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ivacaftor-induced+sweat+chloride+reductions+correlate+with+increases+in+airway+surface+liquid+pH+in+cystic+fibrosis.">Ivacaftor-induced sweat chloride reductions correlate with increases in airway surface liquid pH in cystic fibrosis.</a> JCI Insight. 3 (15), (2018).</li><li>McShane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+surface+pH+in+subjects+with+cystic+fibrosis.">Airway surface pH in subjects with cystic fibrosis.</a> European Respiratory Journal. 21 (1), 37-42 (2003).</li><li>Schultz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+surface+liquid+pH+is+not+acidic+in+children+with+cystic+fibrosis.">Airway surface liquid pH is not acidic in children with cystic fibrosis.</a> Nature Communications. 8 (1), 1409 (2017).</li><li>Abou Alaiwa, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+tromethamine+as+inhaled+therapy+to+treat+CF+airway+disease.">Repurposing tromethamine as inhaled therapy to treat CF airway disease.</a> JCI Insight. 1 (8), (2016).</li><li>Ngamtrakulpanit, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Intrinsic+Airway+Acidification+in+Pulmonary+Tuberculosis.">Identification of Intrinsic Airway Acidification in Pulmonary Tuberculosis.</a> Global Journal of Health Science. 2 (1), 106-110 (2010).</li><li>Tate, S., MacGregor, G., Davis, M., Innes, J. A., Greening, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airways+in+cystic+fibrosis+are+acidified:+detection+by+exhaled+breath+condensate.">Airways in cystic fibrosis are acidified: detection by exhaled breath condensate.</a> Thorax. 57 (11), 926-929 (2002).</li><li>Jayaraman, S., Song, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+surface+liquid+pH+in+well-differentiated+airway+epithelial+cell+cultures+and+mouse+trachea.">Airway surface liquid pH in well-differentiated airway epithelial cell cultures and mouse trachea.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 281 (5), C1504-C1511 (2001).</li><li>Jayaraman, S., Song, Y., Vetrivel, L., Shankar, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+fluorescence+measurement+of+airway-surface+liquid+depth,+salt+concentration,+and+pH.">Noninvasive in vivo fluorescence measurement of airway-surface liquid depth, salt concentration, and pH.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (3), 317-324 (2001).</li><li>Lennox, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP12A+promotes+mucus+dysfunction+during+Type+2+airway+inflammation.">ATP12A promotes mucus dysfunction during Type 2 airway inflammation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2109 (2018).</li><li>Song, Y., Thiagarajah, J., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+and+chloride+concentrations,+pH,+and+depth+of+airway+surface+liquid+in+distal+airways.">Sodium and chloride concentrations, pH, and depth of airway surface liquid in distal airways.</a> The Journal of General Physiology. 122 (5), 511-519 (2003).</li><li>Thiagarajah, J. R., Song, Y., Haggie, P. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+CFTR+inhibitor+produces+cystic+fibrosis-like+submucosal+gland+fluid+secretions+in+normal+airways.">A small molecule CFTR inhibitor produces cystic fibrosis-like submucosal gland fluid secretions in normal airways.</a> FASEB Journal. 18 (7), 875-877 (2004).</li><li>Garnett, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycaemia+and+Pseudomonas+aeruginosa+acidify+cystic+fibrosis+airway+surface+liquid+by+elevating+epithelial+monocarboxylate+transporter+2+dependent+lactate-H(+)+secretion.">Hyperglycaemia and Pseudomonas aeruginosa acidify cystic fibrosis airway surface liquid by elevating epithelial monocarboxylate transporter 2 dependent lactate-H(+) secretion.</a> Scientific Reports. 6, 37955 (2016).</li><li>Gorrieri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goblet+Cell+Hyperplasia+Requires+High+Bicarbonate+Transport+To+Support+Mucin+Release.">Goblet Cell Hyperplasia Requires High Bicarbonate Transport To Support Mucin Release.</a> Scientific Reports. 6, 36016 (2016).</li><li>Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+epithelial+cell+models+for+cystic+fibrosis+research.">Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research.</a> Methods in Molecular Biology. 742, 285-310 (2011).</li><li>Fulcher, M. L., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+and+tracheo-bronchial+respiratory+epithelial+cell+culture.">Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. , 109-121 (2013).</li><li>Matsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+periciliary+liquid+layer+depletion,+not+abnormal+ion+composition,+in+the+pathogenesis+of+cystic+fibrosis+airways+disease.">Evidence for periciliary liquid layer depletion, not abnormal ion composition, in the pathogenesis of cystic fibrosis airways disease.</a> Cell. 95 (7), 1005-1015 (1998).</li><li>Ahmadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+profiling+of+CFTR+modulators+in+patient-derived+respiratory+epithelia.">Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia.</a> npj Genomic Medicine. 2, 12 (2017).</li><li>Delpiano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esomeprazole+Increases+Airway+Surface+Liquid+pH+in+Primary+Cystic+Fibrosis+Epithelial+Cells.">Esomeprazole Increases Airway Surface Liquid pH in Primary Cystic Fibrosis Epithelial Cells.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1462 (2018).</li><li>Gillies, R. J., Liu, Z., Bhujwalla, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=31P-MRS+measurements+of+extracellular+pH+of+tumors+using+3-aminopropylphosphonate.">31P-MRS measurements of extracellular pH of tumors using 3-aminopropylphosphonate.</a> American Journal of Physiology. 267 (1 Pt 1), C195-C203 (1994).</li><li>Tannock, I. F., Rotin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+pH+in+tumors+and+its+potential+for+therapeutic+exploitation.">Acid pH in tumors and its potential for therapeutic exploitation.</a> Cancer Research. 49 (16), 4373-4384 (1989).</li><li>Wike-Hooley, J. L., Haveman, J., Reinhold, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+tumour+pH+to+the+treatment+of+malignant+disease.">The relevance of tumour pH to the treatment of malignant disease.</a> Radiotherapy and Oncology. 2 (4), 343-366 (1984).</li></ol>

MB: ikke relateret til dette arbejde: forsker-ledede forskningsstipendier fra Pfizer og Roche Diagnostics; højttaler-gebyrer, der betales til Newcastle University fra Novartis, Roche Diagnostics og TEVA. Rejseudgifter til uddannelsesmøder fra Boehringer Ingelheim og vertex Pharmaceuticals.

