Name: real-time, semi-automated fluorescent measurement of the airway surface liquid ph of primary human airway epithelial cells
Uploaded: 2019-06-13T15:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av två CF Trust strategisk Research Centre bidrag (SRC003 och SRC013) och ett medicinskt forsknings råd (MRC) förtroende för Concept Grant (MC_PC_15030). JG stöddes av ett bidrag från Stiftelsen för medicinsk forskning (MRF-091-0001-RG-GARNE). MB stöddes av ett medicinskt forsknings råd klinikern vetenskaps man Fellowship (MR/M008797/1). IH stöddes av en Wellcome Trust klinisk utbildning gemenskap (203520/Z/16/Z). Forskningen stöddes av det nationella institutet för hälso forskning Newcastle Biomedicinskt forsknings centrum baserat på Newcastle Hospitals NHS stiftelse Trust och Newcastle University. De åsikter som uttrycks är de av författaren (s) och inte nödvändigt vis de av NHS, den NIHR eller Institutionen för hälsa. Primära celler från Dr Randell stöddes av Cystic fibros Foundation Grant (BOUCHE15R0) och NIH Grant (P30DK065988).

Primär icke-CF (n = 3 givare, ålder 34, 27 och 23 år gammal) och CF (n = 3 givare, alla F580del/f508del-; ålder 40, 41, okänd) haecs var en snäll gåva från Dr Scott H. Randell (Marsico lung Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, USA) och var kontakta Suunto Oys ned enligt protokoll #03-1396 godkänd av University of North Carolina på Chapel Hill biomedicinska institutionens gransknings nämnd. Cellerna odlades enligt tidigare publicerade metoder med hjälp av de tillväxt-och differentierings medier som beskrivs av Fulcher och Randell35,36.
1. Preparering av provet
<ol><li>Odla primära haecs på 6,5 mm diameter semi-permeable stöder (tabell över material) vid luft-flytande gränssnitt för minst 28 dagar, som tidigare beskrivits35,36.</li>
	<li>Bered 50 ml steril lösning av HCO3- innehållande Krebs buffertlösning (HCO3- krb, koncentrationer ges i mm NaHCO3 (25) NaCl (115), KCl (5), CaCl2 (1), mgcl2 (1), D-glukos (5)) och filtersterilisera med hjälp av ett 0,2 μm sprutfilter.</li>
	<li>Ändra basolateral medium till frisk differentiering medium enligt beskrivningen i 1,135,36. Anmärkning: det har visats att basolateralt glukos koncentration påverkar ASL pH33. I detta skede kan glukos innehållet i basolaterala facket kontrol leras genom att ersätta mediet med buffrade lösningar av kända glukos koncentrationer.</li>
	<li>Tvätta cellernas apikala yta genom att tillsätta 150 μl HCO3- krb och inkubera i 20 min vid 37 ° c, 5% co2.</li>
	<li>Ta bort den apikala tvätten utan att störa epitelet genom att aspirera den försiktigt med ett sterilt glas Pasteur Pipettera och en steril P200 Pipettera spets kopplat till en aspirationspump som skapar ett vakuum i uppsamlings flaskan. I detta skede bör det finnas så lite vätska kvar på den apikala ytan som möjligt för att återställa luft-flytande gränssnitt.</li>
	<li>Inkubera cellerna ytterligare 30 min vid 37 ° c, 5% CO2.</li>
</ol>2. bakgrunds mätning
<ol><li>Slå på plattläsaren och datorn.</li>
	<li>Öppna instrument panelen.</li>
	<li>Klicka på Spark 10m, öppna temperatur kontrollen och Ställ in till 37 ° c. Öppna gas styrningen och Ställ in CO2 till 5%.</li>
	<li>Vänta tills temperaturen och CO2 har nått sina mål.</li>
	<li>Öppna plattläsarlådan, sätt i fukt kassetten fylld med 6 mL dH2O på varje sida. Se till att locket och botten av plattan är rena – om inte, rengör med 70% etanol på en bit vävnad-och placera plattan i fukt kassetten. Obs: under hela experimentet, vävnads odlings plattan locket hålls på plattan och endast tas bort när du lägger till droger eller ändra basolateral mediet, som utförs i en vävnad kultur laminärt flöde huva för att hålla kulturerna i en steril miljö.</li>
	<li>Öppna Spark Method Editor och Ställ in parametrarna på program varan på följande sätt:<ol>
<li>Välj lämplig plattmall (för 6,5 diameter semi-permeable stöder, Välj 24 brunnsplattan) och brunnar som kommer att övervakas under detta experiment.</li>
		<li>Lägg till en temperatur och CO2 kontroll panelen och ställa dem till 37 ° c och 5%, respectively. Kryssa för vänta på temperatur/gas boxar.</li>
		<li>Lägg till en kinetisk loop-panel och välj varaktighet som loop-typ och Ställ in den på 5-10 min. Välj inte definierad som intervall typ för att aktivera kontinuerlig avläsning. Obs: tidpunkten för kontinuerlig avläsning beror på antalet brunnar/förhållanden. 5 min är tillräckligt lång för 6-12 brunnar medan en hel platta som innehåller 24 villkor kommer att kräva 10 min av kontinuerliga mätningar.</li>
		<li>Inom kinetisk loop, tillsätt två "Fluorescence intensitet" paneler, med hjälp av dra och släpp-funktionen, som kommer att inrättas för pH-känsliga och pH okänsliga fluorescerande färg ämnen respektive. Ställ excitation och utsläpp våg längder till 560 och 590 Nm, respektive, för pH-känsligt färg ämne och 495 och 520 Nm, respektive, för pH-okänsliga färg ämne.</li>
		<li>Ställ in antalet blinkningar till 30 och z-positionen till 33200 för varje fluorophore. Obs: z-positionen och förstärknings inställningarna beror på plattläsarens egenskaper. Ställ in förstärkningen manuellt till ett värde som kommer att ge tillräckligt hög antal så att skillnaderna mellan proverna plockas upp men tillräckligt låga så att tillsatsen av en agonist inte kommer att generera värden från detektions området.</li>
		<li>Ställ in flera läsa per väl till användaren definieras som en cirkel typ av 3 × 3 storlek med en gräns på 4750 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klicka på Start-knappen för att göra en bakgrunds mätning och OK för att bekräfta locket på fukt kassetten är på plats.</li>
	<li>I slutet av mätningen, öppna plattan läsaren lådan, ta ut plattan och Pplace cellsit tillbaka i inkubator samtidigt förbereda fluorescerande färg ämne blanda lösning.</li>
	<li>Bered den fluorescerande färg blandningens lösning genom att tillsätta 2 μl 1 mg/ml dextran-kopplat pH-känsligt (phsens) fluorescerande färg till 0,2 μl 10 mg/ml dextran-kopplade pH-okänsliga (phins) fluorescerande färg ämne och 0,8 μl steril HCO3- krb för en slutlig volym på 3 μL per tillstånd. Anmärkning: den totala volymen av färg blandningens lösning bör förberedas för n brunnar + 1 om det finns mellan 1 och 10 prover, eller n brunnar + 2 om det finns mellan 11 och 24 prover. Dextran-kopplade färg ämnen bereds i filtrerad steril HCO3- krb-lösning, aliciterad och lagrad vid-20 ° c. Varje kemikalie kan läggas till i detta skede för en 16-24 h inkubations tid37 på den apikala ytan. Kemikalier bör förberedas som 0.1 x, som den slutliga volymen, efter absorption av överskotts vätskan av kulturen, kommer att vara runt 0,3 μL för en 6,5 mm diameter semi-permeable stöd.</li>
	<li>Tillsätt försiktigt 3 μL färgmix (se 2,8) till cellernas apikala yta och inkubera över natten vid 37 ° c, 5% CO2.</li>
</ol>3. kinetisk mätning
<ol><li>Upprepa steg 2,1 till 2,4 för att förbereda plattläsaren.</li>
	<li>Klicka på ikonen öppna och välj den metod fil som används för bakgrunds mätningarna</li>
	<li>I den kinetiska slingan panelen, hålla slingan typ som varaktighet och ställa in den till 08 timmar. Ändra intervall typen till fast och Ställ in den på 5 minuter. Håll Fluorescensintensitetspanelerna på samma nivå som för bakgrunds mätningarna Obs: intervall typ för bakgrunds mätningar är inställt på "ej definierad" för att möjliggöra kontinuerlig avläsning. För kinetiska såväl som kalibrerings experiment är intervall typen inställt på "Fixed" med ett intervall på 5 min. Detta kan justeras efter experimentets utformning och antalet villkor.</li>
	<li>Öppna plattläsarlådan; sätt in fuktighets kassetten fylld med 6 mL dH2O på vardera sidan. Se till att locket och botten av plattan är rena-om inte, rengör med 70% etanol på en bit vävnad-och placera plattan i fukt kassetten, med sitt lock.</li>
	<li>Starta fluorescensavläsningar genom att klicka på Start. Klicka på OK efter att locket på fukt kassetten är på plats.</li>
	<li>Efter n cykler, vanligt vis mellan 12 och 24, vilket motsvarar 1 till 2 timmar, klicka på pausa för att avbryta experimentet. Ta plattan ut och tillämpa alla droger/agonister basolaterally till de olika proverna. Obs: när cellerna tas ut ur plattan läsaren, CO2 flyr och detta kommer att framkalla en ökning av ASL pH som visas av en droppe i pH-känsligt färg ämne fluorescens. Detta co2-inducerad pH förändring vänder inom 10-15 min efter att placera kulturerna tillbaka i plattan läsaren.</li>
