Name: imaging of in situ interferon gamma production in the mouse spleen following listeria monocytogenes infection
Uploaded: 2019-07-16T14:00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection at JoVE.com

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+2-photon+imaging+of+peripheral+lymph+nodes+in+mice.">Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), 265 (2007).</li><li>Pope, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+regulation+of+the+CD8++T+cell+response+to+Listeria+monocytogenes+infection.">Organ-specific regulation of the CD8+ T cell response to Listeria monocytogenes infection.</a> Journal of Immunology. 166 (5), 3402-3409 (2001).</li><li>Jones, G. S., D'Orazio, S. 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लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

इस पांडुलिपि में, हम चूहों में एल monocytogenes संक्रमण के बाद तिल्ली में IFN$ उत्पादन कल्पना करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल सरल है और अन्य ऊतकों और साइटोकिन ट्रिगर्स के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन निम्नलिखित पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए। कोशिकाओं अक्सर तेजी से cytokines वे उत्पादन स्रावित, और cytokines तेजी से पड़ोसी कोशिकाओं द्वारा उठाया जाता है. यह इस तरह के रूप में situ में cytokines का पता लगाने के लिए मुश्किल है. तेजी से cytokine उत्पादन फिर से आरंभ करने के लिए एक आम तरीका एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसॉरबेंट परख द्वारा मीडिया में साइटोकीन का पता लगाने के बाद कोशिकाओं को फिर से उत्तेजित करना है। इस संदर्भ में, साइटोकिन उत्पादक कोशिकाओं के स्थानिक स्थानीयकरण के बारे में कोई भी जानकारी खो जाती है। इसके अलावा, cytokine उत्पादन फिर से उत्तेजना के बाद जरूरी प्रतिबिंबित नहीं करता है कि cytokines वास्तव में उत्पादन कर रहे हैं और विवो में स्रावित होता है, बल्कि एक दिया सेल आबादी की क्षमता को इंगित करता है cytokines का उत्पादन. इसलिए, दोनों तरीकों अलग जानकारी प्रदान करेगा और एक पर विचार करना चाहिए जो जानकारी उनके प्रयोग के लिए सबसे मूल्यवान है.
इंट्रासेल्यूलर साइटोकिन्स का पता लगाने के लिए, हमारी विधि कोशिकाओं के अंदर साइटोकिन्स को ट्रैप करने और सिग्नल का पता लगाने में वृद्धि करने के लिए इंट्रासेल्यूलर प्रोटीन ट्रांसपोर्ट अवरोधक का उपयोग करती है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ये अवरोधक एंडोथेलियल रेटिक्युलम (आरई) से गोलगी उपकरण तक और उनकी रिहाई को बाधित करने वाले स्रावी vesicle से प्रोटीन के सामान्य परिवहन को प्रभावित करते हैं, जो विषाक्तता का कारण बन सकता है। एक परिणाम के रूप में, BFA, या अन्य अवरोध करनेवाला, समय की एक छोटी अवधि के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, आम तौर पर कुछ घंटों से अधिक नहीं. इसलिए, गंभीर साइटोटॉक्सिक प्रभाव के कारण के बिना सेल के अंदर फंस cytokines के स्तर का अनुकूलन करने के लिए अवरोधक खुराक और उपचार के समय के बीच सही संतुलन खोजने के लिए महत्वपूर्ण है। इन चर cytokines और BFA के लिए प्रशासन के मार्ग के बीच अलग कर सकते हैं. हमारे संक्रमण मॉडल में, बीएफए को एक तेजी से प्रणालीगत फैलाव प्रदान करने के लिए इंट्रापेरिटोनली को व्यवस्थित किया गया था, लेकिन इसे अंतःशिरा भी वितरित किया जा सकता है।
सबसे अधिक इस्तेमाल किया intracellular प्रोटीन परिवहन inhibitors BFA हैं, यहाँ इस्तेमाल किया, और monensin (MN). इन अवरोधकों अक्सर indistinctly जमा और cytokine उत्पादन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन वे कार्रवाई के अपने तंत्र में मामूली अंतर है. एम.एन. गोलगी तंत्र के भीतर प्रोटीन के परिवहन को रोकता है इसलिए गोलगी में प्रोटीन जमा17 जबकि बीएफए कोटॉमर प्रोटीन कॉम्प्लेक्स-I भर्ती को रोकता है, जो एन्डोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) को प्रोटीन के प्रतिगामी आंदोलन को रोकता है। और इस प्रकार ईआर18में साइटोकिन्स के संचय को बढ़ावा देने . इस तरह के रूप में, सबसे अच्छा intracellular प्रोटीन परिवहन अवरोध करनेवाला का चयन विभिन्न कारकों पर निर्भर करेगा, जैसे cytokine का पता लगाया जा करने के लिए. उदाहरण के लिए, यह lipopolisaccharide में दिखाया गया है प्रेरित intracellular monocytes के दाग है कि BFA साइटोकिन्स आईएल-1 को मापने के लिए अधिक कुशल है, आईएल -6 और TNF MN19से .
इस प्रोटोकॉल confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा situ में cytokine के दृश्य शामिल है और इसलिए वहाँ केवल मार्करों की एक सीमित संख्या से cytokine उत्पादन कोशिकाओं और उनके microenvironment अध्ययन किया जा सकता है. यह भी विचार करना आवश्यक है कि बीएफए या एमएन जैसे प्रोटीन परिवहन अवरोधक कई प्रोटीन की सामान्य अभिव्यक्ति को परेशान करते हैं और इसलिए कुछ सक्रियण सेल सतह मार्करों की एक साथ अभिव्यक्ति का अध्ययन करते समय उनके उपयोग से संपर्क करना होगा ध्यान. उदाहरण के लिए, BFA लेकिन नहीं MN murine लिम्फोसाइटों20में CD69 की अभिव्यक्ति ब्लॉक. इस सीमा के बावजूद, confocal इमेजिंग cytokines के उप-कोशिकीय स्थानीयकरण, साथ ही सेल के भीतर साइटोकिन स्राव की दिशा में सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न किए गए डेटा से पता चलता है कि एनके कोशिकाओं को एक फैलाना पैटर्न में IFN-y स्रावित करते हैं, जबकि CD8+ T कोशिकाओं को अन्य CD8 + टी कोशिकाओं है कि उनके साथ सीधे बातचीत में हैं की ओर IFN] स्राव प्रत्यक्ष लग तेहैं5.
समाप्त करने के लिए, इस प्रोटोकॉल situ में cytokines की एक किस्म कल्पना और इस तरह के संक्रमण या autoimmunity के रूप में कई ट्रिगर के बाद उत्पादन कोशिकाओं और उनके microenvironment की पहचान करने के लिए उपयुक्त है. प्राप्त जानकारी विभिन्न सेल प्रकार के vivo स्थानिक orchestration के महत्व को समझने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है और cytokine वे उत्पादन, एक कुशल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक.

