Name: real-time, semi-automated fluorescent measurement of the airway surface liquid ph of primary human airway epithelial cells
Uploaded: 2019-06-13T15:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av to CF Trust Strategic Research Center Grants (SRC003 og SRC013) og et medisinsk forskningsråd (MRC) tillit til Concept Grant (MC_PC_15030). JG ble støttet av et stipend fra Medical Research Foundation (MRF-091-0001-RG-GARNE). MB ble støttet av en medisinsk forskningsråd terapeut forsker Fellowship (MR/M008797/1). IH ble støttet av en Wellcome tillit klinisk trening fellesskap (203520/Z/16/Z). Forskningen ble støttet av National Institute for Health Research Newcastle Biomedical Research Centre basert på Newcastle sykehus NHS Foundation Trust og Newcastle University. Synspunktene uttrykt er de av forfatteren (e) og ikke nødvendigvis de av NHS, NIHR eller Department of Health. Primær-celler fra Dr. Randell ble støttet av cystisk fibrose Foundation Grant (BOUCHE15R0) og NIH Grant (P30DK065988).

Primær ikke-CF (n = 3 donorer, alder 34, 27 og 23 år gammel) og CF (n = 3 givere, alle F580del/F508del; alder 40, 41, ukjent) hAECs var en slags gave fra Dr. Scott H. Randell (Marsico Lung Institute, The University of North Carolina i Chapel Hill, USA) og ble obtai ned under protokollen #03-1396 godkjent av University of North Carolina i Chapel Hill Biomedical institusjonelle Review Board. Cellene ble dyrket i henhold til tidligere publiserte metoder ved hjelp av vekst og differensiering Media beskrevet av Fulcher og Randell35,36.
1. prøve forberedelser
<ol><li>Grow primær hAECs på 6,5 mm diameter semi-gjennomtrengelig støtte (tabell av materialer) ved luft-væske-grensesnitt i minst 28 dager, som tidligere beskrevet35,36.</li>
	<li>Forbered 50 ml steril oppløsning av HCO3- inneholdende Krebs buffer løsning (HCO3- KRB, konsentrasjonene er gitt i mm NaHCO3 (25) NaCl (115), KCl (5), CaCl2 (1), MgCl2 (1), D-glukose (5)) og filter-sterilisere ved hjelp av et sprøyte filter på 0,2 μm.</li>
	<li>Endre basolateral medium til fersk differensiering medium som beskrevet i 1,135,36. Merk: det har blitt vist at basolateral glukose konsentrasjon påvirker ASL pH33. På dette stadiet kan glukose innholdet i det basolateral rommet styres ved å erstatte mediet med bufrede løsninger av kjente glukose konsentrasjoner.</li>
	<li>Vask den apikale overflaten av cellene ved å tilsette 150 μL av HCO3- KRB og ruge i 20 min ved 37 ° c, 5% co2.</li>
	<li>Fjern apikale vask uten å forstyrre epitel ved å aspirating det forsiktig ved hjelp av et sterilt glass Pasteur Pipet og en steril P200 Pipet spiss knyttet til en aspirasjon pumpe som skaper et vakuum i oppsamlingsflasken. På dette stadiet bør det være så lite væske igjen på apikale overflate som mulig for å gjenopprette luft-væske-grensesnittet.</li>
	<li>Ruge cellene i ytterligere 30 min ved 37 ° c, 5% CO2.</li>
</ol>2. bakgrunns måling
<ol><li>Slå på plate leseren og datamaskinen.</li>
	<li>Åpne dashbordet.</li>
	<li>Klikk på gnist 10m, åpne temperaturkontroll og satt til 37 ° c. Åpne gass kontrollen og sett CO2 til 5%.</li>
	<li>Vent til temperaturen og CO2 har nådd sine mål.</li>
	<li>Åpne skuffen for plate leseren, og sett inn luft fuktighets kassetten som er fylt med 6 mL dH2O på hver side. Sørg for at lokket og bunnen av platen er rene-hvis ikke, Rengjør med 70% av etanol på et stykke vev-og Plasser platen i luftfuktigheten kassetten. Merk: gjennom eksperimentet, vevet kultur plate lokket holdes på tallerkenen og bare fjernes når du legger narkotika eller endre basolateral medium, som er utført i en vev kultur laminær Flow Hood å holde kulturer i et sterilt miljø.</li>
	<li>Åpne spark Method Editor og sett opp parametrene på programvaren som følger:<ol>
<li>Velg riktig plate mal (for 6,5 mm diameter halvgjennomtrengelig støtte, Velg den 24 brønn platen) og brønnene som skal overvåkes i løpet av dette eksperimentet.</li>
		<li>Legg til en temperatur og CO2 Kontrollpanel og sette dem til 37 ° c og 5%, henholdsvis. Tick ventetiden for temperatur/gass bokser.</li>
		<li>Legg til et kinetisk sløyfe panel og velg varighet som løkke type og sett den til 5-10 min. Velg ikke definert som intervalltype for å aktivere kontinuerlig lesing. Merk: tidspunktet for kontinuerlig avlesning avhenger av antall brønner/forhold. 5 min er lang nok for 6-12 brønner, mens en full plate som inneholder 24 forhold vil kreve 10 min av kontinuerlige målinger.</li>
		<li>Innenfor kinetisk sløyfe, legge til to "fluorescens intensitet" paneler, ved hjelp av dra og slipp-funksjon, som vil bli satt opp for pH-sensitive og pH ufølsom fluorescerende fargestoffer hhv. Sett eksitasjon og utslipps bølgelengder til 560 og 590 NM, henholdsvis for pH-sensitive fargestoff og 495 og 520 NM, henholdsvis for pH-ufølsom fargestoff.</li>
		<li>Angi antall blink til 30 og z-posisjonen til 33200 for hver fluoroforen. Merk: z-posisjonen og forsterknings innstillingene avhenger av plate leserens egenskaper. Angi forsterkningen manuelt til en verdi som vil gi høy nok teller, slik at forskjellene mellom prøvene plukkes opp, men er lave nok til at tillegg av en Agonistiske ikke vil generere verdier ut av gjenkjennings området.</li>
		<li>Angi flere lese per brønn til bruker definert som en sirkel type 3 × 3 størrelse med en ramme på 4750 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klikk på Start knappen for å foreta en bakgrunns måling og OK for å bekrefte at lokket på luft fuktighets kassetten er på plass.</li>
	<li>På slutten av målingen, åpne plate leseren skuffen, ta platen ut og Pplace den cellenedet tilbake i inkubator mens du forbereder den fluorescerende fargestoff Mix løsning.</li>
	<li>Forbered den fluorescerende fargeblanding løsningen ved å tilsette 2 μL av 1 mg/ml dextran pH-følsom (pHsens) fluorescerende fargestoff til 0,2 μL av 10 mg/ml dextran pH-ufølsom (pHins) fluorescerende fargestoff og 0,8 μL av sterile HCO3- KRB for en endelig volum på 3 μL per tilstand. Merk: det totale volumet av fargestoff blanding løsningen bør være forberedt på n brønner + 1 Hvis det er mellom 1 og 10 prøver, eller n brønner + 2 Hvis det er mellom 11 og 24 prøver. Dextran fargestoffer er rekonstituert i filtrert-steril HCO3- KRB løsning, aliquoted og lagret ved-20 ° c. Eventuelle kjemiske kan legges på dette stadiet for en 16-24 h inkubasjonsperiode37 på apikale overflaten. Kjemikalier bør være forberedt som 0,1 x, som det endelige volumet, etter absorpsjon av overflødig væske av kulturen, vil være rundt 0,3 μL for en 6,5 mm diameter semi-gjennomtrengelig støtte.</li>
	<li>Tilsett 3 μL fargeblanding nøye (se 2,8) på apikale overflate og ruge over natten ved 37 ° c, 5% CO2.</li>
</ol>3. Kinetic måling
<ol><li>Gjenta trinn 2,1 til 2,4 for å klargjøre plate leseren.</li>
	<li>Klikk på åpne-ikonet og Velg metode filen som brukes for bakgrunns målingene</li>
	<li>I den kinetisk sløyfe panel, holde loop type som varighet og sette den til 08 timer. Endre intervalltypen til fast, og sett den til 5 minutter. Hold fluorescens intensitet panelene det samme som for bakgrunnen målinger Merk: intervalltype for bakgrunns målinger er satt til "ikke definert" for å tillate kontinuerlig lesing. For kinetisk også og kalibrering eksperimenter, er intervallet typen satt til "fast" med et intervall på 5 min. Dette kan justeres i henhold til utformingen av eksperimentet og antall forhold.</li>
	<li>Åpne skuffen for plate leseren. Sett inn luft fuktighets kassetten som er fylt med 6 mL dH2O på hver side. Sørg for at lokket og bunnen av platen er rene-hvis ikke, Rengjør med 70% etanol på et stykke vev-og Plasser platen i fuktigheten kassetten, med dekselet.</li>
	<li>Start fluorescens målingene ved å klikke på Start. Klikk OK etter at lokket på luft fuktighets kassetten er på plass.</li>
	<li>Etter n sykluser, vanligvis mellom til 12 og 24, som tilsvarer 1 til 2 timer, klikker du pause for å avbryte eksperimentet. Ta platen ut og bruke noen medikamenter/agonister basolaterally til de forskjellige prøvene. Merk: når cellene er tatt ut av plate leseren, CO2 rømming og dette vil indusere en økning i ASL pH som vist ved en dråpe i pH-sensitive fargestoff fluorescens. Dette CO2-indusert pH endre reverserer innen 10-15 min etter å plassere kulturer tilbake i plate leseren.</li>
	<li>Sett platen tilbake i fuktigheten kassetten på skuffen, omplassere fuktigheten kassett lokket og klikk Fortsett for å ytterligere registrere ASL pH og overvåke effekten av narkotika/AGONISTER på ASL pH.</li>