Her giver vi en detaljeret protokol for den dynamiske måling af ASL pH i primære humane luftveje epitelceller. Kritiske trin omfatter vask af slim fra den apiske overflade af cellerne, måling og subtraktion af baggrunden ved hjælp af de samme parametre som i forsøget, optimering z-position og opnå og udføre en in situ pH kalibrering.
Det første trin i vask af cellerne er afgørende som et tykt lag Slim kan (i) forhindre, at farvestofferne når periciliary Layer (PCL) og (II) forsinke eller forhindre påvisning af ændringer i fluorescens som reaktion på agonister/hæmmere. Vores metode blev udviklet for at undersøge, hvordan primære haecs modulede aktiviteten af HCO3- og H+ transportører som reaktion på agonister. Selv om det vil være interessant at undersøge, hvordan ændringer i PCL pH relaterer til ændringer i SLIM pH, yderligere udvikling af denne protokol er nødvendig, herunder brugen af forskellige molekylvægt-dextrans til differentielt målrette de 2 lag og z-scanninger gennem hele ASL.
Baggrunds måling er et andet vigtigt skridt i denne protokol. Den apiske overflade af fuldt differentieret Primærluft vejs epitel er sjældent helt flad, hvilket vil påvirke lysets vej og dermed baggrunden. Sikring af, at baggrunds aflæsninger udføres i de samme lokale punkter af brøndene som under forsøget er afgørende for reproducerbarhed og stabilitet af optagelserne.
Optimering af z-position og gevinst er nødvendige skridt, der skal sættes op for hver forskellige koncentration af fluorescerende farvestof, der vil blive anvendt. Dette vil forhindre høj Inter-eksperiment variation. Når det er oprettet, giver vores analyse stabile og reproducerbare resultater. En af grundene til dette er, at farvestofferne tilsættes på den apiske overflade på cellerne i en lille mængde væske, der let reabsorberes af epitel, og som efterlader en homogen mærket ASL. En anden metode til at plette ASL, der kan være lige så vellykket, brugt tørt pulver eller en "suspension" i PFC. selv om dette kan være tidsbesparende (da forsøgene normalt udføres inden for 2 timer), er det usandsynligt, at de tørre farvestoffer fuldt opløst i ASL og dermed kan formular klumper. Der findes således forskellige koncentrationer af pH-følsom farve på overfladen af epitel cellerne.
In situ-pH-kalibreringen er et vigtigt skridt for at opnå nøjagtige, reproducerbare resultater. Som vist og forklaret i resultatafsnittet vil forskelle i ASL-volumener påvirke fluorescens tællinger og dermed de interpolerede pH-værdier (figur 2 og figur 3). Mens forskellige grupper tidligere har offentliggjort ASL pH-målinger, er der opnået en lang række værdier, selv mellem forskellige undersøgelser offentliggjort af samme gruppe8,17. Vi mener, at resultaterne vil blive mere reproducerbare ved at udføre in situ-kalibreringer. Sammenlignet med andre pH-kalibrerings teknikker, som anvender den høje K+/nigericin (eller flere ionophores) metode til at generere standardkurven28,29,30, den analyse, der præsenteres her har den fordel, at , så længe hvert trin udføres i et sikkerhedskabinet, kan de celler, der anvendes til ASL pH, vaskes, opbevares og genbruges til andre forsøg, forudsat at de udførte behandlinger ikke uigenkaldeligt påvirker epitel cellerne.
Udviklingen og optimeringen af denne analyse har givet reproducerbare resultater, og vi mener, at denne metode vil hjælpe andre grupper med deres ASL pH-måling. Men denne teknik har også nogle begrænsninger som følge af opsætning og den type celler, der bruges. Overvågning af ASL pH over en længere periode end den, der præsenteres her (> 8-10 h) kan vise sig vanskelig, da et langsigtet højt fugtigheds miljø kan beskadige udstyret, og det faktum, at de fleste plade læsere kun giver mulighed for at registrere kinetiske aflæsninger over en Vis tid (typisk 24 timer). Anvendelse af fuldt differentierede primære haecs er afgørende i den måde, at forskellige faser af differentiering vil påvirke udtrykket af HCO3- og H+ transportører. Der er imidlertid stort set ingen mulighed for at kontrollere mængden af ASL præcist i celler, der dyrkes under tynde film. Som anført i protokollen og resultater sektioner, ændringer i volumen vil påvirke fluorescens ratio og det er desværre nødvendigt at antage, at i celler dyrket fra en enkelt person, seedede på samme dag på forskellige semi-permeable støtte, ASL mængder vil være den samme. Som følge af denne begrænsning vil enhver agonist eller hæmmer, der vil påvirke væske sekretionen eller absorptionen, påvirke ASL-volumenet og formodentlig fluorescens ratioer. Men i vores analyse udføres kalibreringskurven ved forsøgets afslutning, så vi kan antage, at disse ændringer i volumen vil påvirke kalibrerings forholdene på samme måde som under det kinetiske eksperiment. Af denne grund rådgiver vi grupper, der ville være interesseret i at udvikle denne analyse, at bruge mindst 2-3 replikater pr. betingelse testet, da dette vil give mulighed for etablering af en standardkurve for hver betingelse.