एक रोगजनक के खिलाफ एक कुशल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आर्केस्ट्रा प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि अक्सर जीव के बीच बिखरे हुए हैं की एक किस्म द्वारा प्रदर्शित संकेतों के जटिल एकीकरण की आवश्यकता है. संवाद करने के लिए, इन कोशिकाओं को कई जैविक कार्यों के साथ छोटे घुलनशील प्रोटीन का उत्पादन है कि cytokines नाम इम्यूनोमॉड्यूलेटर के रूप में कार्य. Cytokines नियंत्रण सेल भर्ती, सक्रियण और प्रसार और इसलिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं1के संवर्धन में प्रमुख खिलाड़ी होने के लिए जाना जाता है. प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए विशिष्ट संकेतों को प्रेरित करने के लिए विशिष्ट कोशिकाओं को जोड़ने वाले एक बहुत ही संगठित spatiotemporal पैटर्न में साइटोकिन्स जारी करने की आवश्यकता होती है। इसलिए, साइटोकिन उत्पादन और सिटोकिन उत्पादन में इसके संकेत का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है, जिसमें साइटोकिन्स का उत्पादन किया जाता है, सूक्ष्म पर्यावरण को ध्यान में रखते हुए।
लिस्टिरिया मोनोसाइटोजीन्स (एल मोनोसाइटोजेन्स) चूहों में इंट्रासेल्यूलर रोगजनकों के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक प्रमुख मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाने वाला ग्राम-पॉजीटिव इंट्राकोशिकीय जीवाणु है। एक साइटोकिन, IFN गामा (IFN] तेजी से उत्पादन किया जाता है, 24 एच के भीतर एल monocytogenes संक्रमण के बाद. यह रोगज़नक़ निकासी के लिए आवश्यक है, क्योंकि चूहों ने आईएफएन के लिए दस्तक दी है, एल मोनोसाइटोजीन्स संक्रमण2के लिए अत्यधिक संवेदनशील हैं। आईएफएनजेड प्लेरियोट्रोपिक है और संक्रमण के बाद कई कोशिकाओं द्वारा उत्पादित3. जबकि प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं द्वारा उत्पादित IFN] प्रत्यक्ष विरोधी बैक्टीरियल गतिविधिकेलिए आवश्यक है 4, IFN] अन्य स्रोतों से अन्य कार्य किया है दिखाया गया है. वास्तव में, हमने और अन्य लोगों ने हाल ही में पाया कि सी डी 8+ टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित आईएफएन जेड का एक विशिष्ट कार्य है जो सीधे टी सेल विभेदन5,6,7को विनियमित करने में एक विशिष्ट कार्य करता है। इस प्रकार, यह समझना कि कौन सी कोशिकाएं आईएफएन का उत्पादन करती हैं (और जिसमें सूक्ष्म पर्यावरण) अपने कार्य को विभाजित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
साइटोकिन उत्पादन का अध्ययन करने के लिए सबसे आम तकनीक प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किए गए इंट्रासेल्यूलर साइटोकीन धुंधला पर निर्भर करती है। इस विधि एक ही नमूना के भीतर सेल सतह मार्करों के साथ संयुक्त कई cytokines के एक साथ पता लगाने की अनुमति देता है, cytokine उत्पादन का अध्ययन करने के लिए एक अत्यंत उपयोगी उपकरण प्रदान. तथापि, उपर्युक्त तकनीक का उपयोग करने का अर्थ है किसी भी स्थानिक जानकारी को खोना। इसके अलावा, cytokine का पता लगाने अक्सर साइटोकिन का पता लगाने को सक्षम करने के लिए इन विट्रो फिर से उत्तेजना पर निर्भर करता है. इस प्रकार, साइटोकीन का उत्पादन करने के लिए दिए गए सेल की क्षमता का विश्लेषण किया जाता है, और यह आवश्यक रूप से स्थिति में वास्तविक साइटोकीन स्राव के साथ सहसंबंधित नहीं करता है। अन्य तरीकों रिपोर्टर चूहों जिसके लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति साइटोकीन प्रतिलेखन के साथ संबंधित है और एक एकल कोशिका स्तर8पर दृश्य के लिए अनुमति देता है का उपयोग करें। हालांकि इस विधि situ में cytokine प्रतिलेखन ट्रैक कर सकते हैं, वहाँ cytokine-रिपोर्टर चूहों की एक सीमित संख्या में उपलब्ध हैं. इसके अलावा, प्रतिलेखन, अनुवाद और स्राव कभी कभी अनलिंक किया जा सकता है, और फ्लोरोसेंट प्रोटीन cytokine वे रिपोर्ट की तुलना में एक अलग आधा जीवन है, इस विधि कभी कभी situ cytokine दृश्य में के लिए पर्याप्त नहीं बना.
