Name: imaging of in situ interferon gamma production in the mouse spleen following listeria monocytogenes infection
Uploaded: 2019-07-16T14:00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection at JoVE.com

Agradecemos ao Kennedy Institute Imaging Facility pessoal para assistência técnica com imagem. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Kennedy Trust (para A.G.), e do Conselho de pesquisa em biotecnologia e ciências biológicas (BB/R015651/1 a A.G.).

Todos os experimentos envolvendo camundongos estavam de acordo com a lei de procedimentos científicos do Reino Unido de 1986.
1. transferência adoptiva de células T CD8+ específicas antigénicas em ratinhos
<ol><li>Isolar ovalbumina (óvulos)-células t CD8+ específicas (OTI) expressando proteína verde fluorescente (OTI-GFP) ou proteína vermelha fluorescente (OTI-RFP) a partir da suspensão linfonodal de camundongos transgênicos do receptor de células t9,10 usando um mouse Jogo da isolação da pilha de CD8+ T como por instruções da manufatura. Prepare a suspensão celular esmagando os gânglios linfáticos usando um êmbolo da seringa, como descrito anteriormente11.</li>
	<li>Transfira as células OTI-GFP ou OTI-RFP (3 x 106 células) para C57Bl/6 receptores de camundongos Wild Type por injeção intravenosa, conforme descrito por Cahalan, et al.12. Use camundongos que são tipicamente 6 – 12 semana de idade. Nota: Esta etapa é opcional e só é necessária para rastrear células T CD8+ específicas do antígeno.</li>
</ol>2. infecção por Listeria monocytogenes
<ol><li>Expandir L. monocytogenes geneticamente modificados para expressar OVA (LM-OVA)13 para uma fase exponencial de crescimento em infusão de coração de caldo a 37 ° c agitação suave até que o OD600 atinja 0,08 – 0,1, conforme descrito anteriormente em referência a 14.</li>
	<li>Injete 100 μL (volume máximo = 200 μL) de 0,1 – 0,5 LD50 LM-ova diluído em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) por injecção intravenosa utilizando uma seringa de insulina de 29 G, em C57Bl/6 ratos de tipo selvagem que ostentam células Oti-GFP ou Oti-RFP quando indicado. Nota: Em nossas mãos, 0,1 x LD50 LM-ova corresponde a 2 x 104 unidades formadoras de Colônia (CFU). L. monocytogenes geneticamente modificados para expressar ova é usado para ativar as células T de IOT CD8+ previamente transferidas, mas outras cepas de l. monocytogenes podem ser usadas.</li>
</ol>3. tratamento com brefeldin A (BFA) para bloquear a secreção de citocina
<ol><li>Injetar 250 μg de BFA em 200 μL de PBS via intraperitoneal 6 h antes do sacrifício do rato utilizando uma seringa de insulina de 29 G. Nota: O BFA liofilizado é primeiro ressuspensão em dimetil sulfóxido (DMSO) para preparar o estoque de 25 mg/mL de concentração. A BFA é então diluída em PBS à temperatura ambiente (RT) para evitar a cristalização antes da injeção. A inibição da secreção de citocinas induz o acúmulo de IFNγ nas células. Isto é crucial para a deteção do citocinas.</li>
</ol>4. colhendo o baço
<ol><li>Eutanizar os camundongos usando a concentração crescente de CO2 seguido de luxação cervical. Nota: Siga as diretrizes da instituição local para a eutanásia humana de camundongos.</li>
	<li>Limpe o abdômen com 70% de etanol, faça uma incisão com uma tesoura para fazer um corte de 1 a 2 cm através da pele no flanco esquerdo do mouse, onde o baço está localizado. Faça com cuidado uma incisão no peritônio para expor o spleen e para tirá-lo com tweezers. Colher o baço, sendo cuidadoso para não apertá-lo com fórceps ou cortá-lo para evitar perturbar a arquitetura do baço.</li>
</ol>5. fixação do baço com paraformaldeído (PFA)