Her præsenterer vi en enkel, semi-automatiseret, assay, der tillader real-time måling af slimhinde overflade pH under tynde film betingelser. Det har kapacitet til at undersøge dynamiske pH-reaktioner i mange kulturer i en nær-samtidig måde, der giver mulighed for Inter-og intra-donor sammenligninger. Opskalering denne metode til en 96 brønd plade format ved hjælp af polariseret system (HTS 96 brønd plader)38 ville give endnu højere gennemløb som en Drug Discovery assay. Desuden har vi vist, hvordan denne teknik kan bruges til at studere den akutte virkning af agonister på ASL pH, og vi har allerede offentliggjort, at denne metode kan bruges til at studere den langsigtede virkning af en apikale protonpumpehæmmer på CF haecs ASL39. Som pH har vist sig at regulere infektion, betændelse, Slim viskositet og ion transport, identificere molekylære mål, der kan øge pH vil være værdifulde i forskningsområder af kroniske lungesygdomme og denne teknik vil potentielt lette udvikling af lægemiddel screening i personaliseret medicin tilgange. Endelig, da dysregulering i syre-base homøostase spiller en stor rolle i andre sygdomme, denne protokol kan tilpasses, med optimering trin, til forskellige udstyr (plade læsere) og celletyper, såsom andre epitelceller. Ekstracellulær surhedsgrad er karakteristisk for kræft40,41,42 og denne analyse kan hjælpe med at bestemme, hvordan solide tumorer producerer lav phe eller kan bruges som en lav-gennemløb Drug screening assay for genoprettelse af pH-homøostase. Tilsvarende, som for kroniske luftvejssygdomme, det kunne også give en platform for udvikling af en personlig medicin tilgang.

Luftvejene epitel er dækket af et tyndt (~ 10 μm) væske lag kaldet luftvejene overflade væske (ASL). Den sammensætning og dybde (hydrering) af denne ASL er stramt reguleret og kontrollerer effektiviteten af luftvejene clearance af mucociliær rulletrappe1,2,3,4. I de seneste år er betydningen af ASL H+/HCO3- indhold blevet demonstreret af forskellige grupper på grund af dens evne til at regulere ASL hydrering5, luftvejs betændelse6 og infektion7, 8 samt Slim viskositet8,9. Vigtigere er det, at selv om der findes nogle kontroverser, mange undersøgelser har rapporteret dysregulering af luftvejene pH i kroniske luftvejssygdomme som astma10,11,12, KOL11, bronkiectasis11, kronisk rhinosinuitis13,14 og cystisk fibrose (CF)5,9,15,16,17, som tyder på, at behandlinger, der genopretter ASL pH kunne være nyttigt at behandle flere typer af kroniske luftvejssygdomme. CF er den mest almindelige autosomale recessiv genetiske sygdom i kaukasiske populationer og skyldes mutationer i CF transmembran konduktans regulator (CFTR) gen. Dette gen koder en anion (HCO3- og CL-) kanal, der spiller en afgørende rolle i ion og flydende transport og homøostase på tværs af epitel18. Selv om CF er en multi-organ sygdom, lunge patologi er den vigtigste årsag til sygelighed og dødelighed19,20 og i betragtning af den primære defekt i CF er en nedsat transport af CL- og HCO3-, man kan hypotese, at ekstracellulærvæske pH hos mennesker med CF vil blive dysreguleret sammenlignet med personer, der ikke har CF. målingen af ASL pH har således været et aktuelt område inden for forskning i CF, og forskellige grupper har udviklet teknikker til at måle ASL pH i CF Airways.
In vivo, luftvejs pH er blevet målt ved hjælp af forskellige teknikker, fra mikro-sonder (fiber-optiske, guld eller mobidium prober)5,21,22,23,24 til pH målinger af eller udåndings ånde kondensat (EBC)10,11,12,25,26,27. På forskningsområdet for CF, pH er ved at blive udbredt undersøgt på grund af dens potentielle kliniske konsekvenser. Teoretisk, at gøre luftvejene mere alkalisk kunne øge bakteriel drab og forbedre mucociliær clearance og luftvejs homøostase som helhed. In vivo/ex vivo-undersøgelser rapporterer imidlertid en lang række pH-værdier, og til dato er resultaterne ikke entydige med hensyn til eksistensen af en forskel i pH-værdi mellem ikke-CF-og CF-Airways. I begyndelsen af 2000 ' erne rapporterede forskellige grupper pH i EBC. I ikke-syge grupper varierede pH-værdierne fra 4,6 til 8,5, men det var interessant, at EBC pH blev fundet mere surt under eksacerbationer hos personer med CF12,27. For nylig har in vivo målinger af ASL i humane og animalske modeller af CF rapporteret modstridende resultater16,17,21,22,23, 24 og det er stadig uklart, om CF Airways er mere sure end ikke-CF Airways.