	<li>Sätt tillbaka plattan i luft fuktigheten kassetten på facket, flytta luft fuktigheten kassett locket och klicka på Fortsätt för att ytterligare registrera ASL pH och övervaka effekten av droger/AGONISTER på ASL pH.</li>
</ol>4. in situ pH-kalibrering
<ol><li>Ta ut plattan ur plattan läsaren.</li>
	<li>Aspirera på det basolaterala mediet/lösningen.</li>
	<li>Tillsätt 750 μL och 1 μL av högbuffrade standard kurva lösningar till basolateral fack och apikal yta. Obs: mycket buffrade standard kurva lösningar innehåller (i mM) NaCl (86), KCl (5), CaCl2 (1,2), mgcl2 (1,2), NAHEPES eller MES eller tris (100 mm). Använd MES för att buffra lösningar med ett pH lägre än 7, NaHEPES för lösningar av pH 7-7.5 och tris för lösning med pH 8. Kläm fast pH-värdet till önskat värde med HCl.</li>
	<li>Slå på CO2 off på plattan läsaren eller ställa in den till 0,1% och placera plattan tillbaka i fukt kassetten.</li>
	<li>Ställ in plattan läsaren med samma parametrar som beskrivits tidigare men utan CO2 som i steg 3,2.</li>
	<li>Börja fluorescensavläsningar, var 5 min för 1-1.5 h.</li>
</ol>5. utvärdering av effekten av färg ämnes koncentration och SUS pensions volym på kalibrerings data
<ol><li>Förbered tillräckligt pH-känslig och okänslig färg blandning för att registrera fluorescens vid ett minimum av 4 olika pH-värden i 3 olika volymer. Anmärkning: här är blandning 1 preparerade med 26 μL pH-känsligt (1 mg/mL) och 2,6 μL pH-okänslig (10 mg/mL) och blanda 2 med 13 μL pH-känsligt (1 mg/mL) och 1,3 μL pH-okänslig (10 mg/mL).</li>
	<li>Fördela 2,2 μL eller 1,1 μL av blandning 1 respektive 2 i 12 brunnar i en 96 brunnsplåt och tillsätt tillräckligt med kalibrerings lösningar för att erhålla volymer på 50, 100 eller 200 μL och blanda väl. Anmärkning: i denna uppsättning kommer fluorescensvärden att registreras för koncentrationer av färg ämnen på 5 μg/mL (i 200 μL), 10 μg/mL (i 100 eller 200 μL), 20 μg/mL (i 50 eller 100 μL) eller 40 μg/mL (i 50 μL).</li>
	<li>Vrid på plattläsaren, Ställ in temperaturen på 37 ° c och för in plattan i plattan läsaren. Slå inte på CO2 -styrenheten. Obs: eftersom detta är ett kort experiment och bara kräver tillräckligt med tid för att jämvikt temperaturen, fukt kassetten är inte nödvändigt.</li>
	<li>Justera z-positionen och förstärkningen för 96 och Använd samma parametrar som för experimentet gjort på semi-permeabla stöd.</li>
</ol>6. data analys
<ol><li>Spara alla data i kalkylark och skapa en ny fil.</li>
	<li>I bakgrunds filen väljer du alla medeldata för varje prov/villkor för både våg längder, kopiera och klistra in till den nya filen. Beräkna medel bakgrunden för varje brunn och varje våglängd.</li>
	<li>Upprepa detta med kalibrerings-och kinetiska data och subtrahera bakgrunden från varje data punkt för varje våglängd.</li>
	<li>För varje tids punkt och varje prov, beräkna förhållandet mellan pH-känslig och pH-okänslig fluorescens</li>
	<li>Om alla prover erhölls från en enskild donator, beräkna medelvärdet av kvoterna vid varje tidpunkt för kalibrerings kurvan Obs: det är viktigt att generera så många kalibrerings kurvor som givare eller basolaterala lösningar. I själva verket kan dessa parametrar påverka bakgrunds avläsningar eller absorptionshastigheten av vätskan, vilket i sin tur kommer att påverka färg ämnet koncentrationen och därmed det beräknade pH.</li>
	<li>För varje tidpunkt, generera en standard kurva från kvoterna, plottning de kända pH-värdena på x-axeln och förhållandet på y-axeln.</li>
	<li>Bestäm den tidpunkt då kvoterna är stabila, passa in en linjär Regressions linje och få ekvationen för den här linjen.</li>
	<li>Från kinetiska data, beräkna pH för varje tidpunkt och rita pH på y-axeln och tiden på x-axeln Anmärkning: vila/basal pH kan beräknas med medelvärden data punkter över den stabila mätningen av pH före tillsats av någon agonist eller någon annan intervention. Effekten av en agonist kan karakteriseras genom att beräkna skillnaden i pH före och efter (en viss tid) behandlingen eller genom att montera en icke-linjär kurva till data punkterna direkt efter ingreppet. Detta kommer att ge ytterligare information om t1/2 och det maximala värdet. Slutligen kan man också få till gång till försurnings-eller alkaliniseringssatser från lutningen på en rät linje som är monterad på de första punkterna efter ingreppet.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+ion+transport.+Part+one.">Human airway ion transport. Part one.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 150 (1), 271-281 (1994).</li><li>Roomans, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+airway+surface+liquid+height+and+mucus+transport+by+fluorescence+microscopy,+and+of+ion+composition+by+X-ray+microanalysis.">Measurements of airway surface liquid height and mucus transport by fluorescence microscopy, and of ion composition by X-ray microanalysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 3, 135-139 (2004).</li><li>Haq, I. J., Gray, M. A., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+surface+liquid+homeostasis+in+cystic+fibrosis:+pathophysiology+and+therapeutic+targets.">Airway surface liquid homeostasis in cystic fibrosis: pathophysiology and therapeutic targets.</a> Thorax. 71 (3), 284-287 (2016).</li><li>Martin, S. L., Saint-Criq, V., Hwang, T. C., Csanady, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+as+targets+to+treat+cystic+fibrosis+lung+disease.">Ion channels as targets to treat cystic fibrosis lung disease.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2S), S22-S27 (2018).</li><li>Garland, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+pH-dependent+mucosal+dehydration+in+cystic+fibrosis+airways.">Molecular basis for pH-dependent mucosal dehydration in cystic fibrosis airways.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15973-15978 (2013).</li><li>Torres, I. M., Patankar, Y. R., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+exacerbates+in+vivo+IL-1-dependent+inflammatory+responses+and+neutrophil+recruitment+during+pulmonary+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Acidosis exacerbates in vivo IL-1-dependent inflammatory responses and neutrophil recruitment during pulmonary Pseudomonas aeruginosa infection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (2), L225-L235 (2018).</li><li>Berkebile, A. R., McCray, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+airway+surface+liquid+pH+on+host+defense+in+cystic+fibrosis.">Effects of airway surface liquid pH on host defense in cystic fibrosis.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 52, 124-129 (2014).</li><li>Tang, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+increases+airway+surface+liquid+viscosity+in+cystic+fibrosis.">Acidic pH increases airway surface liquid viscosity in cystic fibrosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 879-891 (2016).</li><li>Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+impaired+bicarbonate+secretion+and+mucoviscidosis.">Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis.</a> Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).</li><li>Hunt, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+airway+acidification.+Implications+for+asthma+pathophysiology.">Endogenous airway acidification. Implications for asthma pathophysiology.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161, 694-699 (2000).</li><li>Kostikas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+in+expired+breath+condensate+of+patients+with+inflammatory+airway+diseases.">pH in expired breath condensate of patients with inflammatory airway diseases.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 165 (10), 1364-1370 (2002).</li><li>Ojoo, J. C., Mulrennan, S. A., Kastelik, J. A., Morice, A. H., Redington, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+breath+condensate+pH+and+exhaled+nitric+oxide+in+allergic+asthma+and+in+cystic+fibrosis.">Exhaled breath condensate pH and exhaled nitric oxide in allergic asthma and in cystic fibrosis.</a> Thorax. 60 (1), 22-26 (2005).</li><li>Cho, D. Y., Hajighasemi, M., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+secretion+in+freshly+excised+sinonasal+mucosa+from+asthma+and+sinusitis+patients.">Proton secretion in freshly excised sinonasal mucosa from asthma and sinusitis patients.</a> American Journal of Rhinology &amp; Allergy. 23 (6), e10-e13 (2009).</li><li>Cho, D. Y., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+and+base+secretion+in+freshly+excised+nasal+tissue+from+cystic+fibrosis+patients+with+DeltaF508+mutation.">Acid and base secretion in freshly excised nasal tissue from cystic fibrosis patients with DeltaF508 mutation.