Name: real-time, semi-automated fluorescent measurement of the airway surface liquid ph of primary human airway epithelial cells
Uploaded: 2019-06-13T15:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells at JoVE.com

इस कार्य को दो सीएफ ट्रस्ट रणनीतिक अनुसंधान केंद्र अनुदान (SRC003 और SRC013) और एक चिकित्सा अनुसंधान परिषद (MRC) अवधारणा अनुदान (MC_PC_15030) में विश्वास द्वारा समर्थित किया गया था । JG चिकित्सा अनुसंधान फाउंडेशन (MRF-091-0001-आरजी-GARNE) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । एमबी एक चिकित्सा अनुसंधान परिषद के नैदानिक वैज्ञानिक फैलोशिप (MR/M008797/1) द्वारा समर्थित किया गया था । IH एक Wellcome ट्रस्ट नैदानिक प्रशिक्षण फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था (203520/ इस शोध को न्यूकैसल हॉस्पिटल्स एनएचएस फाउंडेशन ट्रस्ट और न्यूकैसल यूनिवर्सिटी पर आधारित नैशनल इंस्टिट्यूट फॉर हेल्थ रिसर्च न्यूकैसल बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर ने सपोर्ट किया । व्यक्त किए गए विचार लेखक (ओं) के हैं और यह आवश्यक रूप से एनएचएस, एनआईएचआर या स्वास्थ्य विभाग के नहीं हैं । डॉ Randell से प्राथमिक कोशिकाओं सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन अनुदान (BOUCHE15R0) और NIH अनुदान (P30DK065988) द्वारा समर्थित थे ।

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+tromethamine+as+inhaled+therapy+to+treat+CF+airway+disease.">Repurposing tromethamine as inhaled therapy to treat CF airway disease.</a> JCI Insight. 1 (8), (2016).</li><li>Ngamtrakulpanit, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Intrinsic+Airway+Acidification+in+Pulmonary+Tuberculosis.">Identification of Intrinsic Airway Acidification in Pulmonary Tuberculosis.</a> Global Journal of Health Science. 2 (1), 106-110 (2010).</li><li>Tate, S., MacGregor, G., Davis, M., Innes, J. A., Greening, A. 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एमबी: इस काम से संबंधित नहीं: अन्वेषक-फाइजर और Roche निदान से अनुसंधान अनुदान का नेतृत्व किया; वक्ता शुल्क नोवार्टिस, Roche निदान और TEVA से ंयूकैसल विश्वविद्यालय को भुगतान किया । Boehringer Ingelheim और वर्टेक्स फार्मास्यूटिकल्स से शैक्षिक बैठकों के लिए यात्रा खर्च.