यहाँ, हम एक सेल संकल्प पर confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा situ cytokine उत्पादन में कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन. इस तकनीक के ऊतकों के भीतर सेलुलर स्रोत और आसपास के आला के दृश्य सक्षम बनाता है. इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से एल monocytogenes संक्रमित चूहों की तिल्ली में IFN] उत्पादन के दृश्य का वर्णन करता है, एनके कोशिकाओं और प्रतिजन विशिष्ट CD8+ टी कोशिकाओं द्वारा IFN] उत्पादन पर यहाँ ध्यान केंद्रित. हालांकि, यह बढ़ाया जा सकता है और अन्य स्थितियों जहां cytokines ऐसे संक्रमण, सूजन या autoimmune रोगों के रूप में उत्पादित कर रहे हैं के संदर्भ में किसी भी cytokine उत्पादन की विशेषता के लिए अनुकूलित, जब तक लक्षित साइटोकीन कोशिकाओं में बनाए रखा जा सकता है इंट्रासेल्यूलर प्रोटीन परिवहन अवरोधक द्वारा.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Cambridge bioscience</td>
			<td>CAY11861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar scientific</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma lifescience</td>
			<td>L5751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium meta-periodate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20504</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-saccharose</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27480.294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision wipes paper Kimtech science</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>75512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101302</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides - Superfrost Plus</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>631-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD169 - AF647</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142407</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml 
			Excitation wavelength: 650 
			 Emission wavelength: 65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-F4/80 - APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123115</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml 
			Excitation wavelength: 650 
			 Emission wavelength: 660</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-B220 - PB</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103230</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/ml 
			Excitation wavelength: 410 
			 Emission wavelength: 455</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IFNg - biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505804</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IFNg - BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505829</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml 
			Excitation wavelength: 405 
			 Emission wavelength: 436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nkp46/NCRI</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2225</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-goat IgG-FITC</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td>NPp 1-74814</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: 1 mg/ml 
			Excitation wavelength: 490 
			 Emission wavelength: 525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin - PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405203</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml 
			Excitation wavelength: 565 
			 Emission wavelength: 578</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin - FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405201</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml 
			Excitation wavelength: 490 
			 Emission wavelength: 525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses 22x40mm</td>
			<td>Menzel-Glazer</td>
			<td>12352128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid blocker super PAP PEN mini</td>
			<td>Axxora</td>
			<td>CAC-DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris - Microscopy Image Analysis Software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
	