</a> International Forum of Allergy &amp; Rhinology. 1 (2), 123-127 (2011).</li><li>Coakley, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+surface+liquid+pH+regulation+by+cultured+cystic+fibrosis+bronchial+epithelium.">Abnormal surface liquid pH regulation by cultured cystic fibrosis bronchial epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 16083-16088 (2003).</li><li>Pezzulo, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+airway+surface+pH+impairs+bacterial+killing+in+the+porcine+cystic+fibrosis+lung.">Reduced airway surface pH impairs bacterial killing in the porcine cystic fibrosis lung.</a> Nature. 487 (7405), 109-113 (2012).</li><li>Shah, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+acidification+initiates+host+defense+abnormalities+in+cystic+fibrosis+mice.">Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice.</a> Science. 351 (6272), 503-507 (2016).</li><li>Saint-Criq, V., Gray, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CFTR+in+epithelial+physiology.">Role of CFTR in epithelial physiology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (1), 93-115 (2017).</li><li>. ECFS Patient Registry Annual Data Report Available from: <a target="_blank" href="https://www.ecfs.eu/sites/default/files/general-content-images/working-groups/ecfs-patient-registry/ECFSPR_Report2016_06062018.pdf">https://www.ecfs.eu/sites/default/files/general-content-images/working-groups/ecfs-patient-registry/ECFSPR_Report2016_06062018.pdf</a> (2016)</li><li>. Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry Annual Data Report 2017 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cff.org/Research/Researcher-Resources/Patient-Registry/2017-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf">https://www.cff.org/Research/Researcher-Resources/Patient-Registry/2017-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf</a> (2017)</li><li>Abou Alaiwa, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonates+with+cystic+fibrosis+have+a+reduced+nasal+liquid+pH;+a+small+pilot+study.">Neonates with cystic fibrosis have a reduced nasal liquid pH; a small pilot study.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 13 (4), 373-377 (2014).</li><li>Abou Alaiwa, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ivacaftor-induced+sweat+chloride+reductions+correlate+with+increases+in+airway+surface+liquid+pH+in+cystic+fibrosis.">Ivacaftor-induced sweat chloride reductions correlate with increases in airway surface liquid pH in cystic fibrosis.</a> JCI Insight. 3 (15), (2018).</li><li>McShane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+surface+pH+in+subjects+with+cystic+fibrosis.">Airway surface pH in subjects with cystic fibrosis.</a> European Respiratory Journal. 21 (1), 37-42 (2003).</li><li>Schultz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+surface+liquid+pH+is+not+acidic+in+children+with+cystic+fibrosis.">Airway surface liquid pH is not acidic in children with cystic fibrosis.</a> Nature Communications. 8 (1), 1409 (2017).</li><li>Abou Alaiwa, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+tromethamine+as+inhaled+therapy+to+treat+CF+airway+disease.">Repurposing tromethamine as inhaled therapy to treat CF airway disease.</a> JCI Insight. 1 (8), (2016).</li><li>Ngamtrakulpanit, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Intrinsic+Airway+Acidification+in+Pulmonary+Tuberculosis.">Identification of Intrinsic Airway Acidification in Pulmonary Tuberculosis.</a> Global Journal of Health Science. 2 (1), 106-110 (2010).</li><li>Tate, S., MacGregor, G., Davis, M., Innes, J. A., Greening, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airways+in+cystic+fibrosis+are+acidified:+detection+by+exhaled+breath+condensate.">Airways in cystic fibrosis are acidified: detection by exhaled breath condensate.</a> Thorax. 57 (11), 926-929 (2002).</li><li>Jayaraman, S., Song, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+surface+liquid+pH+in+well-differentiated+airway+epithelial+cell+cultures+and+mouse+trachea.">Airway surface liquid pH in well-differentiated airway epithelial cell cultures and mouse trachea.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 281 (5), C1504-C1511 (2001).</li><li>Jayaraman, S., Song, Y., Vetrivel, L., Shankar, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+fluorescence+measurement+of+airway-surface+liquid+depth,+salt+concentration,+and+pH.">Noninvasive in vivo fluorescence measurement of airway-surface liquid depth, salt concentration, and pH.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (3), 317-324 (2001).</li><li>Lennox, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP12A+promotes+mucus+dysfunction+during+Type+2+airway+inflammation.">ATP12A promotes mucus dysfunction during Type 2 airway inflammation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2109 (2018).</li><li>Song, Y., Thiagarajah, J., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+and+chloride+concentrations,+pH,+and+depth+of+airway+surface+liquid+in+distal+airways.">Sodium and chloride concentrations, pH, and depth of airway surface liquid in distal airways.</a> The Journal of General Physiology. 122 (5), 511-519 (2003).</li><li>Thiagarajah, J. R., Song, Y., Haggie, P. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+CFTR+inhibitor+produces+cystic+fibrosis-like+submucosal+gland+fluid+secretions+in+normal+airways.">A small molecule CFTR inhibitor produces cystic fibrosis-like submucosal gland fluid secretions in normal airways.</a> FASEB Journal. 18 (7), 875-877 (2004).</li><li>Garnett, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycaemia+and+Pseudomonas+aeruginosa+acidify+cystic+fibrosis+airway+surface+liquid+by+elevating+epithelial+monocarboxylate+transporter+2+dependent+lactate-H(+)+secretion.">Hyperglycaemia and Pseudomonas aeruginosa acidify cystic fibrosis airway surface liquid by elevating epithelial monocarboxylate transporter 2 dependent lactate-H(+) secretion.</a> Scientific Reports. 6, 37955 (2016).</li><li>Gorrieri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goblet+Cell+Hyperplasia+Requires+High+Bicarbonate+Transport+To+Support+Mucin+Release.">Goblet Cell Hyperplasia Requires High Bicarbonate Transport To Support Mucin Release.</a> Scientific Reports. 6, 36016 (2016).</li><li>Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+epithelial+cell+models+for+cystic+fibrosis+research.">Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research.</a> Methods in Molecular Biology. 742, 285-310 (2011).</li><li>Fulcher, M. L., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nasal+and+tracheo-bronchial+respiratory+epithelial+cell+culture.">Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. , 109-121 (2013).</li><li>Matsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+periciliary+liquid+layer+depletion,+not+abnormal+ion+composition,+in+the+pathogenesis+of+cystic+fibrosis+airways+disease.">Evidence for periciliary liquid layer depletion, not abnormal ion composition, in the pathogenesis of cystic fibrosis airways disease.</a> Cell. 95 (7), 1005-1015 (1998).</li><li>Ahmadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+profiling+of+CFTR+modulators+in+patient-derived+respiratory+epithelia.">Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia.</a> npj Genomic Medicine. 2, 12 (2017).</li><li>Delpiano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esomeprazole+Increases+Airway+Surface+Liquid+pH+in+Primary+Cystic+Fibrosis+Epithelial+Cells.">Esomeprazole Increases Airway Surface Liquid pH in Primary Cystic Fibrosis Epithelial Cells.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1462 (2018).</li><li>Gillies, R. J., Liu, Z., Bhujwalla, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=31P-MRS+measurements+of+extracellular+pH+of+tumors+using+3-aminopropylphosphonate.">31P-MRS measurements of extracellular pH of tumors using 3-aminopropylphosphonate.</a> American Journal of Physiology. 267 (1 Pt 1), C195-C203 (1994).</li><li>Tannock, I. F., Rotin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+pH+in+tumors+and+its+potential+for+therapeutic+exploitation.">Acid pH in tumors and its potential for therapeutic exploitation.</a> Cancer Research. 49 (16), 4373-4384 (1989).</li><li>Wike-Hooley, J. L., Haveman, J., Reinhold, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+tumour+pH+to+the+treatment+of+malignant+disease.">The relevance of tumour pH to the treatment of malignant disease.</a> Radiotherapy and Oncology. 2 (4), 343-366 (1984).</li></ol>