यहां हम प्राथमिक मानव airway उपकला कोशिकाओं में ASL पीएच के गतिशील माप के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । महत्वपूर्ण कदम कोशिकाओं के ऊपरी सतह से बलगम धोने शामिल, मापने और प्रयोग में के रूप में एक ही मापदंडों का उपयोग पृष्ठभूमि घटाकर, z-स्थिति और लाभ का अनुकूलन और एक सीटू पीएच अंशांकन में प्रदर्शन.
कोशिकाओं को धोने का पहला कदम बलगम की एक मोटी परत के रूप में महत्वपूर्ण है (मैं) pericilliarlayer (PCL) तक पहुँचने से रंगों को रोकने और (ii) देरी या agonists/अवरोधकों के जवाब में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन का पता लगाने को रोकने । हमारी विधि का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था कि कैसे प्राथमिक हासेक hco3 की गतिविधि संग्राहक और एच+ ट्रांसपोर्टर agonists के जवाब में. हालांकि यह कैसे PCL पीएच में परिवर्तन बलगम पीएच में परिवर्तन करने के लिए संबंधित की जांच करने के लिए दिलचस्प हो जाएगा, इस प्रोटोकॉल के आगे विकास, अलग आणविक वजन के उपयोग सहित की जरूरत है-dextrans को विभेदीक रूप से लक्ष्य 2 परतों और जेड के माध्यम से स्कैन पूरे ASL.
पृष्ठभूमि मापन इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण कदम है । पूरी तरह से विभेदित प्राथमिक airway उपकला के शीर्षस्थ सतह शायद ही कभी पूरी तरह से फ्लैट है जो प्रकाश पथ और इसलिए पृष्ठभूमि को प्रभावित करेगा । यह सुनिश्चित करना कि पृष्ठभूमि रीडिंग कुओं की एक ही स्थानीय अंक में प्रदर्शन के दौरान के रूप में किया जाता है reproducibility और रिकॉर्डिंग की स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है ।
Z-स्थिति और लाभ का अनुकूलन आवश्यक कदम है कि फ्लोरिसेंट डाई कि इस्तेमाल किया जाएगा के प्रत्येक अलग एकाग्रता के लिए स्थापित करने की आवश्यकता है । इससे हाई इंटर-एक्सपेरीमेंट वैरिएबिलिटी पर रोक लगेगी । एक बार स्थापित, हमारे परख स्थिर और reproducible परिणाम प्रदान करता है । इस के लिए कारणों में से एक यह है कि रंग तरल पदार्थ है कि आसानी से उपकला द्वारा reabsorbed है की एक छोटी मात्रा में कोशिकाओं पर ऊपरी सतह पर जोड़ रहे हैं, एक समरूप ASL लेबल छोड़ । ASL दाग करने के लिए एक और तरीका है, कि समान रूप से सफल हो सकता है, सूखी पाउडर या पीएफसी में एक "निलंबन" का इस्तेमाल किया । हालांकि यह समय की बचत हो सकता है (के रूप में प्रयोग आम तौर पर 2 एच के भीतर प्रदर्शन कर रहे हैं), यह संभावना नहीं है कि शुष्क डाई पूरी तरह से ASL में घुलनशील और इस प्रकार हो सकता है फार्म clumps । इस प्रकार पीएच-संवेदी डाई के अलग सांद्रता उपकला कोशिकाओं की सतह पर पाया जाएगा ।
में सीटू पीएच अंशांकन एक महत्वपूर्ण कदम के लिए सटीक, reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए है । के रूप में दिखाया गया है और परिणाम अनुभाग में समझाया, asl संस्करणों में अंतर प्रतिदीप्ति गिनती को प्रभावित करेगा और इसलिए अंतर्वेशित पीएच मान (चित्रा 2 और चित्रा 3). Whilst विभिंन समूहों पहले asl पीएच माप प्रकाशित किया है, मूल्यों की एक विस्तृत श्रृंखला भी विभिंन एक ही समूह8,17द्वारा प्रकाशित अध्ययनों के बीच प्राप्त किया गया है । हमें विश्वास है कि स्वस्थानी कैलिब्रेशन में प्रदर्शन करके, परिणाम अधिक reproducible हो जाएगा । अंय पीएच अंशांकन तकनीक है, जो उच्च K का उपयोग करें+/नाइजीरीसिन (या एकाधिक ionophores) विधि मानक वक्र28,29,30उत्पंन करने के लिए की तुलना में, परख यहां प्रस्तुत लाभ है कि , जब तक हर कदम एक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाता है, ASL पीएच के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं धोया, रखा जा सकता है और अंय प्रयोगों के लिए reused किया है कि उपचार प्रदर्शन अचल उपकला कोशिकाओं को प्रभावित नहीं करते ।
विकास और इस परख के अनुकूलन reproducible परिणाम प्रदान की है और हम इस विधि उनके ASL पीएच माप के साथ अंय समूहों में मदद मिलेगी विश्वास करते हैं । हालांकि, इस तकनीक में भी सेट अप और उपयोग किए जा रहे कक्षों के प्रकार के कारण कुछ सीमाएं हैं । निगरानी ASL पीएच कि यहां प्रस्तुत की तुलना में एक लंबे समय अवधि में (> 8-10 ज) मुश्किल साबित हो सकता है के रूप में एक लंबी अवधि के उच्च आर्द्रता पर्यावरण उपकरण और तथ्य यह है कि सबसे थाली पाठकों केवल एक से अधिक काइनेटिक रीडिंग रिकॉर्ड करने के लिए विकल्प की पेशकश को नुकसान हो सकता है समय की निश्चित मात्रा (आमतौर पर 24 ज) । पूरी तरह से विभेदित प्राथमिक haecs का उपयोग करने के तरीके में महत्वपूर्ण है कि भिंनता के विभिंन चरणों hco3- और एच+ ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति को प्रभावित करेगा । तथापि, तनु फिल्म स्थितियों के अंतर्गत उगाई गई कोशिकाओं में एएसएल की मात्रा को ठीक से नियंत्रित करने की वस्तुत कोई संभावना नहीं है । के रूप में प्रोटोकॉल और परिणाम वर्गों में कहा गया है, मात्रा में परिवर्तन प्रतिदीप्ति अनुपात को प्रभावित करेगा और यह दुर्भाग्य से लगता है कि कोशिकाओं में एक एकल व्यक्ति से हो, अलग अर्द्ध पारभासी का समर्थन करता है पर एक ही दिन वरीयता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, ASL संस्करणों एक ही होगा । इस सीमा से उत्पंन, किसी भी एगोनिस्ट या अवरोध करनेवाला है कि तरल पदार्थ स्राव या अवशोषण को प्रभावित करेगा asl मात्रा और संभवतः प्रतिदीप्ति अनुपात को प्रभावित करेगा । हालांकि, हमारे परख में, अंशांकन वक्र प्रयोग के अंत में किया जाता है, तो हम मान सकते है कि मात्रा में इन परिवर्तनों को एक ही रास्ते में अंशांकन अनुपात को प्रभावित करेगा के रूप में काइनेटिक प्रयोग के दौरान । इस कारण से हम समूहों है कि इस परख के विकास में रुचि होगी सलाह के लिए, कम से 2-3 इस शर्त के रूप में परीक्षण के रूप में प्रत्येक शर्त के लिए एक मानक वक्र की स्थापना के लिए अनुमति देगा के अनुसार प्रतिकृति का उपयोग करें ।
यहां हम एक सरल, अर्द्ध स्वचालित, परख कि पतली फिल्म शर्तों के तहत श्लैष्मिक सतह पीएच के वास्तविक समय मापन की अनुमति देता है वर्तमान । यह एक पास में कई संस्कृतियों में गतिशील पीएच प्रतिक्रियाओं की जांच की क्षमता है कि अंतर और अंत दाता तुलना की अनुमति देता है । एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट polarized प्रणाली का उपयोग कर प्रारूप करने के लिए इस विधि upscaling (HTS ९६ अच्छी तरह से प्लेटें)३८ एक दवा की खोज परख के रूप में भी उच्च throughput प्रदान करेगा । इसके अलावा, हम कैसे इस तकनीक asl पीएच पर एगोनिस्ट की तीव्र प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और हम पहले से ही प्रकाशित किया है कि इस विधि CF haecs asl३९पर एक शीर्ष प्रोन पंप अवरोध करनेवाला के दीर्घकालिक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा कर सकते हैं दिखाया है । पीएच संक्रमण, सूजन, बलगम चिपचिपापन और आयन परिवहन को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है के रूप में, आणविक लक्ष्य है कि पीएच में वृद्धि कर सकते हैं जीर्ण फेफड़ों के रोगों के अनुसंधान क्षेत्रों में मूल्यवान हो जाएगा की पहचान करने और इस तकनीक को संभवतः सुविधा होगी व् यक्तिगत चिकित् सा पद्धतियों में दवा जांच का विकास । अंत में, के बाद से एसिड आधार homeostasis में dysregulation अंय रोगों में एक प्रमुख भूमिका निभाता है, इस प्रोटोकॉल अनुकूलित किया जा सकता है, अनुकूलन कदम के साथ, विभिंन उपकरणों के लिए (थाली पाठकों) और अंय उपकला कोशिकाओं के रूप में सेल प्रकार, । Extracellular अम्लता कैंसर की एक विशेषता है४०,४१,४२ और इस परख कैसे ठोस ट्यूमर कम पीएचई का उत्पादन या एक कम throughput दवा स्क्रीनिंग के लिए परख के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता का निर्धारण में मदद कर सकता है पीएच homeostasis की बहाली । इसी तरह, पुरानी airway रोगों के लिए के रूप में, यह भी एक व्यक्तिगत चिकित्सा दृष्टिकोण के विकास के लिए एक मंच प्रदान कर सकता है ।