Da in vivo måling af den nedre ASL pH har vist sig vanskelig på grund af den meget lille mængde væske foring luftvejene og potentiel tilstedeværelse af slim propper i sygdom, mange grupper har henvendt sig til in vitro eksperimenter til at måle ASL pH, hovedsagelig ved hjælp af tre forskellige Metoder. Den første metode anvender dextran-koblet celle-uigennemtrængelig pH-følsom fluorescerende farvestoffer, der tilsættes som et tørt pulver, enten direkte til ASL eller ved hjælp af en inaktiv væske kaldet perfluchlorcarbon (PFC)5,8,16 , 17 ud af , 28 stk. , 29 ud af , 30 stk. , 31 stk. , 32. denne teknik giver imidlertid ikke megen kontrol over den nøjagtige mængde farvestof, der tilsættes til kulturerne, og udgør en risiko for farvestof aggregater og store forskelle i koncentrationen mellem prøver og/eller eksperimenter og selv inden for samme prøve . Det er også generelt blevet udført med et confokal mikroskop, som begrænser dets anvendelighed og i mange tilfælde forhindrer detaljeret overvågning af flere prøver og ændringer i optagelsesforholdene. Den anden metode, der anvendes til at måle ASL pH, er brugen af ph-følsomme mikroelektroder5,15. ASL pH-målinger er derfor ikke afhængige af fluorescerende farvestof koncentration og bør give mere robuste og reproducerbare resultater. Denne metode giver dog ikke mulighed for dynamiske realtidsmålinger af ASL pH, og det er heller ikke let at foretage flere aflæsninger under forskellige forhold. Det er også en arbejdsintensiv, kompleks, proces, der kræver specialudstyr (mikroelektrode fabrikation/elektrofysiologiske optagelses anordninger) og uddannelse til indsamling af prøverne til efterfølgende pH-måling og kalibrering. Desuden har disse to teknikker også vist nogle uoverensstemmelser i evnen til at producere reproducerbare resultater: ved hjælp af den pH-følsomme fluorescerende farvestof metode, tang et al. rapporterede værdier på 7,35 for non-CF ASL og 7,0 for CF ASL8 , mens seneste papir fra samme gruppe, var ASL pH 6,9 og 6,4 for ikke-CF og CF, henholdsvis17. På samme måde gav mikroelektrode målinger værdier på 6,4 i non-CF ASL og 6,1 i CF ASL i en undersøgelse fra 200315 , hvorimod samme gruppe rapporterede værdier på 6,7 for ikke-CF asl og 6,45 for CF ASL i en undersøgelse fra 20135. Endelig, i den tredje metode, tilføjer forskerne en forholdsvis stor mængde af svagt bufferopløsning på den apikale (slimhinde) overflade af kulturerne, således at ødelægge tynde film betingelser og ændre ASL sammensætning, og potentielt dens regulering. pH måles derefter enten ved hjælp af ph-følsomme fluorescerende farvestoffer33, ved en pH-stat titrerings metode i et Ussing kammer13,14eller kræver, at den fortyndede ASL fjernes fra kulturerne og ph måles ved hjælp af en pH-værdi elektrode, analysator eller lakmus strimler34. Et andet problem i den nøjagtige måling af ASL pH er etableringen af en standardkurve, der er så præcis som muligt. Uanset om målingerne udføres med en elektrode, der måler forskellen i elektrisk potentiale via en harpiks eller anvender pH-følsomme fluorescerende farvestoffer, vil begge disse tilgange blive påvirket af det lokale mikromiljø af de prøver, der Målt. Mere specifikt kan dissociations konstanten (KD) af farvestofferne variere betydeligt afhængigt af temperatur, ionisk styrke, viskositet samt potentielle interaktioner af farvestoffet med cellulære bestanddele såsom proteiner og potentielt slim.
For at forsøge at overvinde mange af disse tekniske spørgsmål, samt at udvikle en mere dynamisk, enklere og højere gennemløb metode, har vi etableret en in vitro-teknik, der registrerer ASL pH i primære hAEC kulturer ved hjælp af en celle-uigennemtrængelig pH-følsom fluorescerende farvestof i en almindelig kommerciel plade læser. Metoden genererer reproducerbare, dynamiske, semi-automatiserede, real-time målinger af ASL pH af fuldt differentierede 3D cellekulturer under tynde film betingelser. Ved hjælp af en multiple-brønd plade læser, kan denne semi-automatiseret assay foretage nær samtidige målinger af pH for op til 24 betingelser over 12 h og kan overvåge virkningen af at tilføje forskellige agonister eller hæmmere. I dette dokument beskriver vi metoden i detaljer og rapporterer repræsentative resultater under positive og negative kontrolbetingelser, der validerer teknikken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E4780-1226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.5 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFTRInh172</td>
			<td>RnD Systems (Tocris)</td>
			<td>3430</td>
			<td>Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D22910</td>
			<td>Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P10361</td>
			<td>Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>RnD Systems (Tocris)</td>
			<td>1099</td>
			<td>Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity cassette</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>30090495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader: TECAN SPARK 10M</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>30086375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal pH electrodes DJ 113</td>
			<td>VWR</td>