MB: inte relaterat till detta arbete: utredare-ledda forsknings bidrag från Pfizer och Roche Diagnostics; avgifter som betalats till Newcastle University från Novartis, Roche Diagnostics och TEVA. Resekostnader till utbildnings möten från Boehringer Ingelheim och Vertex Pharmaceuticals.

Här ger vi ett detaljerat protokoll för dynamisk mätning av ASL pH i primära humana luftvägar epitelceller. Kritiska steg är att tvätta slem från den apikala ytan av cellerna, mäta och subtrahera bakgrunden med samma parametrar som i experimentet, optimera z-positionen och få och utföra en in situ pH-kalibrering.
Det första steget i att tvätta cellerna är avgörande eftersom ett tjockt lager av slem kan (i) förhindra att färg ämnena når periciliarskiktet (PCL) och (II) fördröja eller förhindra detektion av förändringar i fluorescens som svar på agonister/hämmare. Vår metod utvecklades för att studera hur primära haecs modulerade aktiviteten hos HCO3- och H+ -transportörer som svar på agonister. Även om det kommer att bli intressant att undersöka hur förändringar i PCL pH relaterar till förändringar i slem pH, ytterligare utveckling av detta protokoll behövs, inklusive användning av olika molekyl vikt-dextrans att differentially rikta 2 lager och z-skanningar genom hela ASL.
Bakgrunds mätning är ett annat viktigt steg i detta protokoll. Den apikala ytan av fullt differentierade primära luftvägar epitelia är sällan helt platt som kommer att påverka ljus banan och därmed bakgrunden. Se till att bakgrunds avläsningar utförs i samma lokala punkter i brunnarna som under experimentet är avgörande för reproducerbarhet och stabiliteten i inspelningarna.
Att optimera z-positionen och förstärkningen är nödvändiga steg som måste ställas in för varje annan koncentration av fluorescerande färg ämne som kommer att användas. Detta kommer att förhindra hög Inter-experiment variation. När den är inställd, ger vår analys stabila och reproducerbara resultat. En av anledningarna till detta är att färg ämnena tillsätts på den apikala ytan på cellerna i en liten mängd vätska som lätt återabsorberas av epitelet och lämnar ett homogent märkt ASL. En annan metod för att färga ASL, som kan vara lika framgångs rik, används torrt pulver eller en "SUS pension" i PFC. även om detta kan vara tidsbesparande (eftersom experimenten vanligt vis utförs inom 2 h), är det osannolikt att de torra färg ämnena helt solubilize i ASL och därmed kan bildar klumpar. Således olika koncentrationer av pH-känsligt färg ämne kommer att finnas över ytan av epitelcellerna.
In situ pH-kalibrering är ett viktigt steg för att få exakta, reproducerbara resultat. Som framgår och förklaras i resultat avsnittet kommer skillnader i ASL-volymer att påverka fluorescensvärdena och därmed de interpolerade pH-värden (figur 2 och figur 3). Även om olika grupper tidigare har offentliggjort ASL pH-mätningar, har ett brett spektrum av värden erhållits även mellan olika studier som publicerats av samma grupp8,17. Vi tror att resultaten kommer att bli mer reproducerbara genom att utföra in situ-kalibreringar. Jämfört med andra pH kalibrerings tekniker, som använder den höga K+/nigericin (eller flera ionophores) metod för att generera standard kurvan28,29,30, den analys som presenteras här har den fördelen att , så länge varje steg utförs i ett säkerhets skåp, de celler som används för ASL pH kan tvättas, förvaras och återanvändas för andra experiment, förutsatt att de behandlingar som utförs inte irreversibelt påverkar epitelcellerna.
Utvecklingen och optimering av denna analys har gett reproducerbara resultat och vi tror att denna metod kommer att hjälpa andra grupper med sin ASL pH-mätning. Men denna teknik har också vissa begränsningar på grund av att ställa in och vilken typ av celler som används. Övervakning ASL pH under en längre tids period än den som presenteras här (> 8-10 h) kan vara svårt eftersom en långsiktig hög luft fuktighet miljö kan skada utrustningen och det faktum att de flesta plattan läsarna endast erbjuda möjlighet att spela in kinetiska avläsningar över en viss tid (vanligt vis 24 timmar). Användningen av helt differentierade primära hematostatika är avgörande för hur olika stadier av differentiering kommer att påverka uttrycket av HCO3- och H+ -transportörer. Det finns dock nästan ingen möjlighet att exakt kontrol lera volymen av ASL i celler som odlas under tunna film förhållanden. Som anges i protokollet och resultat avsnitten, förändringar i volym kommer att påverka fluorescensförhållandet och det är tyvärr nödvändigt att anta att i celler som odlas från en enskild individ, seedade samma dag på olika semi-permeabla stöd, ASL volymer kommer att vara densamma. Till följd av denna begränsning, någon agonist eller inhibitor som kommer att påverka vätskeutsöndring eller absorption kommer att påverka ASL volym och förmodligen fluorescens nyckeltal. Men i vår analys, kalibrerings kurvan utförs i slutet av experimentet, så vi kan anta att dessa förändringar i volym kommer att påverka kalibrerings förhållanden på samma sätt som under kinetiska experiment. Av denna anledning rekommenderar vi grupper som skulle vara intresserade av att utveckla denna analys, att använda minst 2-3 replikat per tillstånd testas eftersom detta kommer att möjliggöra upprättandet av en standard kurva för varje villkor.
Här presenterar vi en enkel, semi-automatiserad, analys som möjliggör real tids mätning av slem hinnor yta pH under tunn Films förhållanden. Den har kapacitet att undersöka dynamiska pH-svar i många kulturer på ett nästan samtidigt sätt som gör det möjligt för Inter och intra-givare jämförelser. Uppskalning denna metod till en 96 väl plattan format med hjälp av polariserat system (HTS 96 väl plattor)38 skulle ge ännu högre genom strömning som en Drug discovery-analys. Dessutom har vi visat hur denna teknik kan användas för att studera den akuta effekten av agonister på ASL pH och vi har redan publicerat att denna metod kan användas för att studera den långsiktiga effekten av en apikal protonpumpshämmare på CF hAECs ASL39. Eftersom pH har visat sig reglera infektion, inflammation, slem viskositet och Jon transport, identifiera molekyl ära mål som kan öka pH kommer att vara värdefull inom forsknings områden för kroniska lung sjukdomar och denna teknik kommer potentiellt att under lätta utveckling av läkemedels screening i individanpassade medicinska metoder. Slutligen, eftersom Dysreglering i syra-bas homeostas spelar en viktig roll i andra sjukdomar, kan detta protokoll anpassas, med optimerings steg, till olika utrustning (plattan läsare) och cell typer, såsom andra epitelceller. Extracellulär Aciditet är en egenskap hos cancer40,41,42 och denna analys kan hjälpa till att avgöra hur solida tumörer producerar lågt pHe eller kan användas som ett lågt genom strömning Drug screening test för återställande av pH-homeostasen. Likaså, som för kroniska luftvägs sjukdomar, det kan också ge en plattform för utveckling av en personlig medicin strategi.