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - Olympus FV1200 Laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat - CM 1900 UV</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base mould disposable</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>11670990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Life Technologies Ltd</td>
			<td>20012068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Broth</td>
			<td>VWR Brand</td>
			<td>303415ZA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td> 
			Excitation wavelength: 484 
			 Emission wavelength: 507</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td> 
			Excitation wavelength: 558 
			 Emission wavelength: 583</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe, with needle, 29G</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDAM324824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 wild type mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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imaging of in situ interferon gamma production in the mouse spleen following listeria monocytogenes infection

Cytokines कोशिकाओं द्वारा स्रावित छोटे प्रोटीन होते हैं, सेल सेल संचार है कि प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं मध्यस्थता. cytokines की एक विशेषता उनके pleiotropism है, के रूप में वे द्वारा उत्पादित कर रहे हैं और सेल प्रकार की एक भीड़ को प्रभावित कर सकते हैं. इस तरह, यह न केवल जो कोशिकाओं cytokines का उत्पादन कर रहे हैं समझने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी जो वातावरण में वे ऐसा करते हैं, ताकि अधिक विशिष्ट चिकित्सा को परिभाषित करने के लिए. यहाँ, हम जीवाणु संक्रमण के बाद situ में साइटोकीन उत्पादन कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन. इस तकनीक confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा अपने मूल वातावरण में इमेजिंग cytokine उत्पादन कोशिकाओं पर निर्भर करता है. ऐसा करने के लिए, ऊतक वर्गों एक साइटोकिन दाग के साथ एक साथ कई सेल प्रकार के मार्करों के लिए दाग रहे हैं. इस विधि की कुंजी, साइटोकिन स्राव ब्याज के ऊतकों को काटने से पहले सीधे विवो में अवरुद्ध है, जिससे कोशिका की कोशिकाओं के अंदर जमा साइटोकिन का पता लगाने की अनुमति मिलती है। इस विधि के लाभ एकाधिक हैं. सबसे पहले, microenvironment जिसमें cytokines का उत्पादन कर रहे हैं संरक्षित है, जो अंततः cytokine उत्पादन और उन cytokines से प्रभावित कोशिकाओं के लिए आवश्यक संकेतों पर सूचित कर सकता है. इसके अलावा, यह विधि विवो में साइटोकिन उत्पादन के स्थान का संकेत देती है, क्योंकि यह उत्पादक कोशिकाओं के विट्रो में कृत्रिम पर निर्भर नहीं करती है। हालांकि, साइटोकिन प्राप्त करने वाली कोशिकाओं में साइटोकीन डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग का एक साथ विश्लेषण करना संभव नहीं है। इसी प्रकार, साइटोकिन संकेतों को केवल समय-खिड़की के अनुरूप देखा जाता है, जिसके दौरान साइटोकिन स्राव अवरुद्ध किया गया था। जब कि हम इंट्रासेल्यूलर बैक्टीरिया लिस्टिरिया मोनोसाइटोजेनेस द्वारा माउस संक्रमण के बाद तिल्ली में साइटोकिन इंटरफेरॉन (IFN) गामा के दृश्य का वर्णन करते हैं, तो इस विधि को संभवतः किसी भी साइटोकीन के दृश्य के लिए अनुकूलित किया जा सकता है सबसे अंगों.