			<td>662-1385</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time, semi-automated fluorescent measurement of the airway surface liquid ph of primary human airway epithelial cells

I de seneste år, betydningen af slimhinde overflade pH i luftvejene er blevet fremhævet ved sin evne til at regulere luftvejene overflade væske (ASL) hydrering, Slim viskositet og aktivitet af antimikrobielle peptider, nøgleparametre involveret i medfødte forsvar af Lungerne. Dette er af primær betydning i forbindelse med kroniske luftvejssygdomme såsom cystisk fibrose (CF), hvor disse parametre er dysregulerede. Mens forskellige grupper har studeret ASL pH både in vivo og in vitro, deres metoder rapporterer en relativt bred vifte af ASL pH værdier og selv modstridende resultater vedrørende eventuelle pH forskelle mellem ikke-CF og CF-celler. Desuden giver deres protokoller ikke altid nok detaljer for at sikre reproducerbarhed, de fleste er lav gennemløb og kræver dyrt udstyr eller specialiseret viden til at gennemføre, hvilket gør dem vanskelige at etablere i de fleste laboratorier. Her beskriver vi en semi-automatiseret fluorescerende plade læser assay, der gør det muligt for real-time måling af ASL pH under tynde film betingelser, der nærmere ligner in vivo situation. Denne teknik giver mulighed for stabile målinger i mange timer fra flere luftveje kulturer samtidig og, vigtigt, dynamiske ændringer i ASL pH som reaktion på agonister og hæmmere kan overvåges. For at opnå dette, er ASL af fuldt differentieret primære humane luftvejs epitelceller (hAECs) farvet natten over med en pH-følsom farve for at give mulighed for reabsorption af den overskydende væske for at sikre tynde film betingelser. Når Fluorescens er overvåget ved tilstedeværelse eller fravær af agonister, udføres pH-kalibrering på stedet for at korrigere for volumen-og farve koncentrationen. Den beskrevne metode giver de nødvendige kontroller til at lave stabile og reproducerbare ASL pH målinger, som i sidste ende kunne bruges som en Drug Discovery platform for personlig medicin, samt tilpasset til andre epitelial væv og eksperimentel inflammatoriske og/eller Host-pathogen modeller.

Den teknik, der er beskrevet ovenfor, muliggør dynamisk måling af ASL pH i op til 24 separate primære hAECs-kulturer. Figur 1 viser en skematisk over de vigtigste trin og udstyr, der er oprettet. De overnight-indlæste celler anbringes i en CO2 -og temperaturkontrolleret plade læser, hvor fluorescens fra dextran-koblede pH-følsomme og ph-følsomme farvestoffer registreres hver 5 min.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig1.jpg"> Figur 1: skematisk af ASL pH-målemetoden. Efter vask af kulturerne og udførelse af en baggrunds aflæsning, primære humane luftvejs epitelceller (hAECs) ASL er lastet med dextran koblet pH-følsom og pH-insensitive farvestof blanding natten ved 37 °C, 5% CO2. Den følgende dag overføres pladen til en temperatur, og CO2-kontrolleret plade læser og fluorescens fra begge farvestoffer registreres over tid. Efter forsøget udføres en in situ-kalibrering, og data analyseres og præsenteres som ASL pH over tid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
For det første undersøgte vi effekten af forskellige volumener og farve koncentrationer på fluorescens tællinger og dermed på 560/495 ratio. Formålet med at tilføje pH-følsomheden til det pH-følsomme farvestof er faktisk at korrigere for variabiliteten i ASL-lastning. Men, det var vigtigt at teste denne antagelse og vurdere, om vi kunne bruge en standard kalibrering kurve udføres i fravær af celler i en 96 brønd plade for alle eksperimenter og celletyper. Vi overvågede fluorescens tællinger over 1 time i 50, 100 eller 200 μl kalibreringsopløsninger (ved pH 5,5, 6,5, 7 eller 8) indeholdende 5, 10, 20 eller 40 μg/mL farvestoffer. Resultaterne er præsenteret i figur 2a-C, og viser, at for samme pH og den samme koncentration af farvestoffer, de rapporterede phsens/phins emissions ratio (560/495 på y-aksen) varierede afhængigt af volumen (figur 2a). Desuden giver forskellige farve koncentrationer ved samme pH og samme volumen forskellige værdier for forholdet (figur 2b). Ændringer i volumen-eller farve koncentrationen vil derfor påvirke den absolutte værdi af pH beregnet ud fra emissionsforholdet. Figur 2c viser, at den tid, der kræves til temperaturligevægt, er ca. 15-20 min. For at bekræfte effekten af farvestof koncentration og volumen på emissionskvoter, indspillede vi fluorescens fra farvestoffer lastet i ASL af primære ikke-CF og CF hAECs in situ. Vi udførte derefter kalibreringen og analyserede resultaterne ved (1) at generere en global standardkurve fra alle prøverne eller (2) generere to uafhængige standard kurver for hver celletype (ikke-CF og CF). ASL pH fra begge celletyper blev derefter plottet mod tiden (figur 3a, B) og gennemsnit (figur 3c). ASL pH-værdier opnået fra en enkelt global standardkurve viste en signifikant forskel mellem ikke-CF-og CF-kulturer (figur 3a, C) der henviser til, at ASL pH ikke var signifikant forskellig mellem CF og non-CF haecs, når pH blev beregnet ud fra uafhængige standard kurver (figur 3b, C). Disse resultater viser, hvor vigtigt det er at generere uafhængige kalibreringskurver for hvert eksperiment og inden for eksperimentet for hver donor prøve, da kalibreringskurverne blev gennemsnitligt højere, og der blev fundet større værdier for pHsens/pHins ratio i CF-kulturerne , hvilket indikerer en mere sur pH-værdi (figur 3c).