वायुमार्ग उपकला एक पतली (~ 10 μm) तरल पदार्थ परत द्वारा कवर किया जाता है एयरवे सतह तरल (ASL) करार दिया । इस asl की संरचना और गहराई (जलयोजन) कसकर विनियमित है और mucocilliescalator1,2,3,4द्वारा एयरवे क्लीयरेंस की दक्षता नियंत्रित करता है । हाल के वर्षों में, एएसएसएल एच+/एचसीओ3- सामग्री के महत्व को asl हाइड्रेशन5, एयरवे सूजन6 और संक्रमण7को विनियमित करने की क्षमता के कारण विभिन्न समूहों द्वारा प्रदर्शित किया गया है, 8 साथ ही बलगम चिपचिपापन8,9। महत्वपूर्ण बात है, हालांकि वहां कुछ विवादों, कई अध्ययनों से इस तरह अस्थमा10,11,12, copd11के रूप में पुरानी airway रोगों में एयरवे पीएच के dysregulation की सूचना दी है, ब्रोंकाइटिस11, जीर्ण rhinosinusitis13,14 और सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF)5,9,15,16,17, जो पता चलता है कि चिकित्सा कि ASL पीएच बहाल करने के लिए पुरानी airway रोगों के कई प्रकार के इलाज के लिए उपयोगी हो सकता है । सीएफ़, काकेशियन आबादी में सबसे आम ऑटोसोमल अप्रभावी आनुवंशिक रोग है और यह CF ट्रांजेम्बल चालकत्व नियामक (CFTR) जीन में उत्परिवर्तनों के कारण होता है. इस जीन एक आयनों कोड (hco3- और सीएल-) चैनल है कि आयन और द्रव परिवहन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और homeostasis उपकला18भर में । हालांकि cf एक बहु-अंग रोग है, फेफड़ों की विकृति रुग्णता और मृत्यु दर का मुख्य कारण है19,20 और cf में प्राथमिक दोष को ध्यान में रखते हुए सीएल का बिगड़ा परिवहन है- और hco3-, एक परिकल्पना कि cf के साथ लोगों में है कि extracellular द्रव पीएच जो लोग cf नहीं है की तुलना में dysविामिभित हो जाएगा कर सकते हैं । इस प्रकार, asl ph का मापन सीएफ़ अनुसंधान का एक सामयिक क्षेत्र रहा है और विभिंन समूहों ने cf में asl ph को मापने के लिए तकनीकों का विकास किया है एयरवेज.
Vivo में, एयरवे पीएच विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर मापा गया है, माइक्रो-probes से (फाइबर ऑप्टिक, सोना या मोबिडियम जांच)5,21,22,23,24 के पीएच माप expectorated सामग्री या exhaled सांस घनेदार (ebc)10,11,12,25,26,27। सीएफ़ के अनुसंधान क्षेत्र में, पीएच का व्यापक अध्ययन इसके संभावित नैदानिक निहितार्थों के कारण किया जा रहा है । सैद्धांतिक रूप से, वायुमार्ग को और अधिक क्षारीय बनाने से जीवाणु की हत्या में वृद्धि हो सकती है और एक पूरे के रूप में एयरवे होमस्टोसिस में सुधार हो सकता है । तथापि, वीवो/एक्स वीवो अध्ययन में पीएच मूल्यों की एक विस्तृत श्रृंखला की रिपोर्ट, और तारीख तक, परिणाम गैर-CF और cf एयरवेज के बीच पीएच में अंतर के अस्तित्व के बारे में निर्णायक नहीं हैं । प्रारंभिक 2000s में, विभिन्न समूहों EBC के पीएच की सूचना दी. गैर-रोगग्रस्त समूहों में, ph मान ४.६ से ८.५ के बीच थे, लेकिन दिलचस्प बात यह है कि, ebc पीएच को12,27CF के साथ लोगों में तीव्रता के दौरान अधिक अम्लीय पाया गया । अधिक हाल ही में, asl के vivo में माप में मानव और जानवरों के मॉडल CF की रिपोर्ट परस्पर विरोधी परिणाम16,17,21,22,23, 24 और यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि सीएफ़ एयरवेज गैर-cf वायुमार्ग की तुलना में अधिक अम्लीय है ।
के रूप में कम ASL पीएच के vivo माप में मुश्किल साबित कर दिया है तरल पदार्थ की बहुत छोटी राशि के कारण एयरवेज और रोग में बलगम प्लग की संभावित उपस्थिति, कई समूहों में बदल गया है ASL पीएच को मापने के लिए इन विट्रो प्रयोगों में, मुख्य रूप से तीन अलग तरीके. पहले दृष्टिकोण का उपयोग करता है dextran युग्मित सेल-impermeant पीएच संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक जो एक सूखी पाउडर के रूप में जोड़ रहे हैं, या तो सीधे asl करने के लिए या एक अक्रिय द्रव का उपयोग कर perfluorocarbon (पीएफसी)5,8,16 , 17 , 28 , 29 , 30 , 31 , ३२. हालांकि, इस तकनीक डाई कि संस्कृतियों में जोड़ा जाता है और डाई समुच्चय और नमूनों और/या प्रयोगों के बीच एकाग्रता में बड़ा अंतर और यहां तक कि एक ही नमूने के भीतर का एक जोखिम प्रस्तुत है की सटीक मात्रा पर थोड़ा नियंत्रण प्रदान करता है . यह भी आम तौर पर एक संनाभि माइक्रोस्कोप है, जो इसकी प्रयोज्यता और कई मामलों में सीमा के साथ प्रदर्शन किया गया है, कई नमूनों और रिकॉर्डिंग की स्थिति में परिवर्तन की विस्तृत निगरानी रोकता है । Asl पीएच को मापने के लिए नियोजित दूसरी विधि पीएच-सेंसिटिव माइक्रोइलेक्ट्रोड5,15का उपयोग है । ASL पीएच माप इसलिए फ्लोरोसेंट डाई एकाग्रता पर निर्भर नहीं कर रहे है और अधिक मजबूत और reproducible परिणाम देना चाहिए । हालांकि, इस विधि डायनेमिक, ASL pH के वास्तविक समय मापन के लिए अनुमति नहीं देता है, और न ही यह आसान विभिन्न शर्तों के तहत एकाधिक रीडिंग करने के लिए है । यह भी एक श्रम गहन, जटिल, प्रक्रिया है कि विशेषज्ञ उपकरणों की आवश्यकता है (microelectrode निर्माण/इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग उपकरणों) और बाद पीएच माप और अंशांकन के लिए नमूने के संग्रह के लिए प्रशिक्षण. इसके अलावा, इन दो तकनीकों को भी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम का उत्पादन करने की क्षमता में कुछ विसंगतियों को दिखाया गया है: पीएच-संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई विधि का प्रयोग, तांग एट अल. ७.