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Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

यहाँ, हम एक साधारण confocal इमेजिंग विधि का वर्णन करने के लिए murine माध्यमिक लिम्फोइड अंगों में साइटोकीन इंटरफेरॉन गामा स्रावित कोशिकाओं के situ स्थानीयकरण कल्पना. इस प्रोटोकॉल विभिन्न ऊतकों में अन्य cytokines के दृश्य के लिए बढ़ाया जा सकता है.

लिस्टिरिया मोनोसाइटोजेनेस संक्रमण के बाद माउस स्प्लेन में सीटू इंटरफेरॉन गामा उत्पादन की इमेजिंग

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह हमें माइक्रोएनवायरमेंट की कल्पना करने की अनुमति देता है जहां कोशिकाएं एक दिए गए साइटोकिन का उत्पादन करती हैं, यहां, इंटरफेरॉन गामा। यह स्वीकार किया जाता है कि साइटोकिन्स की कार्रवाई की सीमा सीमित है क्योंकि ऊतक इतने जटिल हैं। यह कोशिकाओं है कि इंटरफेरॉन गामा उत्पादन कोशिकाओं के चारों ओर की विशेषता के लिए इंगित करने के लिए जो कोशिकाओं को ले जा रहा होगा महत्वपूर्ण है ।तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह ब्याज के ऊतकों में मौजूद माइक्रोएनवायरमेंट को बाधित नहीं करता है। इसके अलावा, क्योंकि हम कृत्रिम रूप से कोशिकाओं को फिर से इसलिए नहीं करते हैं कि वे इंटरफेरॉन गामा का उत्पादन करने के लिए मजबूर करें, यह हमें एक बेहतर लक्षण वर्णन देता है कि क्या कोशिकाएं वास्तव में सक्रिय रूप से सीटू में इंटरफेरॉन गामा का उत्पादन कर रही हैं। इस प्रोटोकॉल को संभावित रूप से अन्य अंगों के लिए और अन्य साइटोकिन्स के दृश्य के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।इस प्रोटोकॉल में अधिकांश चरण सरल हैं, लेकिन ऊतक, ठंड और अनुभागिंग की हैंडलिंग, ऊतक की अखंडता को बनाए रखने के लिए देखभाल के साथ किया जाना चाहिए। शुरू करने के लिए, एलएम के ३०० माइक्रोलीटर को स्थानांतरित करने के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित एक फ्लास्क में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक शोरबा दिल जलसेक को OVA व्यक्त करने के लिए संशोधित । लमल आंदोलन के लिए एक शेखर पर फ्लास्क रखें एलएम को घातीय चरण में विकसित करने के लिए जब तक OD600 0.08 से 0.1 तक नहीं पहुंचता है।पीबीएस में एलएम ओवी संस्कृति को 0.1 गुना घातक खुराक की एकाग्रता के लिए कमजोर करने के बाद, 50% 29 गेज इंसुलिन सिरिंज का उपयोग नसों में 100 माइक्रोलीटर को C57 काले 6 जंगली प्रकार के चूहों में इंजेक्ट करने के लिए करता है जो OT1 GFP या OT1 RFP कोशिकाओं को प्रभावित करता है। माउस बलिदान से 6 घंटे पहले साइटोकिन स्राव को अवरुद्ध करने के लिए, 29 गेज इंसुलिन सिरिंज के साथ 250 माइक्रोग्राम बीएफए और पीबीएस के 200 माइक्रोलीटर को इंट्रापेरिटोनली इंजेक्ट करें। कार्बन डाइऑक्साइड और बाद में गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग कर चूहों के इच्छामृत्यु के बाद, 70% इथेनॉल के साथ पेट को साफ करें।माउस के बाएं पार्श्व पर जहां तिल्ली स्थित है, एक से दो सेंटीमीटर का चीरा लगाने के लिए कैंची के साथ त्वचा के माध्यम से काटा जाता है। फिर, तिल्ली को बेनकाब करने और चिमटी के साथ इसे बाहर निकालने के लिए पेरिटोनम में सावधानी से एक चीरा बनाएं। सावधान रहें कि इसे संदंश के साथ निचोड़ें या तिल्ली वास्तुकला को बाधित करने से बचने के लिए इसे काटें।