</ol>4. in situ pH-kalibrering
<ol><li>Ta platen ut av plate leseren.</li>
	<li>Aspirer den basolateral medium/løsning.</li>
	<li>Tilsett 750 μL og 1 μL av svært bufrede standard kurver til det basolateral rommet og den apikale overflaten. Merk: svært bufrede standard kurve løsninger inneholder (i mM) NaCl (86), KCl (5), CaCl2 (1,2), MgCl2 (1,2), NaHEPES eller MES eller Tris (100 mm). Bruk MES til buffer løsninger med en pH lavere enn 7, NaHEPES for løsninger av pH 7-7.5 og Tris for løsning med pH 8. Klem pH til ønsket verdi ved hjelp av HCl.</li>
	<li>Slå av CO2 på plate leseren eller sett den til 0,1% og Plasser platen tilbake i luft fuktighets kassetten.</li>
	<li>Sett opp plate leseren med de samme parametrene som beskrevet tidligere, men uten CO2 som i trinn 3,2.</li>
	<li>Start fluorescens opplesninger, hver 5 min for 1-1.5 h.</li>
</ol>5. evaluering av effekten av farge konsentrasjon og suspensjon volum på kalibreringsdata
<ol><li>Forbered nok pH-sensitive og ufølsom fargestoff blanding for å registrere fluorescens på minimum 4 forskjellige pH-verdier i 3 forskjellige volumer. Merk: her bland 1 ble klargjort med 26 μL av pH-sensitive (1 mg/mL) og 2,6 μL av pH-ufølsom (10 mg/mL) og bland 2 med 13 μL av pH-sensitive (1 mg/mL) og 1,3 μL av pH-ufølsom (10 mg/mL).</li>
	<li>Distribuer 2,2 μL eller 1,1 μL av Mix 1 eller 2, henholdsvis i 12 brønner av en 96 brønn plate og Legg til nok kalibreringsløsninger for å oppnå endelig volum på 50, 100 eller 200 μL og bland godt. Merk: i dette oppsettet vil fluorescens tellinger bli registrert for konsentrasjoner av fargestoffer på 5 μg/mL (i 200 μL), 10 μg/mL (i 100 eller 200 μL), 20 μg/mL (i 50 eller 100 μL) eller 40 μg/mL (i 50 μL).</li>
	<li>Vri plate leseren på, Still inn temperaturen til 37 ° c og sett inn platen i plate leseren. Ikke slå på CO2 -kontrolleren. Merk: siden dette er et kort eksperiment og bare krever nok tid til å likevekt temperaturen, er det ikke nødvendig med luft fuktighets kassetten.</li>
	<li>Juster z-posisjonen og få for 96 brønn platen, og bruk de samme parametrene som for eksperimentet som gjøres med halvgjennomtrengelig støtte.</li>
</ol>6. data analyse
<ol><li>Lagre alle data i regneark, og Opprett en ny fil.</li>
	<li>I bakgrunns filen, Velg alle Mean data for hver prøve/betingelse for begge bølgelengder, kopiere og lime inn i den nye filen. Beregn gjennomsnittlig bakgrunn for hver brønn og hver bølgelengde.</li>
	<li>Gjenta dette med kalibrerings-og kinetisk data og subtrahere bakgrunnen fra hvert datapunkt for hver bølgelengde.</li>
	<li>For hvert tids punkt og hver prøve, beregne forholdet mellom pH-sensitive og pH-ufølsom fluorescens</li>
	<li>Hvis alle prøvene ble innhentet fra en individuell giver, beregne gjennomsnittet av prosenter på hvert tidspunkt av kalibreringskurven Merk: det er viktig å generere så mange kalibrerings kurver som donorer eller basolateral løsninger. Faktisk kan disse parametrene påvirke bakgrunnen opplesninger eller absorpsjonshastigheten av væsken, som igjen vil påvirke fargestoff konsentrasjon og derfor beregnet pH.</li>
	<li>For hvert tidspunkt, generere en standard kurve fra prosenter, plotting kjente pH-verdier på x-aksen og prosenter på y-aksen.</li>
	<li>Bestemme tids punktet hvor prosenter er stabile, passer en lineær regresjon linje og få ligningen for denne linjen.</li>
	<li>Fra kinetisk data, beregne pH for hver gang punkt og plotte pH på y-aksen og tiden på x-aksen Merk: hvile/basal pH kan beregnes ved snitt datapunkter over stabil måling av pH før tilsetning av noen Agonistiske eller andre inngrep. Effekten av en Agonistiske kan karakteriseres ved å beregne forskjellen i pH før og etter (en viss tid) behandlingen eller ved å montere en ikke-lineær kurve til datapunktene rett etter intervensjonen. Dette vil gi ytterligere informasjon om t1/2 og maksimal verdi. Til slutt, kan satsene for forsuring eller alkalinization også fås fra skråningen av en rett linje montert på de første punktene etter intervensjon.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+ion+transport.+Part+one.">Human airway ion transport. Part one.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 150 (1), 271-281 (1994).</li><li>Roomans, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+airway+surface+liquid+height+and+mucus+transport+by+fluorescence+microscopy,+and+of+ion+composition+by+X-ray+microanalysis.">Measurements of airway surface liquid height and mucus transport by fluorescence microscopy, and of ion composition by X-ray microanalysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 3, 135-139 (2004).</li><li>Haq, I. J., Gray, M. A., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+surface+liquid+homeostasis+in+cystic+fibrosis:+pathophysiology+and+therapeutic+targets.">Airway surface liquid homeostasis in cystic fibrosis: pathophysiology and therapeutic targets.</a> Thorax. 71 (3), 284-287 (2016).</li><li>Martin, S. L., Saint-Criq, V., Hwang, T. C., Csanady, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+as+targets+to+treat+cystic+fibrosis+lung+disease.">Ion channels as targets to treat cystic fibrosis lung disease.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2S), S22-S27 (2018).</li><li>Garland, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+pH-dependent+mucosal+dehydration+in+cystic+fibrosis+airways.">Molecular basis for pH-dependent mucosal dehydration in cystic fibrosis airways.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15973-15978 (2013).</li><li>Torres, I. M., Patankar, Y. R., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+exacerbates+in+vivo+IL-1-dependent+inflammatory+responses+and+neutrophil+recruitment+during+pulmonary+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Acidosis exacerbates in vivo IL-1-dependent inflammatory responses and neutrophil recruitment during pulmonary Pseudomonas aeruginosa infection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (2), L225-L235 (2018).</li><li>Berkebile, A. R., McCray, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+airway+surface+liquid+pH+on+host+defense+in+cystic+fibrosis.">Effects of airway surface liquid pH on host defense in cystic fibrosis.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 52, 124-129 (2014).</li><li>Tang, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+increases+airway+surface+liquid+viscosity+in+cystic+fibrosis.">Acidic pH increases airway surface liquid viscosity in cystic fibrosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 879-891 (2016).</li><li>Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+impaired+bicarbonate+secretion+and+mucoviscidosis.">Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis.</a> Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).</li><li>Hunt, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+airway+acidification.+Implications+for+asthma+pathophysiology.">Endogenous airway acidification. Implications for asthma pathophysiology.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161, 694-699 (2000).</li><li>Kostikas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+in+expired+breath+condensate+of+patients+with+inflammatory+airway+diseases.">pH in expired breath condensate of patients with inflammatory airway diseases.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 165 (10), 1364-1370 (2002).</li><li>Ojoo, J. C., Mulrennan, S. A., Kastelik, J. A., Morice, A. H., Redington, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+breath+condensate+pH+and+exhaled+nitric+oxide+in+allergic+asthma+and+in+cystic+fibrosis.">Exhaled breath condensate pH and exhaled nitric oxide in allergic asthma and in cystic fibrosis.</a> Thorax. 60 (1), 22-26 (2005).</li><li>Cho, D. Y., Hajighasemi, M., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+secretion+in+freshly+excised+sinonasal+mucosa+from+asthma+and+sinusitis+patients.">Proton secretion in freshly excised sinonasal mucosa from asthma and sinusitis patients.</a> American Journal of Rhinology &amp; Allergy. 23 (6), e10-e13 (2009).</li><li>Cho, D. Y., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+and+base+secretion+in+freshly+excised+nasal+tissue+from+cystic+fibrosis+patients+with+DeltaF508+mutation.">Acid and base secretion in freshly excised nasal tissue from cystic fibrosis patients with DeltaF508 mutation.</a> International Forum of Allergy &amp; Rhinology. 1 (2), 123-127 (2011).