Luftvägarna epitel täcks av ett tunt (~ 10 μm) vätske skikt kallas luftvägarna ytvätskan (ASL). Sammansättningen och djupet (hydrering) av detta ASL är tätt reglerad och kontrollerar effektiviteten i luftvägarna clearance av muciliär rull trappa1,2,3,4. Under de senaste åren har betydelsen av ASL H+/HCO3- innehåll visats av olika grupper på grund av dess förmåga att reglera ASL Hydration5, luftvägs inflammation6 och infektion7, 8 samt slem viskositet8,9. Viktigt, även om det finns vissa kon tro verser, har många studier rapporterat Dysreglering av luftvägarna pH i kroniska luftvägs sjukdomar såsom astma10,11,12, kol11, bronkiektasi11, kronisk rhinosinusit13,14 och cystisk fibros (CF)5,9,15,16,17, som tyder på att terapier som återställer ASL pH kan vara användbara för att behandla flera typer av kroniska luftvägs sjukdomar. CF är den vanligaste autosomalt recessiv genetisk sjukdom i kaukasiska populationer och beror på mutationer i CF transmembranen värmeledningsförmåga regulator (CFTR) genen. Denna gen kodar en anjon (HCO3- och cl-) kanal som spelar en avgörande roll i Jon-och vätske transport och homeostas över epitelia18. Även om CF är en multi-organ sjukdom, lung patologi är den främsta orsaken till sjuklighet och dödlighet19,20 och med tanke på den primära defekten i CF är en nedsatt transport av cl- och HCO3-, man kan hypotes om att extracellulär vätska pH hos personer med CF kommer att dysreglerad jämfört med människor som inte har CF. således, mätningen av ASL pH har varit ett aktuellt område av CF forskning och olika grupper har utvecklat tekniker för att mäta ASL pH i CF Airways.
In vivo har luftvägs pH mätts med olika tekniker, från mikroprober (fiber optiska, guld-eller mobidium-sonder)5,21, 22,23,24 till pH-mätningar av slem lös ande material eller utandnings kondensat (EBC)10,11,12,25,26,27. Inom forsknings området CF studeras pH i stor utsträckning på grund av dess potentiella kliniska implikationer. Teoretiskt, göra luftvägarna mer alkaliska kan öka bakterie död ande och förbättra muciliära clearance och luftvägarna homeostas som helhet. I vivo/ex vivo-studier rapporterar dock ett brett spektrum av pH-värden, och hittills är resultaten inte avgörande för förekomsten av en skillnad i pH mellan icke-CF-och CF-luftvägar. I början av 2000-talet rapporterade olika grupper om EBC: s pH-värde. I icke-diseased grupper, pH-värden varierade från 4,6 till 8,5 men intressant, EBC pH hittades surare under exacerbationer hos personer med CF12,27. Mer nyligen, in vivo mätningar av ASL i human-och djur modeller av CF har rapporterat motstridiga resultat16,17,21,22,23, 24 och det är fortfarande oklart om CF-luftvägar är sura än icke-CF-luftvägar.
Som in vivo mätning av den nedre ASL pH har visat sig svårt på grund av den mycket liten mängd vätska foder luftvägarna och potentiella förekomst av slem pluggar i sjukdom, många grupper har vänt sig in vitro experiment för att mäta ASL pH, främst med hjälp av tre olika Metoder. Den första metoden använder dextran-kopplade cell-impermenade pH-känsliga fluorescerande färg ämnen som tillsätts som ett torrt pulver, antingen direkt till ASL eller med hjälp av en inert vätska som kallas perfluorcarbon (PFC)5,8,16 , 17 i den , 28 , 29 (på) , 30 % av , den 31 , 32emellertid, denna teknik ger lite kontroll över den exakta kvantiteten av färg ämnen som tillsätts till kulturer och utgör en risk för färg ämnen aggregat och stora skillnader i koncentration mellan prover och/eller experiment och även inom samma prov . Det har också i allmänhet utförts med ett konfokal Mikroskop, som begränsar dess tillämplighet och i många fall, förhindrar detaljerad övervakning av flera prover och förändringar i inspelnings förhållanden. Den andra metoden som används för att mäta ASL pH är användningen av pH-känsliga mikroelektroder5,15. ASL pH mätningar är därför inte beroende av fluorescerande färg ämne koncentration och bör ge mer robust och reproducerbara resultat. Emellertid, denna metod tillåter inte för dynamiska, real tid mätningar av ASL pH, inte heller är det lätt att göra flera avläsningar under olika förhållanden. Det är också en arbets intensiva, komplexa, process som kräver specialist utrustning (mikroelektrod tillverkning/elektrofysiologiska inspelnings anordningar) och utbildning för insamling av proverna för efterföljande pH-mätning och kalibrering. Dessutom har dessa två tekniker också visat några inkonsekvenser i förmågan att producera reproducerbara resultat: med pH-känsligt fluorescerande färg ämne metod, Tang et al. rapporterade värden på 7,35 för icke-CF ASL och 7,0 för CF ASL8 medan det i en mer Nyligen papper från samma grupp, ASL pH var 6,9 och 6,4 för icke-CF och CF, respektive17. På liknande sätt gav mikroelektrodmätningar värden på 6,4 i non-CF ASL och 6,1 i CF ASL i en studie från 200315 medan samma grupp rapporterade värden på 6,7 för icke-CF asl och 6,45 för CF ASL i en studie från 20135. Slutligen, i det tredje tillvägagångs sättet, forskare lägga till en relativt stor volym av svagt buffrad lösning på apikala (slem hinnor) ytan av kulturerna, vilket förstör tunna film förhållanden och ändra ASL sammansättning, och potentiellt dess reglering. pH mäts sedan antingen med pH-känsliga fluorescerande färg ämnen33, med en pH-statstitreringsmetod i en Ussing-kammare13,14, eller kräver att de utspädda ASL avlägsnas från kulturerna och pH-värdet mätt med ett pH-värde elektrod, analysator eller litmusremsor34. En annan svårighet i noggrann mätning av ASL pH är upprättandet av en standard kurva som är så exakt som möjligt. Oavsett om mätningarna utförs med en elektrod som kommer att mäta skillnaden i elektrisk potential via en harts eller med pH-känsliga fluorescerande färg ämnen, kommer båda dessa metoder att påverkas av den lokala mikromiljön av proverna som Mätt. Mer specifikt, dissociationskonstant (KD) av färg ämnena kan variera avsevärt beroende på temperaturen, joniska styrka, viskositet samt potentiella interaktioner av färg ämnet med cellulära bestånds delar såsom proteiner och potentiellt slem.
För att försöka övervinna många av dessa tekniska frågor, samt att utveckla en mer dynamisk, enklare och högre genom strömning metod, har vi etablerat en in vitro-teknik som registrerar ASL pH i primära hAEC kulturer med hjälp av en cell-impermenade pH-känsliga fluorescerande färg i en vanlig kommersiell Plattläsare. Metoden genererar reproducerbara, dynamiska, halvautomatiserade, real tids mätningar av ASL pH av helt differentierade 3D cell kulturer under tunna film förhållanden. Genom användning av en flera brunnar plattan läsare, denna semi-automatiserad analys kan göra nära samtidiga mätningar av pH för upp till 24 villkor över 12 h och kan övervaka effekten av att lägga till olika agonister eller hämmare. I detta dokument beskriver vi metodiken i detalj och rapporterar representativa resultat under positiva och negativa kontroll förhållanden som validerar tekniken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E4780-1226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.5 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFTRInh172</td>
			<td>RnD Systems (Tocris)</td>
			<td>3430</td>
			<td>Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D22910</td>
			<td>Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P10361</td>
			<td>Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>RnD Systems (Tocris)</td>
			<td>1099</td>
			<td>Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity cassette</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>30090495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader: TECAN SPARK 10M</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>30086375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal pH electrodes DJ 113</td>
			<td>VWR</td>
			<td>662-1385</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time, semi-automated fluorescent measurement of the airway surface liquid ph of primary human airway epithelial cells