अब, 3.75 मिलीलीटर पीबीएस और 3.75 मिलीलीटर 0.2 मोलर एल-लिसिन को मिलाकर फिक्सेटिव समाधान तैयार करें। इसमें 21 मिलीग्राम सोडियम एम-पीरियोमेट डालकर अच्छी तरह मिला लें। इसके बाद 4% पीएफए के 2.5 मिलीलीटर और 12 सामान्य सोडियम हाइड्रोक्साइड के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें।तिल्ली को तीन भागों में काट लें। एक छह अच्छी तरह से थाली में फिक्सेटिव में तिल्ली जलमग्न और चार घंटे की एक ंयूनतम के लिए तय करते हैं । एक विशिष्ट निर्धारण अवधि कोमल आंदोलन के तहत चार डिग्री सेल्सियस पर 16 से 20 घंटे है ।उसके बाद, फिक्सेटिव समाधान को त्यागें और कोमल आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए पीबीएस के पांच मिलीलीटर जोड़ें। फिर, पीबीएस को 30% सुक्रोज के पांच मिलीलीटर के साथ बदलें और ऊतक आकृति विज्ञान को बनाए रखने के लिए 12 से 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। अब, अंग प्लेट के नीचे डूब जाता है।नमूना फ्रीज करने के लिए, एक बड़े गोदाम में सूखी बर्फ डाल दिया और शुद्ध मेथनॉल के लगभग ५० मिलीलीटर और सूखी बर्फ के कुछ टुकड़े युक्त अंदर एक छोटे पात्र जगह है । धीरे-धीरे एक लिंट-फ्री पोंछ पर तिल्ली को सुखा लें। बेस मोल्ड के नीचे अक्टूबर यौगिक की एक बूंद ड्रिप करें और प्लीहा को मोल्ड के अंदर रखें।किसी भी बुलबुले का उत्पादन करने के लिए नहीं सावधान रहना। तिल्ली पर अक्टूबर के लगभग एक मिलीलीटर जोड़ें । संदंश के साथ, शुष्क आइस बाथ में मेथनॉल की सतह पर बेस मोल्ड जमा करें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि मेथनॉल अक्टूबर को नहीं छूता है।अक्टूबर गाढ़ा हो जाएगा और सफेद हो जब जमे हुए । कलाकृतियों को कम करने के लिए जितनी जल्दी हो सके ऊतक को फ्रीज करना याद रखें। क्रायो-माइक्रोटॉम पर, शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस तापमान पर सेट करें।ऊतक को वांछित मोटाई में अनुभाग करें, लगभग 10 माइक्रोमीटर। ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों को इकट्ठा करने और नेत्रहीन निरीक्षण करने के लिए एक ब्रश का उपयोग करें। वर्गों को कमरे के तापमान पर आने दें।तरल अवरोधक के साथ एक चक्र ड्रा, उदाहरण के लिए, एक पीएपी कलम, अक्टूबर के बाहर ऊतक अनुभाग के आसपास । एक बार टिश्यू सूख जाने के बाद, पांच मिनट के लिए टिश्यू सेक्शन पर पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर टपकाव से नमूने को रीहाइड्रेट करें। फिर, आकांक्षा द्वारा अनुभाग से पीबीएस को हटा दें और प्रति नमूना अनुभाग अवरुद्ध समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।कमरे के तापमान पर न्यूनतम एक घंटे के लिए एक कवर गीले कक्ष में इनक्यूबेट। प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग करने के लिए, प्रत्येक नमूने के लिए तैयार प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण के साथ अवरुद्ध समाधान को बदलें। पांडुलिपि के अनुसार धोने से पहले एक कवर गीले कक्ष में चार डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर चार घंटे या रात भर के लिए इनक्यूबेट ।अब, अवरुद्ध समाधान में, एक इष्टतम एकाग्रता के लिए ब्याज की माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें, आमतौर पर 2.