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig2v4.jpg"> Figur 2: optimering af ph-kalibreringen in vitro. Forskellige mængder opløsninger af kendt pH og indeholdende forskellige farve koncentrationer blev lastet på en 96 brønd plade, og fluorescens blev registreret over 1 time. effekt af volumen (a) og farve koncentration (B) på fluorescens ratioer. Nøgletal blev afbildet mod pH for tidspunkt 24 min. (C) ændringen i fluorescens hældning blev beregnet for hver opløsning og afbildet som en funktion af tiden (i min). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig3.jpg"> Figur 3: optimering af analysen af ph-kalibreringen på primære hAECs in situ. A) repræsentative spor af ASL pH opnået fra en enkelt standardkurve med gennemsnitsdata fra ikke-CF-og CF-kulturer. B) repræsentative spor af ASL pH opnået ved en uafhængig standardkurve udført på ikke-CF-eller CF-kulturer. Hvert datasæt blev beregnet ud fra sin egen kalibreringskurve. C) vurdering af forskellene i ASL-pH mellem ikke-CF-og CF-kulturer som en funktion af, hvordan kalibreringen blev udført. Data repræsenterer middelværdien ± SEM fra n = 3 eksperimenter, 2-vejs ANOVA, Sidaks multiple sammenligningstest). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
For yderligere at validere vores teknik krævede vi derefter en positiv kontrol for at påvise, at teknikken var i stand til at påvise en» forventet «ændring i ASL pH. Da tilstedeværelsen af en mere sur ASL i CF-celler er stadig kontroversiel, vi brugte Camp agonist forskolin, som en positiv kontroltilstand, at stimulere HCO3- sekretion gennem CFTR. Forventede resultater ville vise en forskolin-induceret alkalinisering af ASL i ikke-CF-celler, der ville være stort set faldt eller afskaffes i CF-celler, afhængigt af sværhedsgraden af mutationer. Figur 4a viser repræsentative spor af ASL pH af ikke-CF-og CF-celler over tid, og figur 4b viser de gennemsnitlige data for ASL pH før og efter behandling med forskolin i begge celletyper. Vi kan få forskellige oplysninger fra disse resultater. For det første, som det allerede fremgår af figur 3b, C, var den hvilende ASL pH ikke forskellig mellem ikke-CF og CF epithelia. For det andet, den første 3-4 tid-point efter pause eksperimentet til behandling af cellerne med forskolin, viste en stor stigning i pH, der inddrives inden for ~ 15 min. Dette skyldtes faldet i CO2 -koncentrationen mellem plade læseren (5%) og vævs kulturens sikkerhedskabinet (~ 0%). Ifølge Henderson Hasselbalch ligning, en pH-værdi på 7 i en 5% Co2 miljø svarer til en koncentration af HCO3- af ~ 9,3 mm. Når cellerne fjernes fra plade læseren, vil et fald i CO2 -koncentrationen til 0% teoretisk føre til en stigning i pH-værdien på > 8. Figur 4a viser, at ASL pH steg til ~ 7,8, hvilket kan forklares ved det tidspunkt, hvor man omplacerer pladen i plade læseren (dvs. i et 5% Co2 -miljø). Endelig, som forudset, tilsætning af basolaterale 10 μM forskolin (FSK) signifikant øget ASL pH i ikke-CF kulturer kun. Som det er blevet påvist af forskellige grupper, at der findes en forskel i Steady-State ASL pH mellem CF og non-CF epithelia, vi ønskede at yderligere at undersøge den tilsyneladende fravær af en pH-forskel i vores eksperimenter og rolle CFTR. For at gøre dette har vi præ-inkuerede ikke-CF-kulturer med den specifikke CFTR-hæmmer, CFTRinh172 (172). Som anført i protokol afsnit 2,8, blev farveblandingen fremstillet som anført ovenfor, og inhibitoren blev tilsat i en koncentration på 0,1 X = 2 μM. Ifølge litteraturen er ASL højden af ikke-CF-celler ca. 10 μm. I en semi-permeabel støtte på 6,5 mm diameter, er den teoretiske volumen af ASL derfor π × 3,252 = 0,3 μl. Ved tilsætning af 3 μL farvestof + 172 ved 2 μM vil koncentrationen af inhibitoren efter absorption af den overskydende væske teoretisk set være 20 μM (1x, ønsket koncentration). Repræsentative spor i figur 4c og den gennemsnitlige sammenfatning i figur 4d viser, at 172 ikke reducerer den hvile lige ASL pH, men forhindrede forskolin-induceret stigning i ASL pH, hvilket bekræfter vores resultater opnået fra ikke-CF versus CF og yderligere validering af vores teknik.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig4v5.jpg"> Figur 4: dynamisk ASL pH måling som reaktion på CFTR aktivering af forskolin. A) repræsentative spor af virkningen af forskolin (FSK, 10 μM) på ASL pH-kinetik over tid i ikke-CF og CF haecs. Data repræsenterer middelværdien ± SEM fra n = 3 eksperimenter. B) sammenfatning af virkningen af FSK på ASL pH i ikke-CF-og CF-kulturer. Data repræsenterer middelværdien ± SD fra n = 69 ikke-CF-kulturer og 35 CF-kulturer (2-vejs ANOVA, Sidaks multiple sammenligningstest). C) repræsentative spor af virkningen af CFTRinh172 (172, 20 ΜM) på FSK-induceret stigning i ASL pH i ikke-CF haecs. Data repræsenterer middelværdien ± SEM fra n = 5 eksperimenter. D) sammenfatning af virkningen af 172 på FSK-induceret alkalinisering af ASL i ikke-CF-kulturer. Data repræsenterer middelværdien ± SEM fra n = 5 eksperimenter (2-vejs ANOVA, Sidaks multiple sammenligningstest). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Endelig, som anført i protokollen afsnit 6,8, kan satserne for forsuring/alkalinisering beregnes ved at montere en lineær regression til de første tidspunkter efter interventionen. Figur 5a viser, at fjernelse af den basolaterale HCO3- holdige opløsning (HCO3- KRB) og udskiftning af den med en Hepes bufferopløsning, i fravær af co2, forårsagede en markant forsuring af ASL. Dette er i overensstemmelse med manglen på HCO3- hæmmende transepithelial HCO3- sekretion, som tillader konstitutiv proton sekretion af disse luftveje celler til støt reducere ASL pH15, 17. Interessant nok var den oprindelige forsuring af ikke-CF-celler signifikant langsommere end CF-kulturerne (figur 5b).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig5.jpg"> Figur 5: dynamiske ændringer i ASL pH som reaktion på HCO3- fjernelse. A) repræsentative spor,derviser virkningen af HCO3- fjernelse på ASL pH-kinetik over tid i ikke-CF og CF haecs. De oprindelige forsurings rater blev opnået via skråningen af en lige linje monteret til 7 tidspunkter efter HCO3- fjernelse. Data repræsenterer midlerne ± SEM fra n = 6 og 7 eksperimenter på henholdsvis ikke-CF og CF kulturer. B) sammenfatning af Initial satsen for forsuring efter HCO3- fjernelse. Data repræsenterer midlerne ± SEM fra n = 6 og 7 eksperimenter på henholdsvis ikke-CF og CF kulturer (Mann-Whitney test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells at JoVE.com

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-automatiseret fluorescerende måling af luftvejene overflade flydende pH af primære Human luftvejs epitelial celler

Vi præsenterer en protokol til at foretage dynamiske målinger af luftvejene flydende pH under tynde film betingelser ved hjælp af en plade-læser.

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Vores protokol er den første, der tillader dynamisk måling af luftvejsoverflade væske, eller ASL pH, i realtid under både hvile og efter agonist eller inhibitor behandling. Denne metode hjælper med at identificere ionkanaler og transportører, der er involveret i ekstracellulær pH-regulering, og kan anvendes på andre cellesystemer, hvor dette er vigtigt, såsom kræft. Nu i forhold til tidligere offentliggjorte metoder, denne nye teknik er relativt enkel at udføre.Det kræver ikke specialiseret udstyr. Og kan gøre ASL pH-målinger samtidigt i flere kulturer under luft væske interface, eller tynd film betingelser. Vigtigere er det, denne nye teknik har potentiale til at vurdere virkningerne af nye terapeutiske, ikke kun for cystisk fibrose, men også for andre kroniske luftvejssygdomme, såsom astma og KOL.Efter mindst 28 dages kultur vaskes den apikale overflade af en human luftvejsepitelcellekultur med 150 mikroliter bikarbonat, der indeholder Krebs-bufferopløsning i 20 minutter på cellekulturinkubatoren. Ved slutningen af inkubationen skal du bruge et sterilt glasrør med en steril P200 pipetspids forbundet med en aspirationspumpe for omhyggeligt at aspirere vasken uden at forstyrre epitelet. Der skal være så lidt væske tilbage på den apikale overflade som muligt for at genoprette luftvæskegrænsefladen.Vend derefter cellerne tilbage til cellekulturskuvøsen i 30 minutter. Hvis du vil udføre en baggrundsmåling, skal du aktivere pladelæseren og computeren. Når du har åbnet instrumentbrættet, skal du klikke på Spark 10M og indstille temperaturreguleringen til 37 grader Celsius.Åbn derefter gasstyringen, og sæt kuldioxiden til 5%Når temperaturen og gassen har nået deres mål, skal du åbne pladelæserskuffen og indsætte en fugtighedskassette fyldt med seks milliliter destilleret vand på hver side ind i læseren. Kontroller, at låget og bunden af cellekulturpladen er rene, og an placer pladen på fugtighedskassetten, tag låget på igen, og luk skuffen. Åbn spark-metoden editoren, vælg den relevante pladeskabelon, og vælg de brønde, der skal overvåges under eksperimentet.Tilføj en temperatur og kuldioxid kontrolpanel og indstille panelerne til 37 grader Celsius og 5%hhv. Derefter kryds vent for temperatur / gas kasser. Tilføj et kinetisk løkkepanel, og vælg varigheden som løkketype.Angiv varigheden til fem minutter, og angiv eksperimentets intervaltype til ikke-defineret for at opnå en kontinuerlig aflæsning. Inden for den kinetiske løkke skal du bruge træk- og slipfunktionen til at tilføje to fluorescensintensitetspaneler, der indstilles individuelt for de pH-følsomme og pH-ufølsomme fluorescerende farvestoffer. Indstil excitations- og emissionsbølgelængden til henholdsvis 560 og 590 nanometer for det pH-følsomme farvestof.Og henholdsvis 495 og 520 nanometer for pH-ufølsomme farvestof. Indstil antallet af blink til 30 og z-position til 33, 200 for hver fluorophore. Indstil multilæst pr. brønd til brugerdefineret, som en treer af tre efter cirkel med en kant på 4,750 mikrometer.Klik på start for at starte baggrundsmålingen og klikke på okay for at bekræfte, at låget på fugtighedskassetten er på plads. Ved afslutningen af målingen overføres pladen fra pladelæseren til et vævskultursikkerhedsskab, og der tilsættes tre mikroliter frisklavet dextran-koblet fluorescerende farvestofopløsning til cellernes apikale overflade. Vend derefter pladen tilbage til cellekulturskuvøsen natten over.For målingen af kinetik skal du åbne den metodefil, der bruges til baggrundsmålingerne. Når