Under de senaste åren, vikten av slem hinnor yta pH i luftvägarna har lyfts fram genom sin förmåga att reglera luftvägs vätska (ASL) hydrering, slem viskositet och aktivitet av antimikrobiella peptider, viktiga parametrar involverade i medfödd försvar av Lungorna. Detta är av primär relevans när det gäller kroniska luftvägs sjukdomar såsom cystisk fibros (CF) där dessa parametrar är dysreglerade. Medan olika grupper har studerat ASL pH både in vivo och in vitro, deras metoder rapporterar ett relativt brett spektrum av ASL pH-värden och även motstridiga fynd om eventuella pH-skillnader mellan icke-CF-och CF-celler. Dessutom ger deras Protokoll inte alltid tillräckligt med Detaljer för att säkerställa reproducerbarhet, de flesta är låg genom strömning och kräver dyr utrustning eller specialiserad kunskap för att genomföra, vilket gör dem svåra att etablera i de flesta laboratorier. Här beskriver vi en semi-automatiserad fluorescerande plattan läsar analys som möjliggör real tids mätning av ASL pH under tunn film förhållanden som mer liknar in vivo situationen. Denna teknik möjliggör stabila mätningar i många timmar från flera luftvägs kulturer samtidigt och, viktigast av allt, dynamiska förändringar i ASL pH som svar på agonister och hämmare kan övervakas. För att uppnå detta, ASL av helt differentierade primära mänskliga luftvägar epitelceller (hAECs) är färgade över natten med ett pH-känsligt färg ämne för att möjliggöra reabsorption av överflödig vätska för att säkerställa tunna film förhållanden. När fluorescens övervakas i närvaro eller avsaknad av agonister, pH-Kalibrering utförs på plats för att korrigera för volym och färg ämne koncentration. Den beskrivna metoden ger de kontroller som krävs för att göra stabila och reproducerbara ASL pH mätningar, som i ändan skulle kunna användas som en Drug discovery plattform för personlig medicin, samt anpassas till andra epitelial vävnader och experimentella tillstånd, såsom inflammatoriska och/eller Host-patogena modeller.