</li><li>Coakley, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+surface+liquid+pH+regulation+by+cultured+cystic+fibrosis+bronchial+epithelium.">Abnormal surface liquid pH regulation by cultured cystic fibrosis bronchial epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 16083-16088 (2003).</li><li>Pezzulo, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+airway+surface+pH+impairs+bacterial+killing+in+the+porcine+cystic+fibrosis+lung.">Reduced airway surface pH impairs bacterial killing in the porcine cystic fibrosis lung.</a> Nature. 487 (7405), 109-113 (2012).</li><li>Shah, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+acidification+initiates+host+defense+abnormalities+in+cystic+fibrosis+mice.">Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice.</a> Science. 351 (6272), 503-507 (2016).</li><li>Saint-Criq, V., Gray, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CFTR+in+epithelial+physiology.">Role of CFTR in epithelial physiology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (1), 93-115 (2017).</li><li>. ECFS Patient Registry Annual Data Report Available from: <a target="_blank" href="https://www.ecfs.eu/sites/default/files/general-content-images/working-groups/ecfs-patient-registry/ECFSPR_Report2016_06062018.pdf">https://www.ecfs.eu/sites/default/files/general-content-images/working-groups/ecfs-patient-registry/ECFSPR_Report2016_06062018.pdf</a> (2016)</li><li>. Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry Annual Data Report 2017 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cff.org/Research/Researcher-Resources/Patient-Registry/2017-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf">https://www.cff.org/Research/Researcher-Resources/Patient-Registry/2017-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf</a> (2017)</li><li>Abou Alaiwa, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonates+with+cystic+fibrosis+have+a+reduced+nasal+liquid+pH;+a+small+pilot+study.">Neonates with cystic fibrosis have a reduced nasal liquid pH; a small pilot study.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 13 (4), 373-377 (2014).</li><li>Abou Alaiwa, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ivacaftor-induced+sweat+chloride+reductions+correlate+with+increases+in+airway+surface+liquid+pH+in+cystic+fibrosis.">Ivacaftor-induced sweat chloride reductions correlate with increases in airway surface liquid pH in cystic fibrosis.</a> JCI Insight. 3 (15), (2018).</li><li>McShane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+surface+pH+in+subjects+with+cystic+fibrosis.">Airway surface pH in subjects with cystic fibrosis.</a> European Respiratory Journal. 21 (1), 37-42 (2003).</li><li>Schultz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+surface+liquid+pH+is+not+acidic+in+children+with+cystic+fibrosis.">Airway surface liquid pH is not acidic in children with cystic fibrosis.</a> Nature Communications. 8 (1), 1409 (2017).</li><li>Abou Alaiwa, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+tromethamine+as+inhaled+therapy+to+treat+CF+airway+disease.">Repurposing tromethamine as inhaled therapy to treat CF airway disease.</a> JCI Insight. 1 (8), (2016).</li><li>Ngamtrakulpanit, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Intrinsic+Airway+Acidification+in+Pulmonary+Tuberculosis.">Identification of Intrinsic Airway Acidification in Pulmonary Tuberculosis.</a> Global Journal of Health Science. 2 (1), 106-110 (2010).</li><li>Tate, S., MacGregor, G., Davis, M., Innes, J. A., Greening, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airways+in+cystic+fibrosis+are+acidified:+detection+by+exhaled+breath+condensate.">Airways in cystic fibrosis are acidified: detection by exhaled breath condensate.</a> Thorax. 57 (11), 926-929 (2002).</li><li>Jayaraman, S., Song, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+surface+liquid+pH+in+well-differentiated+airway+epithelial+cell+cultures+and+mouse+trachea.">Airway surface liquid pH in well-differentiated airway epithelial cell cultures and mouse trachea.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 281 (5), C1504-C1511 (2001).</li><li>Jayaraman, S., Song, Y., Vetrivel, L., Shankar, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+fluorescence+measurement+of+airway-surface+liquid+depth,+salt+concentration,+and+pH.">Noninvasive in vivo fluorescence measurement of airway-surface liquid depth, salt concentration, and pH.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (3), 317-324 (2001).</li><li>Lennox, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP12A+promotes+mucus+dysfunction+during+Type+2+airway+inflammation.">ATP12A promotes mucus dysfunction during Type 2 airway inflammation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2109 (2018).</li><li>Song, Y., Thiagarajah, J., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+and+chloride+concentrations,+pH,+and+depth+of+airway+surface+liquid+in+distal+airways.">Sodium and chloride concentrations, pH, and depth of airway surface liquid in distal airways.</a> The Journal of General Physiology. 122 (5), 511-519 (2003).</li><li>Thiagarajah, J. R., Song, Y., Haggie, P. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+CFTR+inhibitor+produces+cystic+fibrosis-like+submucosal+gland+fluid+secretions+in+normal+airways.">A small molecule CFTR inhibitor produces cystic fibrosis-like submucosal gland fluid secretions in normal airways.</a> FASEB Journal. 18 (7), 875-877 (2004).</li><li>Garnett, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycaemia+and+Pseudomonas+aeruginosa+acidify+cystic+fibrosis+airway+surface+liquid+by+elevating+epithelial+monocarboxylate+transporter+2+dependent+lactate-H(+)+secretion.">Hyperglycaemia and Pseudomonas aeruginosa acidify cystic fibrosis airway surface liquid by elevating epithelial monocarboxylate transporter 2 dependent lactate-H(+) secretion.</a> Scientific Reports. 6, 37955 (2016).</li><li>Gorrieri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goblet+Cell+Hyperplasia+Requires+High+Bicarbonate+Transport+To+Support+Mucin+Release.">Goblet Cell Hyperplasia Requires High Bicarbonate Transport To Support Mucin Release.</a> Scientific Reports. 6, 36016 (2016).</li><li>Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+epithelial+cell+models+for+cystic+fibrosis+research.">Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research.</a> Methods in Molecular Biology. 742, 285-310 (2011).</li><li>Fulcher, M. L., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+and+tracheo-bronchial+respiratory+epithelial+cell+culture.">Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. , 109-121 (2013).</li><li>Matsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+periciliary+liquid+layer+depletion,+not+abnormal+ion+composition,+in+the+pathogenesis+of+cystic+fibrosis+airways+disease.">Evidence for periciliary liquid layer depletion, not abnormal ion composition, in the pathogenesis of cystic fibrosis airways disease.</a> Cell. 95 (7), 1005-1015 (1998).</li><li>Ahmadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+profiling+of+CFTR+modulators+in+patient-derived+respiratory+epithelia.">Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia.</a> npj Genomic Medicine. 2, 12 (2017).</li><li>Delpiano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esomeprazole+Increases+Airway+Surface+Liquid+pH+in+Primary+Cystic+Fibrosis+Epithelial+Cells.">Esomeprazole Increases Airway Surface Liquid pH in Primary Cystic Fibrosis Epithelial Cells.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1462 (2018).</li><li>Gillies, R. J., Liu, Z., Bhujwalla, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=31P-MRS+measurements+of+extracellular+pH+of+tumors+using+3-aminopropylphosphonate.">31P-MRS measurements of extracellular pH of tumors using 3-aminopropylphosphonate.</a> American Journal of Physiology. 267 (1 Pt 1), C195-C203 (1994).</li><li>Tannock, I. F., Rotin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+pH+in+tumors+and+its+potential+for+therapeutic+exploitation.">Acid pH in tumors and its potential for therapeutic exploitation.</a> Cancer Research. 49 (16), 4373-4384 (1989).</li><li>Wike-Hooley, J. L., Haveman, J., Reinhold, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+tumour+pH+to+the+treatment+of+malignant+disease.">The relevance of tumour pH to the treatment of malignant disease.</a> Radiotherapy and Oncology. 2 (4), 343-366 (1984).</li></ol>