३५ के मूल्यों की सूचना के लिए गैर के लिए-CF ASL और ७.० के लिए CF ASL8 जबकि एक अधिक में एक ही समूह से हाल के पेपर, ASL पीएच ६.९ और गैर के लिए ६.४-CF और CF, क्रमशः17था । इसी प्रकार, माइक्रोइलेक्ट्रोड मापन ने २००३ से अध्ययन में गैर-सीएफ एएसएल में ६.४ और सीएफ एएसएल में ६.१ का मान दिया जबकि इसी समूह ने ६.४५5से एक अध्ययन में गैर-सीएफ एएसएल और २०१३ के लिए ६.७ के मूल्यों की सूचना दी । अंत में, तीसरे दृष्टिकोण में, शोधकर्ताओं ने कमजोर buffered समाधान की एक अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में जोड़ (mucosal) संस्कृतियों की सतह पर, इस प्रकार पतली फिल्म की स्थिति को नष्ट करने और ASL संरचना में फेरबदल, और संभवतः इसके नियमन. ph तो मापा जाता है या तो पीएच का उपयोग कर संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंग३३, एक पीएच द्वारा एक ussing चैंबर13,14, या पतला asl की आवश्यकता है संस्कृतियों और पीएच एक पीएच का उपयोग कर मापा से हटा दिया जाएगा में स्टेट टाइट्रेट करना पद्धति इलेक्ट्रोड, विश्लेषक या लिटमस३४स्ट्रिप्स । ASL पीएच की सही माप में एक और कठिनाई एक मानक वक्र है कि संभव के रूप में के रूप में सटीक है की स्थापना है । वास्तव में, रीडिंग एक इलेक्ट्रोड है कि एक राल के माध्यम से बिजली की क्षमता में अंतर को मापने या पीएच के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करेंगे के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं, इन दोनों तरीकों नमूने जा रहा है की स्थानीय microenvironment से प्रभावित हो जाएगा मापा. अधिक विशेष रूप से, डिसोसिएशन स्थिरांक (केडी) रंगों के तापमान, ईओण ताकत, चिपचिपापन के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन और संभावित बलगम के रूप में सेलुलर घटकों के साथ डाई के संभावित बातचीत के आधार पर काफी भिन्न हो सकते हैं.
आदेश में प्रयास करें और इन तकनीकी मुद्दों के कई पर काबू पाने के लिए, के रूप में अच्छी तरह के रूप में विकसित करने के लिए एक और अधिक गतिशील, सरल और उच्च throughput विधि, हम एक इन विट्रो तकनीक है कि रिकॉर्ड प्राथमिक hAEC संस्कृतियों में ASL पीएच एक सेल का उपयोग कर-impermeant पीएच संवेदनशील की स्थापना की है एक मानक वाणिज्यिक प्लेट में फ्लोरोसेंट डाई-पाठक । विधि, पतली फिल्म की स्थिति के तहत पूरी तरह से विभेदित 3 डी सेल संस्कृतियों के ASL पीएच की प्रतिलिपि, गतिशील, अर्द्ध स्वचालित, वास्तविक समय मापन उत्पंन करता है । एक बहु के उपयोग के माध्यम से अच्छी तरह से थाली पाठक, इस अर्द्ध स्वचालित परख 12 घंटे से अधिक 24 शर्तों के लिए पीएच के एक साथ माप के पास कर सकते है और विभिंन एगोनिस्ट या inhibitors जोड़ने के प्रभाव की निगरानी कर सकते हैं । इस पत्र में हम विस्तार में पद्धति का वर्णन और सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण की स्थिति है कि तकनीक पुष्टि के तहत प्रतिनिधि परिणाम रिपोर्ट ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E4780-1226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.5 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFTRInh172</td>
			<td>RnD Systems (Tocris)</td>
			<td>3430</td>
			<td>Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D22910</td>
			<td>Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P10361</td>
			<td>Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>RnD Systems (Tocris)</td>
			<td>1099</td>
			<td>Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity cassette</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>30090495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader: TECAN SPARK 10M</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>30086375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal pH electrodes DJ 113</td>
			<td>VWR</td>
			<td>662-1385</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time, semi-automated fluorescent measurement of the airway surface liquid ph of primary human airway epithelial cells