<ol><li>Prepare a solução fixativa misturando 3,75 mL de PBS e 3,75 mL de 0,2 M L-lisina. Adicionar 21 mg de sódio m-periodate e misture bem. Em seguida, adicione 2,5 mL de PFA de 4% e 20 μL de NaOH de 12 N. Nota: Use a solução fixativa no mesmo dia e descarte o excesso. Não o guarde. Esta etapa de fixação é importante se a amostra contiver proteínas fluorescentes como a GFP. Não use PFA contendo vestígios de metanol, pois desnatura proteínas fluorescentes. Atenção: O PFA é tóxico e deve ser manuseado com precaução.</li>
	<li>Submergir o baço no fixador e fixar por um mínimo de 4 h, tipicamente 16 – 20 h a 4 ° c agitação suave.</li>
	<li>Descarte a solução fixativa e adicione 5 mL de PBS por 5 min em RT agitação suave.</li>
	<li>Substitua o PBS por 5 mL de um PBS fresco incubar por 1 h a 4 ° c agitação suave.</li>
	<li>Substitua o PBS por 5 mL de sacarose a 30%, incubar por 12 – 24 h. Nota: Este método ajuda a manter a morfologia do tecido. Após a incubação com solução de sacarose, o órgão deve afundar na parte inferior do poço.</li>
</ol>6. congelamento e seccionamento
<ol><li>Coloque o gelo seco em um grande receptáculo e coloque um recipiente menor dentro contendo cerca de 50 mL de metanol puro e alguns pedaços de gelo seco.</li>
	<li>Seque suavemente o baço numa limpeza sem fiapos.</li>
	<li>Coloc o spleen dentro de um molde baixo que contem uma gota do composto o melhor da temperatura de corte (OCT) na parte inferior. Tenha cuidado para não produzir bolhas. Adicione OCT sobre o baço.</li>
	<li>Com fórceps, deposite o molde baixo na superfície do metanol, certificando-se de que não toca no OCT. congelando o tecido o mais rapidamente possível para minimizar artefatos.</li>
	<li>Quando estiver congelado, prossiga com o corte. Nota: O baço congelado pode ser mantido a-80 ° c por vários meses.</li>
	<li>
Corte o tecido usando um cryomicrotome.
	<ol>
<li>Ajuste a temperatura da câmara no criostat deve a-21 ° c. Corte seções da espessura desejada (geralmente em torno de 10 μm). Este protocolo funciona com espessuras de até 30 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colete seções em lâminas de microscópio de vidro (veja a tabela de materiais) e inspecione visualmente. Nota: As seções podem ser mantidas em-80 ° c por diversos meses.</li>
</ol>7. coloração imunofluorescente
<ol><li>Permita que a seção venha para RT.</li>
	<li>Desenhe um círculo com um bloqueador de líquido (por exemplo, caneta PAP) ao redor da seção de tecido. Desenhe fora da OCT ou não vai ficar.</li>
	<li>Uma vez que secou, rehidrate a amostra coloc PBS na seção do tecido por 5 minutos. Nota: O volume colocado na seção depende do tamanho da seção. Normalmente utilizamos 100 – 300 μL. Não deixe secar as secções uma vez que são rehidratadas.</li>
	<li>Enxague com PBS pelo menos duas vezes para garantir que a seção está bem aderida ao slide.</li>
	<li>
Adicione a solução de bloqueio à seção para diminuir a ligação não específica de anticorpos.
	<ol>
<li>Prepare a solução de bloqueio como segue: PBS com 0,1% Triton X100, 2% soro de bezerro fetal (FCS), 2,5 μg/mL receptor FC bloqueador (anti-mouse CD16/32). Em seguida, adicione 2 – 5% de soro normal das espécies de cada anticorpo secundário do painel de coloração. Nota: Se os anticorpos forem diretamente conjugados/biotinilados, adicione 5% de soro normal das espécies de cada anticorpo primário. Se um anticorpo primário e um dos anticorpos secundários são da mesma espécie (por exemplo, anticorpo primário levantado em coelho e coelho secundário anti-Rat), não use a espécie sérica normal, uma vez que irá aumentar o sinal de fundo.</li>
		<li>Remova delicadamente o PBS da seção pela aspiração e adicione 100 μL da solução de obstrução por a seção da amostra. Incubar em uma câmara molhada coberta por um mínimo de 1 h em RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mancha com anticorpos primários.