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर। अनुभाग से अंतिम धोने के समाधान को हटा दें और अनुभाग के शीर्ष पर तैयार माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण जोड़ें और एक कवर गीले कक्ष में कमरे के तापमान पर एक से चार घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। पांडुलिपि के अनुसार वॉश बफर से धोने के बाद वॉश सॉल्यूशन निकालें और पीबीएस के साथ फाइनल वॉश करें।फॉस्फेट-बफर नमकीन को एस्पिरेट करें और शेष पीबीएस को पूरी तरह से सूखने वाले अनुभाग के बिना वाष्पित होने की अनुमति दें। स्लाइड के पीछे अनुभाग के चारों ओर एक चक्र बनाएं। फिर, नमूने के शीर्ष पर बढ़ते माध्यम की एक बूंद रखें, यह सुनिश्चित करें कि माध्यम पूरे अनुभाग को कवर करता है और ध्यान से शीर्ष पर एक कवर ग्लास रखें।नमूने को अंधेरे में कमरे के तापमान पर रात भर पॉलीमरेज दें। सुबह स्लाइड को उल्टे स्पेक्ट्रल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। साइटोकिन सबसेलुलर स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए उद्देश्य को 10x NA 0.40 या 60x NA 1.4 में समायोजित करें।इस प्रोटोकॉल में, इंटरफेरॉन गामा का उत्पादन करने वाली कोशिकाओं की कल्पना की जाती है और स्थित होती है। मार्कर F4/80 लेबल सभी मैक्रोफेज और लाल लुगदी पर प्रकाश डाला गया । मार्कर B220 लेबल बी कोशिकाओं और टी सेल क्षेत्र के आसपास बी सेल रोम पर प्रकाश डाला गया ।मार्कर CD169 लेबल सीमांत क्षेत्र सफेद लुगदी आसपास मैक्रोफेज । संक्रमण के 24 घंटे बाद, इंटरफेरॉन गामा कई कोशिकाओं द्वारा उत्पादित किया जाता है, जिसमें सक्रिय एंटीजन-विशिष्ट OT1 CD1 सीडी 8 कोशिकाएं और एनके कोशिकाएं शामिल हैं। साइटोकिन स्राव को बाधित करने के लिए बीएफए के उपयोग के बिना, एनके कोशिकाओं द्वारा इंटरफेरॉन गामा का पता लगाना बहुत बिगड़ा हुआ था।बी कोशिकाओं, सीमांत क्षेत्र मैक्रोफेज, और सभी मैक्रोफेज एलएम ओवा संक्रमण के बाद इंटरफेरॉन गामा उत्पादक कोशिकाओं के स्थान को चित्रित करने के लिए दाग थे । दिलचस्प बात यह है कि संकुल एंटीजन विशिष्ट टी-कोशिकाएं तिल्ली के सफेद लुगदी में स्थित पाई गईं, लेकिन वे केवल उन क्षेत्रों में इंटरफेरॉन गामा का उत्पादन करते हैं जहां एनके कोशिकाएं उनके साथ सह-अस्तित्व में थीं। इंटरफेरॉन गामा और एनके बनाम सीडी 8 पॉजिटिव टी-सेल के विभिन्न उपकोशिकीय स्थानीयकरण दिखाया गया।जबकि एनके कोशिकाओं में इंटरफेरॉन गामा स्थानीयकरण साइटोसोल में फैलाया गया था, सीडी 8 सकारात्मक टी-कोशिकाओं ने अक्सर एक और टी-सेल की ओर इंटरफेरॉन गामा की भर्ती की। सीटू में साइटोकिन का पता लगाने के लिए ब्रेफेल्डिन ए का इंजेक्शन महत्वपूर्ण है। कोशिकाएं अक्सर जल्दी से स्रावित होती हैं और साइटोकिन्स लेती हैं और हमें साइटोकिन स्राव को बाधित करने की आवश्यकता होती है ताकि इसे कोशिकाओं में जमा किया जा सके।यह विधि एक खोज उपकरण है जो अपने मूल वातावरण में साइटोकिन उत्पादक कोशिकाओं को वापस रखता है। इस वातावरण की संरचना को समझने से हमें इस स्थान पर मौजूद सही कोशिकाओं या प्रतिरक्षा मध्यस्थों पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है जो इंटरफेरॉन गामा द्वारा प्रभावित या प्रभावित हो सकते हैं। एक बढ़ती समझ है कि एक ऊतक में एक कोशिका का सटीक स्थानीयकरण इसके कार्य के लिए महत्वपूर्ण है।हमारा प्रोटोकॉल हमें साइटोकिन उत्पादक कोशिकाओं के स्थानीयकरण की पहचान करने की अनुमति देता है और इस प्रकार, इसके कार्य को आगे की विशेषता देता है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