हाल के वर्षों में, वायुमार्ग में श्लैष्मिक सतह पीएच के महत्व एयरवे सतह तरल (asl) जलयोजन, बलगम चिपचिपाहट और रोगाणुरोधी पेप्टाइड की गतिविधि को विनियमित करने की क्षमता द्वारा प्रकाश डाला गया है की जंमजात रक्षा में शामिल प्रमुख मापदंडों फेफड़ों. यह सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) के रूप में पुरानी श्वसन रोगों के क्षेत्र में प्राथमिक प्रासंगिकता है, जहां इन मापदंडों को डिस्रेगुलेटेड कर रहे हैं । जबकि विभिंन समूहों का अध्ययन किया है ASL pH दोनों में vivo और इन विट्रो, उनके तरीकों की रिपोर्ट ASL पीएच मूल्यों की एक अपेक्षाकृत विस्तृत श्रृंखला और भी विरोधाभासी किसी भी गैर के बीच पीएच मतभेद के बारे में निष्कर्ष CF और CF कोशिकाओं । इसके अलावा, उनके प्रोटोकॉल हमेशा पर्याप्त जानकारी प्रदान नहीं करने के लिए reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, सबसे कम throughput रहे है और महंगे उपकरण या विशेष ज्ञान को लागू करने की आवश्यकता है, उंहें सबसे प्रयोगशालाओं में स्थापित करने के लिए मुश्किल बना । यहां हम एक अर्द्ध स्वचालित फ्लोरोसेंट प्लेट पाठक परख कि पतली फिल्म की स्थिति के तहत ASL पीएच के वास्तविक समय मापन में सक्षम बनाता है कि और अधिक बारीकी से vivo स्थिति में सदृश वर्णन । इस तकनीक की अनुमति देता है एकाधिक airway संस्कृतियों से कई घंटे के लिए स्थिर माप के लिए एक साथ और, महत्वपूर्ण बात, एगोनिस्ट और inhibitors के जवाब में asl पीएच में गतिशील परिवर्तन पर नजर रखी जा सकती है । इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, पूरी तरह से विभेदित प्राथमिक मानव airway उपकला कोशिकाओं (haecs) के asl एक पीएच संवेदनशील डाई के साथ रात भर दाग रहे है ताकि पतली फिल्म की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त तरल पदार्थ के पुनरवशोषण के लिए अनुमति देने के लिए । प्रतिदीप्ति उपस्थिति या agonists की अनुपस्थिति में नजर रखी है के बाद, पीएच अंशांकन मात्रा और डाई एकाग्रता के लिए सही करने के लिए स्वस्थानी में किया जाता है. विधि वर्णित करने के लिए आवश्यक नियंत्रण प्रदान करता है स्थिर और reproducible ASL पीएच माप है, जो अंततः निजीकृत दवा के लिए एक दवा खोज मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही अंय उपकला ऊतकों और प्रयोगात्मक के लिए अनुकूलित भड़काऊ और/या मेजबान-रोगज़नक़ मॉडल के रूप में शर्तों, ।