	<ol>
<li>Diluir os anticorpos primários na concentração óptima na solução de bloqueio. A concentração de anticorpos de ponto de partida geral é de 5 μg/mL, mas deve ser otimizada para cada anticorpo e tecido. Nota: Se os anticorpos forem diretamente conjugados, centrifugue a mistura de anticorpos a 17,135 x g (13,500 rpm) durante 15 min a 4 ° c antes de utilizá-la. Fluoróforos podem precipar. Esta etapa aglomerará os precipitados e impedirá desse modo a deposição não específica dos anticorpos precipitados na corrediça.</li>
		<li>Substitua a solução de bloqueio com a mistura de anticorpos primários para cada amostra.</li>
		<li>Incubar por 4 h no RT ou durante a noite (OVN) a 4 ° c em uma câmara molhada coberta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realize a lavagem.
	<ol>
<li>Prepare o tampão de lavagem adicionando 2% de FCS a PBS.</li>
		<li>Lave 4 vezes com tampão de lavagem: um rápido (sem incubação), um por 10 min e dois por 5 min. Em seguida, realize uma lavagem final com PBS por 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coloração com anticorpos secundários.
	<ol>
<li>Diluir os anticorpos secundários de interesse na concentração óptima na solução de bloqueio. Centrifugue a mistura, como descrito para os anticorpos primários.</li>
		<li>Retire a solução de lavagem final. Adicione a mistura de anticorpos secundários no topo da secção e incubar por 1 – 4 h na RT numa câmara húmida coberta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave 4 vezes com tampão de lavagem: um rápido (sem incubação), um por 10 min e dois por 5 min. Em seguida, realize uma lavagem final com PBS por 5 min.</li>
	<li>Retire a solução de lavagem final. Permita que o PBS evate mas não seque demasiado a seção. Coloque uma gota do meio de montagem em cima da amostra e coloque cuidadosamente o vidro de cobertura em cima dela. O meio de montagem deve recuperar toda a seção. Deixe-a polimerase OVN em RT protegida da luz. Nota: Desenhe um círculo em torno da seção no verso do slide antes de aplicar o suporte de montagem. Uma vez que o meio de montagem é aplicado, o tecido pode tornar-se difícil de ver.</li>
	<li>Armazene os slides no escuro a 4 ° c até estar pronto para a imagem.</li>
</ol>8. imagem e análise
<ol><li>Realize a imagem latente da mancha com um microscópio confocal. Nota: Neste protocolo, utilizou-se um microscópio de varredura a laser espectral invertido (ver tabela de materiais), juntamente com os objetivos 10x/na 0,40 ou 60x/na 1,4 (para análise da localização subcelular de citocinas). Comprimentos de onda de excitação e emissão são exibidos para cada fluoróforo e proteína fluorescente na tabela de materiais.</li>
	<li>Realize análises e quantificação conforme exigido usando o software de processamento de imagem (por exemplo, Imaris ou Fiji).</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada a revelar.