MB: ikke relatert til dette arbeidet: etterforsker-ledede forskningsstipend fra Pfizer og Roche Diagnostics; høyttaler avgifter betalt til Newcastle University fra Novartis, Roche Diagnostics og TEVA. Reiseutgifter til pedagogiske møter fra Boehringer Ingelheim og Vertex Pharmaceuticals.

Her gir vi en detaljert protokoll for dynamisk måling av ASL pH i primære menneskelige luftveier epitelceller. Kritiske skritt inkluderer å vaske mucus av apikale overflaten av cellene, måle og trekke bakgrunnen ved hjelp av de samme parametrene som i eksperimentet, optimalisere z-posisjon og få og utføre en in situ pH kalibrering.
Det første skrittet for å vaske cellene er avgjørende som et tykt lag av Slim kan (i) hindre at fargestoffer når periciliary laget (PCL) og (II) forsinke eller hindre påvisning av endringer i fluorescens som svar på agonister/hemmere. Vår metode ble utviklet for å studere hvordan primære hAECs modulert aktiviteten til HCO3- og H+ transportører i Response til agonister. Mens det vil være interessant å undersøke hvordan endringer i PCL pH knyttet til endringer i Slim pH, videre utvikling av denne protokollen er nødvendig, inkludert bruk av ulike molekylvekt-dextrans til differensielt målrette 2 lag og z-skanner gjennom hele ASL.
Bakgrunns måling er et annet viktig trinn i denne protokollen. Den apikale overflaten av fullt differensiert primærluft veiene prolifererende er sjelden helt flatt som vil påvirke lyset banen og derfor bakgrunnen. Sikre at bakgrunnen målingene er utført i de samme lokale punktene i brønnene som under eksperimentet er avgjørende for reproduserbarhet og stabilitet av opptakene.
Optimalisering av z-posisjon og gevinst er nødvendige skritt som må settes opp for hver annen konsentrasjon av fluorescerende fargestoff som skal brukes. Dette vil hindre høy variasjon i eksperimentet. Når satt opp, vår analysen gir stabile og reproduserbar resultater. En av grunnene til dette er at fargestoffer er lagt på apikale overflate på cellene i et lite volum av væske som er lett reabsorberes av epitel, etterlot en homogenously merket ASL. En annen metode for å flekk på ASL, som kan være like vellykket, brukes tørt pulver eller en "suspensjon" i PFC. selv om dette kan være tidsbesparende (som eksperimenter er vanligvis utføres innen 2 h), er det usannsynlig at de tørre fargestoffer fullt solubilize i ASL og dermed kan form klumper. Dermed ulike konsentrasjoner av pH-sensitive fargestoff vil bli funnet over overflaten av epitelceller.
PH-kalibreringen i situ er et viktig skritt for å oppnå nøyaktige, reproduserbar resultater. Som vist og forklart i resultatene delen, forskjeller i ASL volumer vil påvirke fluorescens teller og derfor interpolert pH-verdier (figur 2 og Figur 3). Mens ulike grupper har tidligere publisert ASL pH målinger, et bredt spekter av verdier har blitt innhentet selv mellom ulike studier utgitt av samme gruppe8,17. Vi tror at resultatene vil bli mer reproduserbar ved å utføre in situ kalibreringer. Sammenlignet med andre pH kalibrering teknikker, som bruker høy K+/nigericin (eller flere ionophores) metode for å generere standard Curve28,29,30, analysen presentert her har den fordelen at , så lenge hvert trinn er utført i et sikkerhetskabinett, kan cellene som brukes til ASL pH vaskes, oppbevares og gjenbrukes for andre eksperimenter, forutsatt at behandlingene som utføres ikke irreversibelt påvirker epitelcellene.
Utvikling og optimalisering av denne analysen har gitt reproduserbar resultater, og vi tror denne metoden vil hjelpe andre grupper med sin ASL pH-måling. Imidlertid har denne teknikken også noen begrensninger på grunn av oppsett og hvilken type celler som brukes. Overvåking ASL pH over en lengre tidsperiode enn det som presenteres her (> 8-10 h) kan vise seg å være vanskelig som en langsiktig høy luftfuktighet miljøet kan skade utstyret og det faktum at de fleste plate lesere bare tilbyr muligheten til å registrere kinetisk opplesninger over en viss tid (vanligvis 24 h). Bruk av fullt differensiert primære hAECs er avgjørende på den måten at ulike stadier av differensiering vil påvirke uttrykk for HCO3- og H+ transportører. Men det er nesten ingen mulighet til å presist kontrollere volumet av ASL i celler dyrket under tynne film forhold. Som det fremgår av protokollen og resultatene seksjoner, endringer i volumet vil påvirke fluorescens ratio og det er dessverre nødvendig å anta at i celler dyrket fra en enkelt person, seeded på samme dag på forskjellige semi-gjennomtrengelig støtter, ASL volumer vil være det samme. Som følge av denne begrensningen, vil enhver Agonistiske eller hemmer som vil påvirke væske sekresjon eller absorpsjon påvirke ASL volum og antagelig den fluorescens prosenter. Men i analysen vår, kalibreringen kurven er utført på slutten av eksperimentet, slik at vi kan anta at disse endringene i volum vil påvirke kalibrering prosenter på samme måte som under kinetisk eksperimentet. Av denne grunn anbefaler vi grupper som ville være interessert i å utvikle denne analysen, for å bruke minst 2-3 replikerer per tilstand testet da dette vil gi rom for etablering av en standard kurve for hver tilstand.
Her presenterer vi en enkel, semi-automatisert, analysen som gjør at sanntids måling av slimhinne overflaten pH under tynn-film forhold. Den har kapasitet til å undersøke dynamisk pH-respons i mange kulturer i en nesten samtidig måte som gjør at Inter-og intra-donor sammenligninger. Oppskalering denne metoden til en 96 brønn plateformat ved hjelp av polarisert system (HTS 96 brønn plater)38 ville gi enda høyere gjennomstrømning som et medikament Discovery analysen. Videre har vi vist hvordan denne teknikken kan brukes til å studere den akutte effekten av agonister på ASL pH og vi har allerede publisert at denne metoden kan brukes til å studere den langsiktige effekten av en apikale Proton pumpen inhibitor på CF hAECs ASL39. Som pH har vist å regulere smitte, betennelser, mucus viskositet og Ion transport, identifisere molekylære mål som kan øke pH vil være verdifullt i forskningen felt av kroniske lungesykdommer og denne teknikken vil potensielt lette utvikling av narkotika screening i personlig tilpasset medisin tilnærminger. Til slutt, siden feilregulering i syre-base homeostase spiller en stor rolle i andre sykdommer, kan denne protokollen tilpasses, med optimalisering trinn, til ulike utstyr (plate lesere) og celletyper, for eksempel andre epitelceller. Ekstracellulære Surhet er en karakteristisk for kreft40,41,42 og denne analysen kan bidra til å avgjøre hvordan solide svulster produsere lav pHe eller kan brukes som en lav-gjennomstrømning narkotika screening analysen for restaurering av pH homeostase. Tilsvarende, som for kroniske luftveissykdommer, det kan også gi en plattform for utvikling av en personlig medisin tilnærming.