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Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

वास्तविक समय, अर्ध-स्वचालित वायुमार्ग की सतह तरल प्राथमिक मानव Airway उपकला कोशिकाओं के pH का मापन

हम पतली फिल्म एक थाली पाठक का उपयोग कर स्थितियों के तहत airway सतह तरल पीएच के गतिशील माप बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

हमारा प्रोटोकॉल पहला है जो वायुमार्ग की सतह तरल, या एएसएल पीएच के गतिशील माप की अनुमति देता है, वास्तविक समय में दोनों आराम के तहत और एगोनिस्ट या अवरोधक उपचार के बाद। यह विधि आयन चैनलों और ट्रांसपोर्टरों को बाहुलीय पीएच विनियमन में शामिल करने में मदद करती है और अन्य सेल प्रणालियों पर लागू की जा सकती है जिसमें यह कैंसर जैसे महत्वपूर्ण है। अब पहले प्रकाशित तरीकों की तुलना में, यह नई तकनीक प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत सरल है।इसके लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है। और एयर लिक्विड इंटरफेस, या पतली फिल्म स्थितियों के तहत कई संस्कृतियों में एक साथ ASL पीएच माप कर सकते हैं । महत्वपूर्ण बात यह है कि इस नई तकनीक में न केवल सिस्टिक फाइब्रोसिस के लिए, बल्कि अस्थमा और सीओपीडी जैसे अन्य क्रोनिक एयरवे रोगों के लिए भी नए चिकित्सीय के प्रभावों का आकलन करने की क्षमता है ।संस्कृति के कम से कम 28 दिनों के बाद, सेल कल्चर इनक्यूबेटर पर 20 मिनट के लिए क्रेब बफर समाधान युक्त बाइकार्बोनेट के 150 माइक्रोलीटर के साथ मानव वायुमार्ग एपिथेलियल सेल संस्कृति की एपिकल सतह को धोएं। इनक्यूबेशन के अंत में, एक बाँझ P200 पिपेट टिप के साथ एक बाँझ ग्लास पिपेट का उपयोग करें, जो एपिथेलियम को बाधित किए बिना सावधानी से धोने को अपमानित करे। एयर लिक्विड इंटरफेस को बहाल करने के लिए जितना संभव हो उतना कम तरल होना चाहिए।फिर कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें। पृष्ठभूमि माप करने के लिए, प्लेट रीडर और कंप्यूटर चालू करें। डैशबोर्ड खोलने के बाद, स्पार्क 10एम पर क्लिक करें और तापमान नियंत्रण को 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।फिर गैस नियंत्रण खोलें और कार्बन डाइऑक्साइड को 5% तक सेट करें जब तापमान और गैस अपने लक्ष्य तक पहुंच गई है, तो प्लेट रीडर दराज खोलें और पाठक में प्रत्येक तरफ आसुत पानी के छह मिलीलीटर से भरा आर्द्रता कैसेट डालें। पुष्टि करें कि सेल कल्चर प्लेट के ढक्कन और नीचे साफ हैं और प्लेट को आर्द्रता कैसेट पर रखें, ढक्कन को वापस रखें और दराज को बंद करें। स्पार्क मेथड एडिटर खोलें, उपयुक्त प्लेट टेम्पलेट का चयन करें और प्रयोग के दौरान निगरानी किए जाने वाले कुओं का चयन करें।एक तापमान और कार्बन डाइऑक्साइड नियंत्रण कक्ष जोड़ें और पैनलों को क्रमशः 37 डिग्री सेल्सियस और 5% तक सेट करें। फिर तापमान/गैस बक्से के लिए प्रतीक्षा टिक । एक गतिज लूप पैनल जोड़ें और लूप प्रकार के रूप में अवधि का चयन करें।अवधि को पांच मिनट तक सेट करें और निरंतर पढ़ने को प्राप्त करने के लिए परिभाषित नहीं करने के लिए प्रयोग के अंतराल प्रकार को निर्धारित करें। गतिज लूप के भीतर, दो फ्लोरेसेंस तीव्रता पैनलों को जोड़ने के लिए ड्रैग एंड ड्रॉप फ़ंक्शन का उपयोग करें जो व्यक्तिगत रूप से पीएच-संवेदनशील और पीएच-असंवेदनशील फ्लोरोसेंट रंगों के लिए सेट किए जाएंगे। पीएच-सेंसिटिव डाई के लिए क्रमशः 560 और 590 नैनोमीटर की उमंग और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य निर्धारित करें।और पीएच-असंवेदनशील डाई के लिए क्रमशः 495 और 520 नैनोमीटर। चमक की संख्या 30 और जेड-स्थिति को 33, 200 प्रत्येक फ्लोरोफोर के लिए सेट करें। 4, 750 माइक्रोमीटर की सीमा के साथ सर्कल द्वारा तीन से तीन के रूप में परिभाषित उपयोगकर्ता को प्रति अच्छी तरह से कई पढ़ने सेट करें।पृष्ठभूमि माप पढ़ने शुरू करने के लिए शुरू पर क्लिक करें और ठीक क्लिक करें, पुष्टि करने के लिए कि आर्द्रता कैसेट का ढक्कन जगह में है । माप के अंत में, प्लेट रीडर से प्लेट को ऊतक संस्कृति सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं की एपिकल सतह पर ताजा तैयार डेक्सट्रान-युग्मित फ्लोरोसेंट डाई समाधान के तीन माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर रात भर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में थाली वापस कर दें।