Neste manuscrito, apresentamos um método para visualizar a produção de IFNγ no baço após infecção por L. monocytogenes em camundongos. Este protocolo é simples e pode ser adaptado a outros tecidos e gatilhos de citocinas, mas os seguintes aspectos devem ser considerados. As células geralmente secretam rapidamente as citocinas que produzem, e as citocinas são rapidamente colhidas por células vizinhas. É tão difícil detectar citocinas in situ. Um método comum para re-iniciar ràpida a produção do citocinas é reestimular as pilhas ex vivo seguidas pela deteção do citocinas nos meios pelo ensaio enzima-lig da imunoabsorção. Neste contexto, qualquer informação sobre a localização espacial das células produtoras de citocinas é perdida. Além disso, a produção de citocinas após a re-estimulação não reflete necessariamente se as citocinas são realmente produzidas e secretadas in vivo, mas sim indica a capacidade de uma determinada população de células para produzir citocinas. Portanto, ambos os métodos fornecerão informações diferentes e um deve considerar quais informações são mais valiosas para seu experimento.
A fim detectar citocinas intracelular, nosso método usa um inibidor intracelular do transporte da proteína para prender citocinas dentro das pilhas e para aumentar a deteção do sinal. Entretanto, é importante notar que esses inibidores afetam o transporte normal de proteínas do retículo endotelial (re) para o aparelho de Golgi e para a vesícula secretora prejudicando sua liberação, o que poderia causar toxicidade. Como consequência, BFA, ou outro inibidor, deve ser usado por um curto período de tempo, normalmente não mais do que algumas horas. Daqui, é importante encontrar o contrapeso direito entre a dose do inibidor e a época do tratamento a fim aperfeiçoar o nível de citocinas prendidos dentro da pilha sem causar efeitos citotóxica sérios. Essas variáveis podem diferir entre as citocinas e a via de administração para o BFA. Em nosso modelo da infecção, o BFA foi administrado via intraperitoneal a fim fornecer uma dispersão sistemática rápida, mas pode igualmente ser entregado intravenosamente.
Os inibidores de transporte de proteínas intracelulares mais comumente usados são BFA, usados aqui e monensina (MN). Estes inibidores são freqüentemente usados indistintamente para acumular e estudar a produção de citocinas, mas eles têm pequenas diferenças em seus mecanismos de ação. MN inibe o transporte de proteínas dentro do aparelho de Golgi, portanto, acumulando proteínas no Golgi17 enquanto BFA previne o recrutamento complexo-I de proteína coatomer, inibindo o movimento retrógrado de proteínas para o retículo endoplasmático (er) e promovendo assim a acumulação de citocinas no er18. Como tal, escolher o melhor inibidor intracelular do transporte da proteína dependerá de fatores diferentes, tais como o citocinas a ser detectado. Por exemplo, tem sido demonstrado na coloração intracelular induzida por lipopolissacarídeos de monócitos que a BFA é mais eficiente para medir as citocinas IL-1 β, IL-6 e TNF que MN19.
Este protocolo envolve a visualização da citocinas in situ por microscopia confocal e, portanto, há apenas um número limitado de marcadores que podem ser usados para estudar as células produtoras de citocinas e seu microambiente. É igualmente necessário considerar que os inibidores do transporte da proteína tais como BFA ou MN perturbam a expressão normal de diversas proteínas e daqui seu uso ao estudar a expressão simultânea de determinados marcadores de superfície da pilha da ativação tem que ser aproximado Cuidadosamente. Por exemplo, BFA, mas não MN bloqueia a expressão de CD69 em linfócitos murinos20. Apesar desta limitação, a imagem latente confocal permite a localização subcelular das citocinas, assim como a direção do secretion da citocinas dentro da pilha. Os dados gerados usando este protocolo sugerem que as pilhas de NK tendem a secretar IFN-y em um teste padrão difuso quando as pilhas de t CD8+ parecerem dirigir a secreção de IFNγ para outras pilhas de t CD8+ que estão na interação direta com elas5.
Para concluir, este protocolo é adequado para visualizar uma variedade de citocinas in situ e identificar células produtoras e seu microambiente após muitos gatilhos, tais como infecção ou autoimunidade. A informação obtida é instrumental para compreender a importância da orquestração espacial in vivo de diferentes tipos de células e da citocina que produzem, necessárias para uma resposta imune eficiente.