Luftveisepitel er dekket av en tynn (~ 10 μm) væske lag kalt luftveiene overflate væsken (ASL). Sammensetningen og dybden (hydrering) av denne ASL er strengt regulert og styrer effektiviteten av luftveis klaring ved mucociliary rulletrapp1,2,3,4. I de senere årene, betydningen av ASL H+/HCO3- innhold har blitt demonstrert av ulike grupper på grunn av sin evne til å regulere ASL hydration5, luftveiene betennelse6 og infeksjon7, 8 i tillegg til mucus viskositet8,9. Viktigere, selv om det finnes noen kontroverser, har mange studier rapportert feilregulering av luftveiene pH i kroniske luftveis sykdommer som astma10,11,12, KOLS11, bronkiektasi11, kronisk rhinosinusitis13,14 og cystisk fibrose (CF)5,9, 15,16,17, som tyder på at behandling som gjenoppretter ASL pH kan være nyttig å behandle flere typer kroniske luftveissykdommer. CF er den vanligste autosomal resessivt genetisk sykdom i kaukasiske populasjoner og skyldes mutasjoner i CF transmembrane konduktans regulator (CFTR) genet. Dette genet koder en anion (HCO3- og CL-) kanal som spiller en avgjørende rolle i ion og Fluid transport og homeostase over prolifererende18. Selv om CF er en multi-organ sykdom, er lunge patologi den viktigste årsaken til sykelighet og dødelighet19,20 og vurderer den primære feilen i CF er en svekket transport av CL- og HCO3-, man kan hypothesize at pH-ekstracellulære i mennesker med CF vil bli dysregulated sammenlignet med mennesker som ikke har CF. således har måling av ASL pH vært en aktuell del av CF-forskning og ulike grupper har utviklet teknikker for å måle ASL pH i CF Airways.
In vivo, luftveis pH er målt ved hjelp av ulike teknikker, fra mikro-sonder (fiberoptisk, gull eller mobidium sonder)5,21,22,23,24 til pH målinger av hoste materiale eller utåndet pusten kondensat (EBC)10,11,12,25,26,27. I forskningsfeltet i CF blir pH mye studert på grunn av dens potensielle kliniske implikasjoner. Teoretisk sett gjør luftveiene mer alkalisk kan øke bakteriell drap og forbedre mucociliary clearance og luftveiene homeostase som helhet. Men i vivo/ex vivo studier rapporterer et bredt spekter av pH-verdier, og hittil er resultatene ikke avgjørende om eksistensen av en forskjell i pH mellom ikke-CF og CF Airways. På begynnelsen av 2000-tallet, rapporterte ulike grupper pH i EBC. Inne ingen-syk holdene, pH verdier variert fra 4,6 å 8,5 bortsett fra interessant, EBC pH var grunnlegge flere syrlig i løpet av eksaserbasjoner inne folk med CF12,27. Mer nylig, in vivo målinger av ASL i mennesker og dyr modeller av CF har rapportert motstridende resultater16,17,21,22,23, 24 og det er fortsatt uklart om CF Airways er mer Sure enn ikke-CF Airways.
Som in vivo måling av lavere ASL pH har vist seg vanskelig på grunn av svært liten mengde væske lining luftveiene og potensielle tilstedeværelsen av mucus plugger i sykdom, har mange grupper slått til in vitro eksperimenter for å måle ASL pH, hovedsakelig ved hjelp av tre forskjellige Metoder. Den første tilnærmingen bruker dextran-kombinert Cell-impermeant pH-sensitive fluorescerende fargestoffer som er lagt til som et tørt pulver, enten direkte til ASL eller ved hjelp av en inert væske kalt perfluorocarbon (PFC)5,8,16 , 17 i , 28 flere , 29 flere , 30 priser og , 31 andre , 32. men, denne teknikken gir liten kontroll over den nøyaktige mengden av fargestoff som er lagt til kulturer og presenterer en risiko for fargestoff aggregater og store forskjeller i konsentrasjon mellom prøver og/eller eksperimenter og selv innenfor samme prøve . Det har også generelt vært utført med et konfokalmikroskopi mikroskop, som begrenser anvendelsen og i mange tilfeller, hindrer detaljert overvåking av flere prøver og endringer i opptaksforhold. Den andre metoden ansatt for å måle ASL pH er bruken av pH-sensitive microelectrodes. ASL pH målinger er derfor ikke avhengig av fluorescerende fargestoff konsentrasjon og bør gi mer robuste og reproduserbar resultater. Denne metoden tillater imidlertid ikke dynamisk sanntidsmålinger av ASL pH, og det er heller ikke enkelt å foreta flere avlesninger under forskjellige forhold. Det er også en arbeidsintensiv, kompleks prosess som krever spesialutstyr (microelectrode fabrikasjon/elektrofysiologisk opptaksenheter) og opplæring for innsamling av prøvene for påfølgende pH-måling og kalibrering. Videre har disse to teknikkene også vist noen uoverensstemmelser i evnen til å produsere reproduserbar resultater: ved hjelp av pH-sensitive fluorescerende Fargemetode, tang et al. rapporterte verdier av 7,35 for ikke-CF ASL og 7,0 for CF ASL8 , mens i en mer nyere papir fra samme gruppe, var ASL pH 6,9 og 6,4 for ikke-CF og CF, henholdsvis17. På en lignende måte, microelectrode målinger ga verdier av 6,4 i ikke-CF ASL og 6,1 i CF ASL i en studie fra 200315 , mens den samme gruppen rapporterte verdier av 6,7 for ikke-CF asl og 6,45 for CF ASL i en studie fra 20135. Til slutt, i den tredje tilnærmingen, forskere legge til et relativt stort volum av svakt bufret løsning på apikale (slimhinne) overflaten av kulturer, og dermed ødelegge tynne film forhold og endre ASL komposisjon, og potensielt dens regulering. pH blir så målt enten ved hjelp av pH-sensitive fluorescerende fargestoffer33, av en pH-stat titrering metode i en ussing kammer13,14, eller krever fortynnet ASL å bli fjernet fra kulturer og pH målt ved hjelp av en pH elektrode, analysator eller Litmus strimler34. En annen vanskelighet i nøyaktig måling av ASL pH er etablering av en standard kurve som er så presis som mulig. Faktisk, om målingene er utført med en elektrode som vil måle forskjellen i elektrisk potensial via en harpiks eller ved hjelp av pH-sensitive fluorescerende fargestoffer, vil begge disse tilnærmingene bli påvirket av den lokale mikromiljøet av prøvene blir Målt. Mer spesifikt, dissosiasjon konstant (KD) av fargestoffer kan variere betydelig avhengig av temperatur, ioniske styrke, viskositet samt potensielle interaksjoner av fargestoff med cellulære bestanddeler som proteiner og potensielt slim.
For å prøve å overvinne mange av disse tekniske problemene, samt å utvikle en mer dynamisk, enklere og høyere gjennomstrømming metoden, har vi etablert en in vitro teknikk som registrerer ASL pH i primære hAEC kulturer ved hjelp av en celle-impermeant pH-sensitive fluorescerende fargestoff i en standard kommersiell plate-leser. Metoden genererer reproduserbar, dynamisk, semi-automatisert, sanntidsmålinger av ASL pH i fullt differensiert 3D cellekulturer under tynne film forhold. Gjennom bruk av en fler brønn plate leser, dette semi-automatisert analysen kan gjøre nær samtidige målinger av pH for opptil 24 forhold over 12 h og kan overvåke effekten av å legge ulike agonister eller hemmere. I dette dokumentet beskriver vi metodikken i detalj og rapporterer representative resultater under positive og negative kontroll forhold som validerer teknikken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E4780-1226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.5 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFTRInh172</td>
			<td>RnD Systems (Tocris)</td>
			<td>3430</td>
			<td>Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D22910</td>
			<td>Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P10361</td>
			<td>Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>RnD Systems (Tocris)</td>
			<td>1099</td>
			<td>Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity cassette</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>30090495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader: TECAN SPARK 10M</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>30086375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal pH electrodes DJ 113</td>
			<td>VWR</td>
			<td>662-1385</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time, semi-automated fluorescent measurement of the airway surface liquid ph of primary human airway epithelial cells