Den teknik som beskrivs ovan möjliggör dynamisk mätning av ASL pH i upp till 24 separata primära hAECs kulturer. Figur 1 visar en Schematisk bild av de viktigaste stegen och utrustningen som ställts in. De övernattnings laddade cellerna placeras i en CO2 -och temperaturkontrollerad Plattläsare där fluorescens från dextran-kopplade pH-känsliga och pH-okänsliga färg ämnen registreras var 5 min.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig1.jpg"> Figur 1: Schematisk av ASL pH mät metod. Efter tvättning av kulturer och utför en bakgrunds läsning, primära humana luftvägar epitelceller (hAECs) ASL är laddade med dextran kopplad pH-känslig och pH-okänslig färg blandning över natten på 37 ° c, 5% CO2. Följande dag, plattan överförs till en temperatur och CO2-kontrollerad plåt läsare och fluorescens från båda färg ämnen registreras över tiden. Efter experimentet utförs en in situ-kalibrering och data analyseras och presenteras som ASL pH över tiden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Först undersökte vi effekten av olika volymer och färgkoncentrationer på fluorescensvärdena och därmed på 560/495 förhållandet. I själva verket är syftet med att lägga till pH-okänslig för pH-känsligt färg ämne att korrigera för variationen i ASL lastning. Det var dock viktigt att testa detta antagande och utvärdera om vi kunde använda en standard kalibrerings kurva utförs i avsaknad av celler i en 96 väl plattan för alla experiment och cell typer. Vi övervakade fluorescensvärden över 1 h i 50, 100 eller 200 μl kalibrerings lösningar (vid pH 5,5, 6,5, 7 eller 8) innehåll ande 5, 10, 20 eller 40 μg/mL färg ämnen. Resultaten presenteras i figur 2A-Coch visar att för samma pH och samma koncentration av färg ämnen skilde sig de rapporterade phsens/phins-utsläppsförhållandet (560/495 på y-axeln) beroende på volymen (figur 2A). Dessutom, vid samma pH och samma volym, olika färgkoncentrationer ger olika ratio värden (figur 2b). Förändringar i volym-eller färg ämnes koncentration kommer därför att påverka det absoluta värdet av pH beräknat utifrån utsläpps förhållandet. Figur 2C visar att den tid som krävs för temperaturutjämningen är ca 15-20 min. För att bekräfta effekten av färg ämnes koncentration och volym på utsläpps kvoter, registrerade vi fluorescens från färg ämnen lastas i ASL av primära icke-CF och CF hAECs in situ. Vi utförde sedan kalibreringen och analyserade resultaten genom att (1) generera en global standard kurva från alla prover eller (2) generera två oberoende standard kurvor för varje cell typ (non-CF och CF). ASL pH från båda cell typerna plottas sedan mot tiden (figur 3a, B) och i genomsnitt (figur 3c). ASL pH-värden som erhållits från en enda global standard kurva visade en signifikant skillnad mellan icke-CF-och CF-kulturer (figur 3a, C) medan ASL pH inte var signifikant annorlunda mellan CF och icke-CF haecs när pH beräknades från oberoende standard kurvor (figur 3B, C). Dessa resultat visar på vikten av att generera oberoende kalibrerings kurvor för varje experiment och inom experiment, för varje givar prov, eftersom när kalibrerings kurvorna beräknades tillsammans, fanns högre pHsens/pHins-förhållande värden i CF-kulturer , vilket indikerar ett surare pH (figur 3c).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig2v4.jpg"> Figur 2: optimering av pH-kalibrering in vitro. Olika volymer av lösningar med känd pH och som innehåller olika färgkoncentrationer lastades på en 96 brunn plåt och fluorescens registrerades över 1 h. effekt av volym (a) och färg koncentration (B) på fluorescensförhållanden. Nyckeltal var ritade mot pH för tid-punkt 24 min. (C) lutningen av förändring i fluorescens beräknades för varje lösning och ritas som en funktion av tid (i min). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig3.jpg"> Figur 3: optimering av analysen av pH-kalibrering på primär Hematcs på plats. Arepresentativa spår av ASL pH som erhållits från en enda standard kurva i genomsnitt data från icke-CF-och CF-kulturer. Brepresentativa spår av ASL pH som erhållits från oberoende standard kurva som utförts på icke-CF-eller CF-kulturer. Varje data uppsättning beräknades utifrån en egen kalibrerings kurva. Cutvärdering av skillnaderna i ASL pH mellan icke-CF-och CF-kulturer som en funktion av hur kalibreringen utfördes. Data representerar medelvärdet ± SEM från n = 3-experiment, 2-vägs ANOVA, Sidaks multipla jämförelse test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
För att ytterligare validera vår teknik, krävde vi då en positiv kontroll för att visa att tekniken var kapabel att upptäcka en "förväntad" förändring i ASL pH. Eftersom närvaron av en surare ASL i CF-celler är fortfarande kontroversiellt, vi använde Camp agonist forskolin, som en positiv kontroll villkor, för att stimulera HCO3- sekretion genom CFTR. Förväntade resultat skulle visa en forskolin-inducerad alkalisering av ASL i icke-CF-celler som skulle till stor del minskas eller avskaffas i CF-celler beroende på svårighets graden av mutationer. Figur 4a visar representativa spår av ASL pH i icke-CF-och CF-celler över tid och figur 4b visar medeldata för ASL pH före och efter behandling med forskolin i båda cell typerna. Vi kan få olika information från dessa resultat. Först, som redan visats i figur 3B, C, den vilande ASL pH var inte annorlunda mellan icke-CF och CF epitel. För det andra, den första 3-4 tid-poäng efter paus experimentet för att behandla cellerna med forskolin, visade en stor ökning av pH som återvinns inom ~ 15 min. Detta berodde på minskningen av CO2 -koncentrationen mellan plattläsaren (5%) och säkerhets skåpet för vävnads kultur (~ 0%). Enligt Henderson Hasselbalch ekvation, ett pH på 7 i en 5% co2 miljö motsvarar en koncentration av HCO3- av ~ 9,3 mm. När cellerna tas bort från plattan läsaren, en droppe i CO2 koncentration till 0% kommer teoretiskt leda till en ökning av pH i > 8. Figur 4a visar att ASL pH ökade till ~ 7,8 som kan förklaras av den tid som ompositionerar plattan i plattan läsaren (dvs i en 5% co2 miljö). Slutligen, som förutspådde, tillägg av basolateral 10 μM forskolin (FSK) ökade signifikant ASL pH i icke-CF kulturer endast. Som det har visats av olika grupper att det finns en skillnad i Steady-State ASL pH mellan CF och icke-CF epitel, vi ville ytterligare undersöka den uppenbara avsaknaden av en pH-skillnad i våra experiment och roll CFTR. För att göra detta förruinerade vi icke-CF-kulturer med den specifika CFTR-hämmaren, CFTRinh172 (172). Som anges i protokoll avsnitt 2,8, blandades färg ämnet blandningen enligt ovan och inhibitorer lades till vid en koncentration på 0,1 X = 2 μM. Enligt litteraturen, ASL höjd icke-CF-celler är cirka 10 μm. I ett semi-permeable stöd av 6,5 mm diameter, är den teoretiska volymen av ASL därför π × 3,252 = 0,3 μl. Genom att tillsätta 3 μL färg ämne + 172 vid 2 μM, kommer koncentrationen av inhibitoren, efter absorption av överskotts vätskan, teoretiskt att vara 20 μM (1x, önskad koncentration). Representativa spår i figur 4c och genomsnittlig Sammanfattning i figur 4d visar att 172 inte minska vilande ASL pH men hindrade forskolin-inducerad ökning av ASL pH, vilket bekräftar våra resultat från icke-CF kontra CF kulturer och ytterligare validera vår teknik.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig4v5.jpg"> Figur 4: Dynamic ASL pH-mätning som svar på CFTR aktivering av forskolin. (A) representativa spår av effekten av forskolin (FSK, 10 μM) på kinetiken av ASL pH över tiden i icke-CF och CF haecs. Data representerar medelvärdet ± SEM från n = 3-experiment. (B) Sammanfattning av effekten av FSK på ASL pH i icke-CF-och CF-kulturer. Data representerar medelvärdet ± SD från n = 69 non-CF-kulturer och 35 CF-kulturer (2-vägs ANOVA, Sidaks multipla jämförelse test). (C) representativa spår av effekten av CFTRinh172 (172, 20 ΜM) på FSK-inducerad ökning av ASL pH i icke-CF haecs. Data representerar medelvärdet ± SEM från n = 5-experiment. (D) Sammanfattning av effekten av 172 på FSK-inducerad alkalisering av ASL i icke-CF-kulturer. Data representerar medelvärdet ± SEM från n = 5 experiment (2-vägs ANOVA, Sidaks multipla jämförelser test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Slutligen, såsom anges i protokoll avsnitt 6,8, kan man beräkna graden av försurning/alkalinisering genom att anpassa en linjär regression till de initiala tids punkterna efter interventionen. Figur 5a visar att avlägsnandet av den basolaterala HCO3- innehållande lösningen (HCO3- krb) och ersatte den med en buffrad Hepes lösning, i avsaknad av co2, inducerade en markant försurning av ASL. Detta är förenligt med avsaknaden av HCO3- hämmande transepitelial HCO3- sekretion, vilket gör att konstitutiv Proton sekretion av dessa luftvägs celler att stadigt minska ASL pH15, 17. Intressant, den initiala andelen försurning av icke-CF-celler var betydligt långsammare än CF-kulturer (Figur 5b).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig5.jpg"> Figur 5: dynamiska förändringar i ASL pH som svar på HCO3- borttagning. (A) representativa spår som visar effekten av HCO3- avlägsnande på kinetiken av ASL pH över tiden i icke-CF och CF haecs. De initiala nivåerna för försurning erhölls via lutningen på en rät linje monterad på 7 tids punkter efter HCO3- avlägsnande. Data representerar medel ± SEM från n = 6 och 7 experiment på icke-CF-och CF-kulturer respektive. BSammanfattning av de ursprungliga försurnings satserna efter HCO3- avlägsnande. Data representerar medel ± SEM från n = 6 och 7 experiment på icke-CF-och CF-kulturer respektive (Mann-Whitney-test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells at JoVE.com

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-Time, semi-automatiserad fluorescerande mätning av luftvägarna yta flytande pH i primära humana luftvägs epitelceller

Vi presenterar ett protokoll för att göra dynamiska mätningar av luftvägarna ytan flytande pH under tunna film förhållanden med hjälp av en tallrik-läsare.