Orquestrar uma resposta imune eficiente contra um patógeno requer integração complexa de sinais exibidos por uma variedade de células imunes que muitas vezes são dispersas entre o organismo. A fim de se comunicar, essas células produzem pequenas proteínas solúveis com múltiplas funções biológicas que atuam como imunomoduladores denominados citocinas. Citocinas controlam o recrutamento de células, ativação e proliferação e, portanto, são conhecidos por serem os principais intervenientes na promoção das respostas imunes1. Respostas imunes efetivas exigem que as citocinas sejam liberadas em um padrão espaciotemporal muito organizado que conecta células específicas para induzir sinais específicos. Portanto, é crucial estudar a produção de citocinas e sua sinalização in situ, levando em conta o microambiente no qual as citocinas são produzidas.
Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) é uma bactéria intracelular Gram-positiva usada como um modelo principal para estudar respostas imunes a patógenos intracelulares em camundongos. Uma citocina, IFN gama (IFNγ) é produzida rapidamente, dentro de 24 h após a infecção por L. monocytogenes . É necessário para a depuração do patógeno, como camundongos nocauteado para IFNγ são altamente suscetíveis à infecção por L. monocytogenes 2. IFNγ é pleiotrópico e produzido por múltiplas células após a infecção3. Quando o IFNγ produzido por pilhas naturais do assassino (NK) for exigido para a atividade anti-bacteriana direta4, o IFNγ de outras fontes foi mostrado para ter outras funções. De fato, nós e outros recentemente descobrimos que o IFNγ produzido por células t CD8 + tem uma função específica em regular a diferenciação de células t5,6,7. Como tal, compreender quais células produzem IFNγ (e em que microambiente) é crucial para dissecar sua função.
A técnica mais comum para o estudo da produção de citocinas baseia-se na coloração intracelular de citocinas analisadas pelo fluxo cytometry. Este método permite a detecção simultânea de múltiplas citocinas combinadas com marcadores de superfície celular dentro de uma única amostra, proporcionando uma ferramenta extremamente útil para estudar a produção de citocina. No entanto, usando a técnica acima mencionada implica a perda de qualquer informação espacial. Além disso, a detecção de citocinas geralmente depende de re-estimulação in vitro para permitir a detecção de citocinas. Como tal, a capacidade de uma determinada célula para produzir uma citocina é analisada, e não necessariamente correlaciona-se com a secreção de citocinas real in situ. Outros métodos usam camundongos de repórter para os quais a expressão de proteínas fluorescentes se correlaciona com a transcrição da citocinas e permite a visualização em um nível de célula única8. Embora este método possa controlar a transcrição do citocinas in situ, há um número limitado de ratos do citocinas-repórter disponíveis. Além disso, a transcrição, tradução e secreção podem, por vezes, ser desligadas, e as proteínas fluorescentes têm uma meia-vida diferente da citocinas que relatam, tornando este método às vezes não é adequado para visualização de citocinas in situ.