I de senere årene har betydningen av slimhinne overflaten pH i luftveiene blitt fremhevet av dens evne til å regulere luftveiene overflate væske (ASL) hydrering, mucus viskositet og aktivitet av antimikrobielle peptider, viktige parametre involvert i medfødt forsvar av Lungene. Dette er av primær relevans på området kroniske luftveissykdommer som cystisk fibrose (CF) der disse parametrene er dysregulated. Mens ulike grupper har studert ASL pH både in vivo og in vitro, deres metoder rapporterer et relativt bredt spekter av ASL pH-verdier og til og med motstridende funn om eventuelle pH-forskjeller mellom ikke-CF og CF-celler. Videre deres protokoller ikke alltid gi nok detaljer for å sikre reproduserbarhet, de fleste er lav gjennomstrømning og krever dyrt utstyr eller spesialisert kunnskap til å gjennomføre, noe som gjør dem vanskelige å etablere i de fleste laboratorier. Her beskriver vi en semi-automatisert fluorescerende plate leser analysen som gjør det mulig for sanntids måling av ASL pH under tynne film forhold som nærmere likne in vivo situasjonen. Denne teknikken gjør det mulig for stabile målinger i mange timer fra flere luftveis kulturer samtidig, og enda viktigere, kan dynamiske endringer i ASL pH som svar på agonister og hemmere overvåkes. For å oppnå dette, ASL av fullt differensiert primære menneskelige luftveier epitelceller (hAECs) er beiset over natten med en pH-følsom fargestoff for å muliggjøre reabsorpsjon av overflødig væske for å sikre tynne film forhold. Etter fluorescens overvåkes i nærvær eller fravær av agonister, er pH kalibrering utføres in situ for å korrigere for volum og farge konsentrasjon. Metoden beskrevet gir de nødvendige kontrollene for å gjøre stabile og reproduserbar ASL pH målinger, som til slutt kunne brukes som et medikament funnet plattform for personlig medisin, samt tilpasset andre epitel vev og eksperimentelle forhold, for eksempel inflammatoriske og/eller Host-patogen modeller.