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Vårt protokoll är det första som tillåter dynamisk mätning av luftvägsytvätska, eller ASL pH, i realtid under både vila och efter agonist eller inhibitorbehandling. Denna metod bidrar till att identifiera jonkanaler och transportörer som deltar i extracellulära pH-reglering och skulle kunna tillämpas på andra cellsystem där detta är viktigt, såsom cancer. Nu jämfört med tidigare publicerade metoder, är denna nya teknik relativt enkel att utföra.Det kräver inte specialiserad utrustning. Och kan göra ASL pH-mätningar samtidigt i flera kulturer under luft flytande gränssnitt, eller tunn film förhållanden. Viktigt, denna nya teknik har potential att bedöma effekterna av nya therapeutics, inte bara för cystisk fibros, men också för andra kroniska luftvägssjukdomar, såsom astma och KOL.Efter minst 28 dagars kultur, tvätta den apikala ytan av en mänsklig luftvägsepitetelcellodling med 150 mikroliter av bikarbonat som innehåller Krebs buffertlösning i 20 minuter på cellkulturinkubatorn. I slutet av inkubationen, använd en steril glaspip med en steril P200 pipet spets kopplad till en aspirationspump, att försiktigt aspirera tvätten utan att störa epitelet. Det bör finnas så lite vätska kvar på den apikala ytan som möjligt för att återställa luft vätska gränssnittet.Sedan tillbaka cellerna till cellodlingen inkubatorn i 30 minuter. Om du vill utföra en bakgrundsmätning aktiverar du plattläsaren och datorn. När du har öppnat instrumentpanelen klickar du på Spark 10M och ställer in temperaturkontrollen på 37 grader Celsius.Öppna sedan gaskontrollen och ställ in koldioxiden på 5%När temperaturen och gasen har nått sina mål, öppna tallriksläsarlådan och sätt in en fuktighetskask som är fylld med sex milliliter destillerat vatten på varje sida i läsaren. Bekräfta att locket och botten av cellodlingsplattan är rena och placera plattan på fuktighetskassetten, sätt på locket igen och stäng draglådan. Öppna Spark Method-redigeraren, välj lämplig plåtmall och välj de brunnar som ska övervakas under experimentet.Lägg till en kontrollpanel för temperatur och koldioxid och ställ in panelerna på 37 grader Celsius respektive 5%. Kryssa sedan för att vänta på temperatur/gasboxar. Lägg till en kinetisk looppanel och välj varaktigheten som looptyp.Ställ in varaktigheten på fem minuter och ange intervalltypen för experimentet till att inte definiera, för att erhålla en kontinuerlig avläsning. Inom den kinetiska slingan, använd dra och släpp-funktionen för att lägga till två fluorescens intensitet paneler som kommer att vara individuellt inställd för pH-känsliga och pH-okänsliga fluorescerande färgämnen. Ställ in excitations- och emissionsvåglängden till 560 respektive 590 nanometer för det pH-känsliga färgämnet.Och 495 respektive 520 nanometer för det pH-okänsliga färgämnet. Ställ in antalet blixtar till 30 och z-positionen till 33, 200 för varje fluorofor. Ställ in flera läsa per brunn till användardefinierade, som en tre av tre av cirkel med en kantlinje på 4, 750 mikrometer.Klicka på start för att initiera bakgrundsmätningen läsning och klicka okej, för att bekräfta att locket på fuktighetskassetten är på plats. I slutet av mätningen, överför plattan från plattan läsaren till en vävnad kultur säkerhetsskåp och tillsätt tre mikroliter av nyberedda dextran-kopplade fluorescerande färgämne lösning till den apikala ytan av cellerna. Sedan tillbaka plattan till cellkultur inkubatorn över natten.För kinetikmätningen öppnar du den metodfil som används för bakgrundsmätningarna. När alla parametrar har ställts in öppnar du tallriksläsarlådan och sätter i fuktighetskasskens. Placera den rena plattan i fuktighetskassetten med dess hölje och klicka på Start för att initiera fluorescensavläsningarna.Klicka sedan på okej, för att bekräfta att locket på fuktighetskassetten är på plats. Efter minst 12 cykler, klicka på paus för att avbryta experimentet och ta bort plattan för att basolaterally tillämpa några droger eller agonister till lämpliga prover. Återför plattan till fuktighetskasskens på facket och placera om fuktighetskassettlocket, innan du klickar på fortsätt, för att ytterligare registrera ASL pH och för att övervaka effekten av behandlingen.För in situ pH-kalibrering, ta bort plattan från plattan läsaren och aspirera den basolaterala lösningen. Tillsätt 750 mikroliter av mycket buffrad standardkurvalösning till basolateralfacket och en mikroliter lösning till den apikala ytan. Stäng av koldioxiden på plåtavläsaren och återför plattan till fuktighetskassken.Ställ sedan in plattläsaren med samma parametrar som visats, men utan koldioxid, och starta fluorescensvärdena var femte minut i en till en och en halv timme. För dataanalys väljer du alla medeldata för varje prov och, eller villkor för båda våglängderna i bakgrundsfilen och kopierar och klistrar in data i en ny fil. Beräkna sedan medelbakgrunden för varje brunn och varje våglängd.Efter att ha kopierat och klistrat in kalibrerings- och kinetiska data på samma sätt, subtrahera bakgrunden från varje datapunkt för varje våglängd. För varje tidpunkt och varje prov beräknar du förhållandet mellan den pH-känsliga och den pH-okänsliga fluorescensen. För varje tidspunkt, generera en standardkurva från nyckeltalen och rita de kända pH-värdena på x-axeln och nyckeltalen på y-axeln.Bestäm den tidpunkt vid vilken nyckeltalen är stabila, passa en linjär regressionslinje och få ekvationen för denna linje. Sedan beräknar pH för varje tidspunkt och rita pH-värdet på y-axeln och tiden på x-axeln. I detta representativa preliminära experiment utan celler vid samma pH och samma koncentration skilde sig de pH-känsliga och pH-okänsliga emissionskvoterna åt beroende på färgämnets volym.Vid samma pH och samma volym gav dessutom olika färgämneskoncentrationer olika relationsvärden, vilket indikerar att förändringar i volymen eller färgämneskoncentrationen påverkar det absoluta värdet av pH-värdet som beräknats utifrån utsläppsförhållandet. Dessutom är den tid som krävs för temperaturjämvikt cirka 15 till 20 minuter oavsett färgämnesvolym eller koncentration. ASL pH-värden som erhållits från en enda global standardkurva visar på en signifikant skillnad mellan icke-cystisk fibros och cystisk fibros kulturer.Medan ASL pH inte skiljer sig nämns avsevärt mellan cystisk fibros och icke-cystisk fibros mänskliga luftvägarna epitelceller när pH beräknas från oberoende standard kurvor. Därför är det viktigt att generera oberoende kalibreringskurvor för varje experiment och inom varje experiment, för varje givarprov, som när kalibreringskurvorna är i genomsnitt tillsammans, högre pH-känsliga, pH-okänsliga förhållandevärden finns i cystisk fibros kulturer som anger ett surare pH. Som väntat, tillägg av basolateral forskolin ökar avsevärt ASL pH i icke-cystisk fibros kulturer bara.Eftersom dessa celler har hållits under sterilt skick, kan de tvättas, åter utfodras och användas några dagar senare för framtida experiment. Alla biologiska människoexemplar bör betraktas som potentiellt farliga. Så se till att använda lämplig nivå av inneslutning och personlig skyddsutrustning beroende på dina prover.Det är viktigt att utföra bakgrundsmätningarna och pH-kalibreringarna för varje uppsättning prover för att minska variabiliteten mellan givare och förbättra noggrannheten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rening av biotinylerade cellytaproteiner från<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epitelceller

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Spårning i realtid av DNA-fragment separering av smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Halvautomatisk Biopanning bakteriell Display bibliotek för peptid affinitet reagens identifiering och analys av resulterande isolat

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

Regenerering av klädd guld mikroelektroder utrustade för en realtid Cell Analyzer

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Realtid Observation av DNA Strand Exchange reaktionen medieras av Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Undersöka dynamiken i cellulära vidhäftning och spridning av epitelceller på fibronectin under oxidativ stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Oriktad flytande kromatografi-Mass Pektrometri-Baserade metabolomika analys av vetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Mätning av nukleotidbindning till intakta, funktionella membranproteiner i realtid

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Aktivera Realtidskompensation i Snabb Fotokemiska oxidationer av proteiner för bestämning av Protein Topografi Förändringar

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellulär glukosutarmning som ett indirekt mått på glukosupptag i celler och vävnader ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...