काइनेटिक्स माप के लिए, पृष्ठभूमि माप के लिए उपयोग की जाने वाली विधि फ़ाइल खोलें। जब सभी पैरामीटर सेट हो गए हों, तो प्लेट रीडर दराज खोलें और आर्द्रता कैसेट डालें। अपने कवर के साथ आर्द्रता कैसेट में साफ प्लेट रखें और फ्लोरेसेंस रीडिंग शुरू करने के लिए शुरू पर क्लिक करें।फिर ठीक क्लिक करें, पुष्टि करने के लिए कि आर्द्रता कैसेट का ढक्कन जगह में है। न्यूनतम 12 चक्रों के बाद, प्रयोग को बाधित करने के लिए ठहराव पर क्लिक करें और प्लेट को हटाने के लिए उचित नमूनों के लिए किसी भी दवा या पीड़ाकार लागू करें। प्लेट को ट्रे पर आर्द्रता कैसेट पर वापस करें और क्लिक जारी रखने से पहले आर्द्रता कैसेट ढक्कन को फिर से स्थान दें, एएसएल पीएच को आगे रिकॉर्ड करने और उपचार के प्रभाव की निगरानी करने के लिए।सीटू पीएच अंशांकन में, प्लेट रीडर से प्लेट निकालें और बेसोटेरल समाधान को एस्पिरेट करें। बेसोटेरल डिब्बे में अत्यधिक बफर मानक वक्र समाधान के 750 माइक्रोलीटर और एपिकल सतह के समाधान का एक माइक्रोलीटर जोड़ें। प्लेट रीडर पर कार्बन डाइऑक्साइड बंद करें और प्लेट को आर्द्रता कैसेट में वापस करें।फिर प्रदर्शन के रूप में एक ही मापदंडों के साथ प्लेट रीडर सेट करें, लेकिन कोई कार्बन डाइऑक्साइड के साथ, और एक से डेढ़ घंटे के लिए हर पांच मिनट में फ्लोरेसेंस रीडिंग शुरू करें। डेटा विश्लेषण के लिए, प्रत्येक नमूने के लिए सभी मतलब डेटा का चयन करें और, या पृष्ठभूमि फ़ाइल में तरंगदैर्ध्य दोनों के लिए स्थिति और डेटा को एक नई फ़ाइल में कॉपी करें और चिपकाएं। फिर प्रत्येक अच्छी तरह से और प्रत्येक तरंगदैर्ध्य के लिए मतलब पृष्ठभूमि की गणना करें।अंशांकन और गतिज डेटा को एक ही तरीके से कॉपी और चिपकाने के बाद, प्रत्येक तरंगदैर्ध्य के लिए प्रत्येक डेटा बिंदु से पृष्ठभूमि को घटाएं। हर बार बिंदु और हर नमूने के लिए, पीएच-संवेदनशील और पीएच-असंवेदनशील फ्लोरेसेंस के बीच अनुपात की गणना करें। हर समय बिंदु के लिए, अनुपात से एक मानक वक्र उत्पन्न करें और एक्स-एक्सिस पर ज्ञात पीएच मूल्यों और वाई-एक्सिस पर अनुपात को प्लॉट करें।उस समय बिंदु का निर्धारण करें जिस पर अनुपात स्थिर हैं, एक रैखिक प्रतिगमन रेखा फिट करें और इस लाइन के लिए समीकरण प्राप्त करें। फिर, हर बार बिंदु के लिए पीएच की गणना करें और वाई-एक्सिस पर पीएच और एक्स-एक्सिस पर समय की साजिश करें। एक ही पीएच और एक ही एकाग्रता पर कोशिकाओं के बिना इस प्रतिनिधि प्रारंभिक प्रयोग में, पीएच-संवेदनशील और पीएच-असंवेदनशील उत्सर्जन अनुपात डाई की मात्रा के आधार पर भिन्न था।इसके अतिरिक्त, एक ही पीएच और एक ही मात्रा में, विभिन्न डाई सांद्रता ने विभिन्न अनुपात मूल्य प्रदान किए, जो यह दर्शाता है कि मात्रा या डाई एकाग्रता में परिवर्तन उत्सर्जन अनुपात से गणना किए गए पीएच के पूर्ण मूल्य को प्रभावित करता है। इसके अलावा, डाई की मात्रा या एकाग्रता की परवाह किए बिना तापमान संतुलन के लिए आवश्यक समय लगभग 15 से 20 मिनट है। एएसएल पीएच एक वैश्विक मानक वक्र से प्राप्त मूल्य गैर सिस्टिक फाइब्रोसिस और सिस्टिक फाइब्रोसिस संस्कृतियों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर प्रदर्शित करते हैं।जबकि, एएसएल पीएच सिस्टिक फाइब्रोसिस और गैर-सिस्टिक फाइब्रोसिस मानव वायुमार्ग एपिथेलियल कोशिकाओं के बीच काफी अलग नहीं है जब पीएच की गणना स्वतंत्र मानक घटता से की जाती है। इसलिए, प्रत्येक प्रयोग के लिए और प्रत्येक प्रयोग के भीतर, प्रत्येक दाता नमूने के लिए स्वतंत्र अंशांकन घटता उत्पन्न करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि जब अंशांकन घटता एक साथ औसत होता है, तो उच्च पीएच-संवेदनशील, पीएच-असंवेदनशील अनुपात मूल्य सिस्टिक फाइब्रोसिस संस्कृतियों में पाए जाते हैं जो अधिक अम्लीय पीएच का संकेत देते हैं। जैसा कि अपेक्षित था, बेसोलेर्टल फोर्स्कोलिन के अलावा केवल गैर-सिस्टिक फाइब्रोसिस संस्कृतियों में एएसएल पीएच को काफी बढ़ाता है।चूंकि इन कोशिकाओं को बाँझ स्थिति में रखा गया है, इसलिए उन्हें धोया जा सकता है, फिर से खिलाया जा सकता है और भविष्य के प्रयोगों के लिए कुछ दिनों बाद उपयोग किया जा सकता है। सभी जैविक मानव नमूनों को संभावित रूप से खतरनाक माना जाना चाहिए। इसलिए अपने नमूनों के आधार पर कारावास और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के उचित स्तर का उपयोग करना सुनिश्चित करें।अंतर-दाता परिवर्तनशीलता को कम करने और सटीकता में सुधार करने के लिए नमूनों के प्रत्येक सेट के लिए पृष्ठभूमि माप और पीएच अंशांकन करना महत्वपूर्ण है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