Aqui, nós descrevemos um método para visualizar a produção in situ do citocinas pela microscopia confocal na definição da única pilha. Esta técnica permite a visualização da fonte celular e do nicho circundante dentro do tecido. Este protocolo descreve especificamente a visualização da produção de IFNγ no baço de camundongos infectados por L. monocytogenes , concentrando-se aqui na produção de IFNγ por células NK e células T CD8+ específicas do antígeno. No entanto, pode ser estendido e adaptado à caracterização de qualquer produção de citocinas no contexto de outras situações em que são produzidas citocinas, como infecção, inflamação ou doenças auto-imunes, desde que a citocina direcionada possa ser mantida nas células por inibidor de transporte proteico intracelular.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Cambridge bioscience</td>
			<td>CAY11861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar scientific</td>
			<td>R1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma lifescience</td>
			<td>L5751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium meta-periodate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20504</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-saccharose</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27480.294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision wipes paper Kimtech science</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>75512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101302</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides - Superfrost Plus</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>631-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD169 - AF647</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>142407</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml 
			Excitation wavelength: 650 
			 Emission wavelength: 65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-F4/80 - APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123115</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml 
			Excitation wavelength: 650 
			 Emission wavelength: 660</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-B220 - PB</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103230</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/ml 
			Excitation wavelength: 410 
			 Emission wavelength: 455</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IFNg - biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505804</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IFNg - BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505829</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml 
			Excitation wavelength: 405 
			 Emission wavelength: 436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nkp46/NCRI</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2225</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-goat IgG-FITC</td>
			<td>Novusbio</td>
			<td>NPp 1-74814</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: 1 mg/ml 
			Excitation wavelength: 490 
			 Emission wavelength: 525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin - PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405203</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml 
			Excitation wavelength: 565 
			 Emission wavelength: 578</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin - FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405201</td>
			<td>Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml 
			Excitation wavelength: 490 
			 Emission wavelength: 525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses 22x40mm</td>
			<td>Menzel-Glazer</td>
			<td>12352128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid blocker super PAP PEN mini</td>
			<td>Axxora</td>
			<td>CAC-DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris - Microscopy Image Analysis Software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
	
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - Olympus FV1200 Laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat - CM 1900 UV</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base mould disposable</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>11670990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Life Technologies Ltd</td>
			<td>20012068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Broth</td>
			<td>VWR Brand</td>
			<td>303415ZA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td> 
			Excitation wavelength: 484 
			 Emission wavelength: 507</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td> 
			Excitation wavelength: 558 
			 Emission wavelength: 583</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe, with needle, 29G</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDAM324824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 wild type mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of in situ interferon gamma production in the mouse spleen following listeria monocytogenes infection

As citocinas são pequenas proteínas secretadas por células, mediando as comunicações celulares que são cruciais para respostas imunes efetivas. Uma característica das citocinas é o seu pleiotropismo, como eles são produzidos por e podem afetar uma infinidade de tipos de células. Como tal, é importante compreender não só quais células estão produzindo citocinas, mas também em que ambiente o fazem, a fim de definir terapêutica mais específica. Aqui, nós descrevemos um método para visualizar in situ da produção do citocinas que segue a infecção bacteriana. Esta técnica baseia-se em células produtoras de citocinas de imagem em seu ambiente nativo por microscopia confocal. Para fazer isso, as seções de tecido são manchadas para marcadores de vários tipos de células, juntamente com uma mancha de citocinas. Chave para este método, a secreção de citocinas é bloqueada diretamente in vivo antes de colher o tecido de interesse, permitindo a detecção da citocina que se acumulou dentro das células produtoras. As vantagens desse método são múltiplo. Em primeiro lugar, o microambiente no qual as citocinas são produzidas é preservada, o que poderia, em última análise, informar sobre os sinais necessários para a produção de citocinas e as células afetadas por essas citocinas. Além, este método dá uma indicação da posição da produção do citocinas in vivo, porque não confia na reestimulação in vitro artificial das pilhas produzindo. No entanto, não é possível analisar simultaneamente a sinalização a jusante de citocinas em células que recebem a citocina. Da mesma forma, os sinais de citocinas observados correspondem apenas ao tempo-janela durante o qual a secreção de citocinas foi bloqueada. Quando nós descrevemos a visualização da gama do interferon do citocinas (IFN) no spleen que segue a infecção do rato pelas bactérias intracelular Listeria monocytogenes, este método poderia potencial ser adaptado à visualização de toda a citocina em a maioria dos órgãos.

IFNγ produzido dentro dos primeiros 24 h após a infecção do monocytogenes de Listeria é crítico controlar a propagação deste micróbio patogénico. Usando este protocolo, podemos Visualizar não só quais células estão produzindo IFNγ, mas também se eles estão localizados em um microambiente específico. Para nos ajudar a delinear a arquitetura do baço, rotulamos células conhecidas por ter uma localização particular dentro do baço. O marcador F4/80 rotula todos os macrófagos e destaca a polpa vermelha. O marcador B220 rotula as células B e destaca os folículos de células B em torno da zona de célula T. O marcador CD169 rotula macrófagos de zona marginal, envolvendo a polpa branca (Figura 1). A maioria das células OTI, quer expressem IFNγ ou não, estão presentes na polpa branca e, como tal, todas as imagens são as da polpa branca, a menos que indicado.