alle parametrene er indstillet, skal du åbne pladelæserskuffen og indsætte fugtighedskassetten. Placer den rene plade i fugtighedskassetten med dækslet, og klik på start for at starte fluorescensaflæsningerne.Klik derefter på okay, for at bekræfte, at låget af luftfugtigheden kassetten er på plads. Efter mindst 12 cyklusser, klik pause for at afbryde eksperimentet og fjerne pladen til basolaterally anvende eventuelle lægemidler eller agonister til de relevante prøver. Returner pladen til fugtighedskassetten på bakken, og flyt fugtighedskassettelåget, før du klikker, for yderligere at registrere ASL-pH-skærmen og overvåge effekten af behandlingen.Ved in situ-pH-kalibrering fjernes pladen fra pladelæseren, og basolateralopløsningen aspireres. Der tilsættes 750 mikroliter højbueopløsning til det basolaterale rum og en mikroliter opløsning til den apikale overflade. Sluk for kuldioxiden på pladelæseren, og vend pladen tilbage til fugtighedskassetten.Sæt derefter pladelæseren med samme parametre som påvist, men uden kuldioxid, og start fluorescensaflæsningerne hvert femte minut i en til halvanden time. Til dataanalyse skal du markere alle middeldataene for hvert eksempel og eller betingelse for begge bølgelængder i baggrundsfilen og kopiere og indsætte dataene i en ny fil. Beregn derefter gennemsnitsbaggrunden for hver brønd og hver bølgelængde.Når kalibrerings- og kinetiske data er kopieret og indsat på samme måde, trækkes baggrunden fra hvert datapunkt for hver bølgelængde. For hvert tidspunktspunkt og hver prøve beregnes forholdet mellem pH-følsomme og pH-ufølsomme fluorescens. For hvert tidspunkt skal der genereres en standardkurve ud fra nøgletal, og de kendte pH-værdier afbildes på x-aksen og forholdet på y-aksen.Bestem det tidspunkt, hvor nøgletalene er stabile, tilpas en lineær regressionslinje, og hent ligningen for denne linje. Beregn derefter pH-værdien for hvert tidspunktspunkt, og afbilde pH-værdien på y-aksen og tiden på x-aksen. I dette repræsentative indledende forsøg uden celler med samme pH og samme koncentration varierede de pH-følsomme og pH-ufølsomme emissionsforhold afhængigt af farvestoffets volumen.Ved samme pH og samme volumen gav forskellige farvestofkoncentrationer desuden forskellige forholdsværdier, hvilket indikerer, at ændringer i volumen- eller farvestofkoncentrationen påvirker pH-værdiens absolutte værdi beregnet ud fra emissionsforholdet. Desuden er den tid, der kræves til temperaturækvilibrering, ca. 15 til 20 minutter uanset farvevolumen eller koncentration. ASL pH-værdier fra en enkelt global standardkurve viser en signifikant forskel mellem ikke-cystisk fibrose og cystisk fibrosekulturer.Der henviser til, ASL pH er ikke signifikant forskellig mellem cystisk fibrose og ikke-cystisk fibrose human luftvejs epitelceller, når pH beregnes ud fra uafhængige standard kurver. Det er derfor vigtigt at generere uafhængige kalibreringskurver for hvert eksperiment og inden for hvert forsøg for hver donorprøve, som når kalibreringskurverne beregnes sammen i gennemsnit, findes højere pH-følsomme, pH-ufølsomme forholdsværdier i cystisk fibrosekulturer, der angiver en mere sur pH-værdi. Som forventet, tilsætning af basolateral forskolin øger ASL pH i ikke-cystisk fibrose kulturer alene.Da disse celler er blevet holdt under steril tilstand, kan de vaskes, re-fodres og anvendes et par dage senere til fremtidige eksperimenter. Alle biologiske menneskelige enheder bør betragtes som potentielt farlige. Så sørg for at bruge det passende niveau af indespærring og personlige værnemidler afhængigt af dine prøver.Det er vigtigt at udføre baggrundsmålingerne og pH-kalibreringerne for hvert sæt prøver for at reducere variationen mellem donorerne og forbedre nøjagtigheden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Oprensning af biotinylerede celleoverfladeproteiner fra<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epitelceller

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Sporing af DNA-fragmenter i realtid af Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatiske Biopanning af bakteriel Display biblioteker for peptid affinitet reagens opdagelse og analyse af resulterende isolater

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

Regenerering af klædt guld Microelectrodes udstyret til en Real-Time celle Analyzer

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Real-time overvågning af DNA streng Exchange reaktion medieret af Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Undersøge dynamikken i cellulære vedhæftning og spredning af Epiteliale celler på Fibronectin under oxidativ stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flydende kromatografi-massespektrometri-baserede metabolomiske analyse af hvedekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Måling af nukleotidbinding til intakte, funktionelle membranproteiner i realtid

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Aktivering af real-time kompensation i hurtige fotokemiske oxidationer af proteiner til bestemmelse af Protein Topografi Ændringer

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Ekstracellulær glukoseudtømning som et indirekte mål for glukoseoptagelse i celler og væv Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...