बायोटिनिलाटेड सेल सतह प्रोटीन की शुद्धि<em&gt; राइप्सीफलस माइक्रोप्रलस</em&gt; एपिथेलियल पेट कोशिकाओं

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

स्मार्टफ़ोन द्वारा डीएनए फ्रेगमेंट पृथक्करण का वास्तविक समय ट्रैकिंग

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

सेमी स्वचालित के लिए बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों के साथ पेप्टाइड समानता एजेंट खोज और परिणामस्वरूप अलग करने का विश्लेषण

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

सरणी गोल्ड Microelectrodes के पुनर्जनन एक वास्तविक समय सेल विश्लेषक के लिए सुसज्जित

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

डीएनए किनारा विनिमय प्रतिक्रिया की वास्तविक समय अवलोकन Rad51 द्वारा मध्यस्थता

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

ऑक्सीडेटिव तनाव के दौरान फाइब्रोनेक्टिन पर सेलुलर आडंशन की गतिशीलता और एपिथेलियल कोशिकाओं के प्रसार की जांच करना

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

गेहूं के अनाज का अलक्षित तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित मेटापोलोमिक्स विश्लेषण

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

वास्तविक समय में बरकरार, कार्यात्मक झिल्ली प्रोटीन के लिए न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को मापना

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

प्रोटीन स्थलाकृति परिवर्तन के निर्धारण के लिए प्रोटीन के फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीडेशन में वास्तविक समय मुआवजा सक्षम करना

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

कोशिकाओं और ऊतकों में ग्लूकोज अपटेक के अप्रत्यक्ष उपाय के रूप में बाह्य ग्लूकोज की कमी पूर्व विवो

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...