Teknikken beskrevet ovenfor gjør det mulig dynamisk måling av ASL pH i opptil 24 separate primære hAECs kulturer. Figur 1 viser et skjematisk av de viktigste trinnene og utstyr satt opp. De overnatter-lastet cellene er plassert i en CO2 og temperatur kontrollert plate leser der fluorescens fra dextran pH-sensitive og pH-ufølsom fargestoffer registreres hver 5 min.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig1.jpg"> Figur 1: skjematisk av ASL pH målemetode. Etter vask av kulturer og utføre en bakgrunn lesing, primære menneskelige luftveiene epitelceller (hAECs) ASL er lastet med dextran kombinert pH-sensitive og pH-ufølsom fargestoff blanding over natten på 37 ° c, 5% CO2. Dagen etter blir platen overført til en temperatur og CO2-kontrollerte plate leser og fluorescens fra begge fargestoffer er registrert over tid. Etter eksperimentet blir en in situ-kalibrering utført og data analysert og presentert som ASL pH over tid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Først undersøkte vi effekten av ulike volumer og farge konsentrasjoner på fluorescens teller og derfor på 560/495 ratio. Faktisk, formålet med å legge til pH-ufølsom til pH-sensitive fargestoff er å korrigere for variasjon i ASL lasting. Det var imidlertid viktig å teste denne antakelsen og vurdere om vi kunne bruke en standard kalibrering kurve utført i fravær av celler i en 96 brønn plate for alle eksperimenter og celletyper. Vi overvåket fluorescens teller over 1 time i 50, 100 eller 200 μL av kalibreringsløsninger (ved pH 5,5, 6,5, 7 eller 8) som inneholder 5, 10, 20 eller 40 μg/mL fargestoffer. Resultatene er presentert i figur 2a-C, og viser at for samme pH og samme konsentrasjon av fargestoffer, de rapporterte pHsens/pHins utslipp ratio (560/495 på y-aksen) varierte avhengig av volumet (figur 2a). I tillegg, på samme pH og samme volum, ulike farge konsentrasjoner gir ulike forhold verdier (figur 2b). Derfor vil endringer i volum eller farge konsentrasjon påvirke den absolutte verdien av pH beregnet ut fra utslipps forholdet. Figur 2C viser at tiden som kreves for temperatur likevekts er ca. 15-20 min. For å bekrefte effekten av farge konsentrasjon og volum på utslipps prosenter, registrerte vi fluorescens fra fargestoffer lastet i ASL av primære ikke-CF og CF hAECs in situ. Vi utførte deretter kalibreringen og analyserte resultatene ved å (1) generere en global standard kurve fra alle prøvene eller (2) generere to uavhengige standard kurver for hver celle type (ikke-CF og CF). ASL pH fra begge celle typene ble deretter plottet mot tiden (figur 3a, B) og gjennomsnitt (figur 3c). ASL pH-verdier innhentet fra en enkelt global standard kurve viste en signifikant forskjell mellom ikke-CF-og CF-kulturer (figur 3a, C) mens ASL pH ikke var signifikant forskjellig mellom CF og ikke-CF hAECs når pH ble beregnet fra uavhengige standard kurver (figur 3B, C). Disse resultatene viser viktigheten av å generere uavhengige kalibrerings kurver for hvert eksperiment og i eksperimentet, for hver donor prøve, siden når kalibrerings kurvene var gjennomsnitt sammen, høyere pHsens/pHins ratio verdier ble funnet i CF kulturer , som indikerer en mer syrlig pH (figur 3c).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig2v4.jpg"> Figur 2: optimalisering av pH-kalibrering in vitro. Ulike volumer av løsninger av kjente pH og inneholder ulike fargestoff konsentrasjoner ble lastet opp på en 96 brønn plate og fluorescens ble spilt inn over 1 t. effekt av volum (a) og fargestoff konsentrasjon (B) på fluorescens prosenter. Prosenter ble plottet mot pH for tid-punkt 24 min. (C) stigningstallet for endring i fluorescens ble beregnet for hver løsning og plottet som en funksjon av tid (i min). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig3.jpg"> Figur 3: optimalisering av analyse av pH-kalibrering på primære hAECs in situ. (A) representative spor av ASL pH innhentet fra en enkelt standard kurve snitt data fra ikke-CF og CF kulturer. (B) representative spor av ASL pH innhentet fra uavhengige standard kurve utført på ikke-CF-eller CF-kulturer. Hvert datasett ble beregnet fra sin egen kalibrerings kurve. (C) evaluering av forskjellene i ASL pH mellom ikke-CF og CF-kulturer som en funksjon av hvordan kalibreringen ble utført. Data representerer gjennomsnittet ± SEM fra n = 3 eksperimenter, 2-veis ANOVA, Sidak ' s Multiple sammenligninger test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
For å ytterligere validere vår teknikk, vi da krevde en positiv kontroll for å demonstrere at teknikken var i stand til å oppdage en "forventet" endring i ASL pH. Som tilstedeværelsen av en mer syrlig ASL i CF-celler er fortsatt kontroversielt, brukte vi cAMP Agonistiske Forskolin, som en positiv kontroll tilstand, for å stimulere HCO3- sekresjon gjennom CFTR. Forventede resultater ville vise en Forskolin-indusert alkalinisation av ASL i ikke-CF-celler som ville være stort sett redusert eller avskaffet i CF celler avhengig av alvorlighetsgraden av mutasjoner. Figur 4a viser representative spor av ASL pH i ikke-CF og CF-celler over tid og figur 4b viser gjennomsnittlig data for ASL pH før og etter behandling med Forskolin i begge celletyper. Vi kan få forskjellig informasjon fra disse resultatene. For det første, som allerede vist i figur 3B, C, var den hvile ASL pH ikke annerledes mellom ikke-CF og CF-prolifererende. For det andre, den første 3-4 tid-poeng etter pause eksperimentet å behandle cellene med Forskolin, viste en stor økning i pH som utvinnes innen ~ 15 min. Dette var på grunn av fall i CO2 konsentrasjon mellom plate leseren (5%) og vevet kultur sikkerhet kabinett (~ 0%). Ifølge Henderson Hasselbalch ligningen, en pH på 7 i en 5% co2 miljø tilsvarer en konsentrasjon av HCO3- av ~ 9,3 mm. Når cellene er fjernet fra plate leseren, vil en dråpe i CO2 konsentrasjon til 0% teoretisk føre til en økning i pH på > 8. Figur 4a viser at ASL pH økte til ~ 7,8 som kan forklares ved forløp av tid omplassering av platen i plate leseren (dvs. i et 5 % co2 -miljø). Til slutt, som spådd, tillegg av basolateral 10 μM Forskolin (FSK) betydelig økt ASL pH i ikke-CF kulturer bare. Som det har blitt vist av ulike grupper at det finnes en forskjell i steady-state ASL pH mellom CF og ikke-CF prolifererende, ønsket vi å videre undersøke tilsynelatende fravær av en pH-forskjell i våre eksperimenter og rollen som CFTR. For å gjøre dette vi pre-inkubert ikke-CF kulturer med den spesifikke CFTR inhibitor, CFTRinh172 (172). Som det fremgår av protokoll delen 2,8, ble fargestoff blandingen klargjort som angitt ovenfor, og inhibitor ble tilsatt ved en konsentrasjon på 0,1 X = 2 μM. Ifølge litteraturen, ASL høyde av ikke-CF-celler er ca 10 μm. I en semi-gjennomtrengelig støtte av 6,5 mm diameter, er det teoretiske volumet av ASL derfor π × 3,252 = 0,3 μL. Ved å tilsette 3 μL av fargestoff + 172 ved 2 μM, vil konsentrasjonen av hemmer, etter absorpsjon av overflødig væske, teoretisk være 20 μM (1x, ønsket konsentrasjon). Representative spor i figur 4c og gjennomsnittlig oppsummering i figur 4d viser at 172 ikke reduserte hviler ASL pH, men gjorde hindre Forskolin-indusert økning i ASL pH, og dermed bekrefter våre resultater innhentet fra ikke-CF versus CF kulturer og ytterligere validere vår teknikk.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig4v5.jpg"> Figur 4: dynamisk ASL pH-måling som svar på CFTR-aktivering av Forskolin. (A) representative spor av effekten av Forskolin (FSK, 10 μM) på KINETICS av ASL pH over tid i ikke-CF og CF hAECs. Data representerer gjennomsnittet ± SEM fra n = 3 eksperimenter. (B) oppsummering av effekten av FSK på ASL pH i ikke-CF og CF-kulturer. Data representerer gjennomsnittlig ± SD fra n = 69 ikke-CF-kulturer og 35 CF-kulturer (2-veis ANOVA, Sidak flere sammenligninger test). (C) representative spor av effekten av CFTRinh172 (172, 20 μM) på FSK-indusert økning i ASL pH i ikke-CF hAECs. Data representerer gjennomsnittet ± SEM fra n = 5 eksperimenter. (D) oppsummering av effekten av 172 på FSK-indusert ALKALINISATION av ASL i ikke-CF kulturer. Data representerer gjennomsnittet ± SEM fra n = 5 eksperimenter (2-veis ANOVA, Sidak flere sammenligninger test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Til slutt, som nevnt i protokollen delen 6,8, kan utbredelsen av forsuring/alkalinization beregnes ved å montere en lineær regresjon til den første tid-poeng etter intervensjon. Figur 5a viser at fjerning av basolateral HCO3- inneholdende løsning (HCO3- KRB) og erstatte den med en HEPES bufret løsning, i fravær av co2, indusert en markert forsuring av ASL. Dette er i samsvar med mangelen på HCO3- hemme transepitelial HCO3- sekresjon, som gjør at konstituerende Proton sekresjon av disse luftveis celler å stadig redusere ASL pH15, 17. Interessant nok var den første frekvensen av forsuring av ikke-CF-celler betydelig tregere enn CF-kulturer (figur 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig5.jpg"> Figur 5: dynamiske endringer i ASL pH som svar på HCO3- fjerning. (A) representative spor som viser effekten av HCO3- fjerning på Kinetics av ASL pH over tid i ikke-CF og CF-hAECs. Den opprinnelige utbredelsen av forsuring ble innhentet via skråningen av en rett linje montert til 7 tid-poeng etter HCO3- fjerning. Data representerer midlene ± SEM fra n = 6 og 7 eksperimenter på henholdsvis ikke-CF og CF-kulturer. (B) oppsummering av de første tallene for forsuring etter HCO3- fjerning. Data representerer midlene ± SEM fra n = 6 og 7 eksperimenter på henholdsvis ikke-CF-og CF-kulturer (mann-Whitney-test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells at JoVE.com

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-automatisert fluorescerende måling av luftveiene overflaten flytende pH av primær menneskelige Luftveisepitel celler

Vi presenterer en protokoll for å gjøre dynamiske målinger av luftveiene overflaten flytende pH under tynne film forhold ved hjelp av en plate-leser.