से संक्रमित चूहों में बैक्टीरियल लोड और इम्यून प्रतिक्रियाएँ माप लिस्टेरिया monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

सेल भाग्य का पालन<em&gt; ई. कोलाई</em&gt; फेज Lambda द्वारा संक्रमण के बाद

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

की मौखिक संचरण<em&gt; लिस्टेरिया monocytogenes</em&gt; दूषित भोजन की घूस के माध्यम से चूहों में

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

बैक्टीरियल पैथोजन द्वारा सेलुलर संक्रमण की जांच करने के लिए InlC स्राव इमेजिंग<em&gt; लिस्टेरिया monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

निम्नलिखित जिगर के intravital माइक्रोस्कोपी इमेजिंग<em&gt; लीशमैनिया</em&gt; संक्रमण: यकृत hemodynamics के एक आकलन

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

लिस्टेरिया मोनोसाइटोजीन का उपयोग कर संक्रमित चूहों में संस्कृति और हृदय उपनिवेशीकरण में हृदय कोशिकाओं के जीवाणु आक्रमण का आकलन

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Intracellularly से शाही सेना शोधन बढ़ी<em&gt; लिस्टेरिया monocytogenes</em&gt; बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं में

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Responses

साथ प्रायोगिक संक्रमण<em&gt; लिस्टेरिया monocytogenes</em&gt; का अध्ययन होस्ट इंटरफेरॉन-γ जवाब के लिए एक मॉडल के रूप

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

टीकाकरण के बाद गिनी पिग मॉडल में टी सेल प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए अनुकूलित इंटरफेरॉन-गामा ELISpot परख

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

लिस्टिरिया monocytogenes मस्तिष्क का संक्रमण

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...