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Vår protokoll er den første som tillater dynamisk måling av luftveisoverflatevæske, eller ASL pH, i sanntid under både hvile og etter agonist- eller inhibitorbehandling. Denne metoden bidrar til å identifisere iderkanaler og transportører som er involvert i ekstracellulær pH-regulering og kan brukes på andre cellesystemer der dette er viktig, for eksempel kreft. Nå sammenlignet med tidligere publiserte metoder, er denne nye teknikken relativt enkel å utføre.Det krever ikke spesialisert utstyr. Og kan gjøre ASL pH-målinger samtidig i flere kulturer under luftvæskegrensesnitt, eller tynnfilmforhold. Viktigere, denne nye teknikken har potensial til å vurdere effekten av nye terapeutiske midler, ikke bare for cystisk fibrose, men også for andre kroniske luftveissykdommer, som astma og KOLS.Etter minst 28 dager med kultur, vask den adikiske overflaten av en menneskelig luftveisepitelcellekultur med 150 mikroliter bikarbonat som inneholder Krebs bufferløsning i 20 minutter på cellekulturinkubatoren. På slutten av inkubasjonen, bruk en steril glasspipet med en steril P200 pipetspiss knyttet til en aspirasjonspumpe, for å forsiktig aspirere vasken uten å forstyrre epitelet. Det bør være så lite væske igjen på den a apical overflaten som mulig for å gjenopprette luftvæskegrensesnittet.Deretter returnerer cellene til cellekulturinkubatoren i 30 minutter. Hvis du vil utføre en bakgrunnsmåling, slår du på plateleseren og datamaskinen. Når du har åpnet dashbordet, klikker du På Spark 10M og setter temperaturkontrollen til 37 grader Celsius.Åpne deretter gasskontrollen og sett karbondioksidet til 5%Når temperaturen og gassen har nådd sine mål, åpner du plateleserskuffen og setter inn en fuktighetskassett fylt med seks milliliter destillert vann på hver side inn i leseren. Kontroller at lokket og bunnen av cellekulturplaten er rent og plasser platen på fuktighetskassetten, sett lokket på igjen og lukk skuffen. Åpne redigeringsprogrammet for sparkmetode, velg riktig platemal og velg brønnene som skal overvåkes under eksperimentet.Legg til et temperatur- og karbondioksidkontrollpanel og sett panelene til henholdsvis 37 grader Celsius og 5 %. Merk deretter av for venting på temperatur-/gassbokser. Legg til et kinetisk løkkepanel, og velg varigheten som løkketype.Angi varigheten til fem minutter, og angi intervalltypen for eksperimentet som ikke er definert, for å få en kontinuerlig avlesning. Innenfor den kinetiske sløyfen bruker du dra- og slippfunksjonen til å legge til to fluorescensintensitetspaneler som vil bli individuelt satt for pH-sensitive og pH-ufølsomme fluorescerende fargestoffer. Sett eksitasjons- og utslippsbølgelengden til henholdsvis 560 og 590 nanometer for det pH-sensitive fargestoffet.Og henholdsvis 495 og 520 nanometer for pH-ufølsom fargestoff. Sett antall blink til 30 og z-posisjonen til 33 200 for hver fluorofor. Sett flere lese per brønn til brukerdefinert, som en tre og tre etter sirkel med en kantlinje på 4, 750 mikrometer.Klikk start for å starte bakgrunnsmålingsavlesningen og klikk ok, for å bekrefte at lokket på fuktighetskassetten er på plass. På slutten av målingen, overføre platen fra plateleseren til et vev kultur sikkerhetsskap og legge til tre mikroliter av nylaget dextran-skrevet fluorescerende fargestoff løsning til den alektiske overflaten av cellene. Deretter returnerer platen til cellekulturinkubatoren over natten.For kinetics måling, åpne metodefilen som brukes for bakgrunnsmålinger. Når alle parametrene er angitt, åpner du plateleserskuffen og setter inn fuktighetskassetten. Plasser den rene platen i fuktighetskassetten med dekselet, og klikk start for å starte fluorescensavlesningene.Klikk deretter ok, for å bekrefte at lokket på fuktighetskassetten er på plass. Etter minst 12 sykluser klikker du pause for å avbryte eksperimentet og fjerner platen for å basolateralt bruke narkotika eller agonister på de riktige prøvene. Sett platen tilbake til fuktighetskassetten på brettet og sett fuktighetskassettlokket, før du klikker fortsett, for å registrere ASL pH ytterligere og overvåke effekten av behandlingen.For in situ pH-kalibrering, fjern platen fra plateleseren og aspirer basolateral oppløsning. Tilsett 750 mikroliter med svært bufret standard kurveløsning i basolateralrommet og ett mikroliter oppløsning til den aktuelle overflaten. Slå av karbondioksidet på plateleseren og sett platen tilbake til fuktighetskassetten.Sett deretter plateleseren med samme parametere som demonstrert, men uten karbondioksid, og start fluorescensavlesningene hvert femte minutt i en til en og en halv time. For dataanalyse velger du alle gjennomsnittsdataene for hvert eksempel, og eller betingelse for begge bølgelengdene i bakgrunnsfilen og kopierer og limer inn dataene i en ny fil. Beregn deretter gjennomsnittlig bakgrunn for hver brønn og hver bølgelengde.Når du har kopiert og limt inn kalibreringen og kinetiske data på samme måte, trekker du bakgrunnen fra hvert datapunkt for hver bølgelengde. For hvert tidspunkt og hver prøve beregner du forholdet mellom pH-sensitive og pH-ufølsom fluorescens. For hvert tidspunkt genererer du en standardkurve fra forholdene og tegner de kjente pH-verdiene på x-aksen og forholdene på y-aksen.Bestem tidspunktet da forholdene er stabile, tilpass en lineær regresjonslinje og få tak i formelen for denne linjen. Deretter beregner du pH for hvert tidspunkt og plotter pH på y-aksen og tiden på x-aksen. I dette representative foreløpige eksperimentet uten celler ved samme pH og samme konsentrasjon var de pH-sensitive og pH-ufølsomme utslippsforholdene forskjellige avhengig av fargevolumet.I tillegg, ved samme pH og samme volum, ga forskjellige fargekonsentrasjoner forskjellige forholdsverdier, noe som indikerer at endringer i volum- eller fargekonsentrasjonen påvirker den absolutte verdien av pH beregnet ut fra utslippsforholdet. I tillegg er tiden som kreves for temperaturlikevekt ca. 15 til 20 minutter uavhengig av fargevolum eller konsentrasjon. ASL pH-verdier hentet fra en enkelt global standardkurve viser en betydelig forskjell mellom ikke-cystisk fibrose og cystisk fibrosekulturer.Mens ASL pH ikke er signifikant forskjellig mellom cystisk fibrose og ikke-cystisk fibrose humane luftveisepitelceller når pH beregnes fra uavhengige standardkurver. Derfor er det viktig å generere uavhengige kalibreringskurver for hvert eksperiment og i hvert eksperiment, for hver donorprøve, som når kalibreringskurvene er i gjennomsnitt sammen, finnes høyere pH-sensitive, pH-ufølsomme forholdsverdier i cystisk fibrosekulturer som indikerer en surere pH. Som forventet øker tillegget av basolateral forskolin betydelig ASL pH i ikke-cystisk fibrosekulturer bare.Som disse cellene har blitt holdt under steril tilstand, de kan vaskes, re-matet og brukes noen dager senere for fremtidige eksperimenter. Alle biologiske menneskelige prøver bør betraktes som potensielt farlige. Så sørg for å bruke riktig nivå av innesperring og personlig verneutstyr avhengig av prøvene dine.Det er viktig å utføre bakgrunnsmålingene og pH-kalibreringene for hvert sett med prøver for å redusere variabilitet mellom donorer og forbedre nøyaktigheten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rensing av biotinylerte celleoverflateproteiner fra<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epiteliale gutceller

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Sporing av DNA-fragmenter i sanntid etter Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatisert Biopanning av bakteriell vise bibliotekene for peptid affinitet reagens oppdagelsen og analyse av resulterende isolerer

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

Regenerering av plassert gull Microelectrodes utstyrt for en sanntid celle Analyzer

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Sanntid observasjon av DNA Strand Exchange reaksjonen formidlet av Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Undersøke dynamikken i Cellular vedheft og spredning av epitelceller på Fibronektin under oksidativt stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flytende kromatografi-massespektrometribasert metabolomikkanalyse av hvetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Måling av nukleotidbinding til intakte, funksjonelle membranproteiner i sanntid

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Muliggjør sanntidskompensasjon i raske fotokjemiske oksidasjoner av proteiner for bestemmelse av proteintopografiendringer

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Ekstracellulær glukoseuttømming som et indirekte mål på glukoseopptak i celler og vev ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...