Um passo crítico neste protocolo é o uso de BFA para inibir a secreção de citocinas. De fato, a detecção de IFNγ por células NK foi muito prejudicada quando os camundongos não foram tratados com BFA (Figura 2). Usando nosso protocolo, pudemos descobrir que pelo menos dois tipos de células produzem IFNγ 24 h após a infecção — células NK e células T CD8+ específicas do antígeno (Figura 3) — similarmente ao que foi encontrado anteriormente pela citometria de fluxo3.
A imagem latente in situ de células produtoras de IFNγ revelou que a produção de IFNγ não é espalhada por todo o baço, mas concentrada em áreas discretas (Figura 4). De fato, verificou-se que as células T foram ativadas em todo o baço (destacadas pelo agrupamento de células T), e isso não necessariamente se correlacionou com a produção de IFNγ. Uma explicação provável é que a produção de IFNγ é restrita à localização das células infectadas15,16e ativação de célula T — representada por clustering — pode ser suportada por ambos infectados (IFNγ positivo) e não infectados (IFNγ negativo) células apresentadoras de antígeno. Outras manchas serão exigidas para apontar a posição exata e obter uma indicação do mecanismo que restringe a produção de IFNγ a esta área e a sua relação à transferência do antígeno. Curiosamente, verificou-se que as células T ativadas, agrupadas e antígeno-específicas estão localizadas em toda a polpa branca do baço, mas produzem IFNγ somente em regiões onde as células NK estão coexistindo com elas (Figura 5). Como tal, a presença de células NK delinea um microambiente específico na polpa branca, em que as células T agrupadas produzem IFNγ em oposição às células T agrupadas na outra parte da polpa branca. Isso sugere que a ativação da célula T não é suficiente para ditar a produção de IFNγ neste momento.
Outro recurso interessante destacado pelo nosso protocolo é a localização subcelular diferente de IFNγ em NK versus células T CD8+ 5. Como mostrado na Figura 6, enquanto a localização de IFNγ em células NK é difusa no citosol, células t CD8+ muitas vezes recrutar IFNγ para outra célula t.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59819/59819fig01.jpg"> Figura 1: marcadores destacando a arquitetura do baço. Camundongos foram infectados com 2 x 104 CFU LM-ova e eutanasiado 24 h pós-infecção. O baço foi explantados e processado como descrito no protocolo. (A) as secções foram coradas para células NK (NCR1 seguidas de anti-cabra IgG-FITC; verde), células Oti-RFP (vermelho) e macrófagos (anti-F4/80-APC; magenta). RP = polpa vermelha; WP = polpa branca. Barra de escala = 200 μm. (b) as secções foram coradas para as células B (anti-B220-Pacific Blue; Azul), células OTI-GFP (sinal GFP mostrado em vermelho) e macrófagos marginais da zona (CD169-Alexa647; magenta). RP = polpa vermelha; BF = folículo de células B; TZ = zona de célula T. Barra de escala = 50 μm. Esta é uma imagem representativa de 3 experimentos independentes (N = 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59819/59819fig01large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59819/59819fig02.jpg"> Figura 2: o tratamento com BFA permite a detecção de IFNγ intracelular in situ. A produção de nΓ é restrita a áreas específicas na evpe camundongos foram infectados com 2 x 104 CFU LM-ova e tratados com BFA (A) ou esquerda não tratada (B) após 18 h. camundongos foram eutanasiados 24 h pós-infecção. O baço foi explantados e processado como descrito no protocolo. As seções foram manchadas para as pilhas de NK (NCR1 seguidas pelo anti-cabra IgG-FITC; verde), as pilhas de OTI-RFP (vermelho) e o IFNγ (anti-IFNγ-BV421; ciano). Barra de escala = 5 μm. Esta é uma imagem representativa de áreas ricas em células NK de 3 experimentos independentes (N = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59819/59819fig02large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59819/59819fig03.jpg"> Figura 3: IFNγ produzindo células no baço. Camundongos foram infectados com 2 x 104 CFU LM-OVA quando indicados e tratados com BFA após 18 h. camundongos foram eutanasiados 24 h pós-infecção. O baço foi explantados e processado como descrito no protocolo. As seções foram manchadas para as pilhas de NK (NCR1 seguidas pelo anti-cabra IgG-FITC; verde), as pilhas de OTI-RFP (vermelho) e o IFNγ (anti-IFNγ-BV421; ciano). (A) imagem representativa de um baço de um rato ingênuo não infectado para demonstrar ausência de coloração não específica de IFNγ. As linhas brancas delineiam a polpa branca. WP = polpa branca; RP = polpa vermelha. (B) imagem representativa da polpa branca do baço de um camundongo infectado por LM-ova, mostrando invasão de células NK à polpa branca e produção de IFNγ por células NK, células Oti e células não rotuladas. As imagens são representativas de 4 experimentos independentes (N = 4). Barras de escala = 70 μm (A); e 20 μm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59819/59819fig03large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59819/59819fig04.jpg"> Figura 4: a produção de IFNγ é restrita a áreas específicas no baço após a infecção por LM-ova. Camundongos foram infectados com 2 x 104 CFU LM-ova e tratados com BFA após 18 h. camundongos foram eutanasiados 24 h pós-infecção. O baço foi explantados e processado como descrito no protocolo. Todas as secções foram coradas para as células B (B220-Pacific Blue AB, Blue) e IFNγ (anti-IFNγ-biotina seguida de streptavidin-PE; ciano). Células OTI-GFP (sinal GFP mostrado em vermelho). As linhas ciano correspondem a áreas de alta produção de IFNγ. São imagens representativas de 4 experimentos independentes (N = 4). (A) as seções foram manchadas para macrófagos marginais da zona (CD169-Alexa 647, magenta). Barra de escala = 50 μm. (B) as secções foram coradas para todos os macrófagos (F4/80). Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59819/59819fig04large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59819/59819fig05.jpg"> Figura 5: a produção de IFNγ por células Oti ativadas ocorre em um microambiente específico. Camundongos foram infectados com 2 x 104 CFU LM-ova e tratados com BFA após 18 h. camundongos foram eutanasiados 24 h pós-infecção. Os baços foram explantados e processados como descrito no protocolo. As seções foram manchadas para as pilhas de NK (NCR1 seguidas pelo anti-cabra IgG-FITC; verde), as pilhas de OTI-RFP (vermelho) e o IFNγ (anti-IFNγ-BV421; ciano). Linhas verdes e vermelhas destacam as zonas de células NK e OTI, respectivamente. A seta branca indica exemplos de clusters de células T que não produzem IFNγ. Exemplos de setas verdes de clusters de células T produzindo IFNγ. Barra de escala = 100 μm. Esta é uma imagem representativa de quatro experimentos independentes (N = 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59819/59819fig05large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59819/59819fig06.jpg"> Figura 6: localização subcelular de IFNγ em células NK e células T. Camundongos foram infectados com 2 x 104 CFU LM-ova e tratados com BFA após 18 h. camundongos foram eutanasiados 24 h pós-infecção. O baço foi explantados e processado como descrito no protocolo. Todas as secções foram coradas para IFNγ (anti-IFNγ-BV421; ciano). As linhas brancas delineiam as bordas das células e as setas brancas mostram a direcionalidade da secreção. Esta é uma imagem representativa de dois experimentos independentes (N = 5). (A)-Oti-as células RFP são mostradas em vermelho. Barra de escala = 5 μm. (B) as secções foram coradas para as células NK (anti-NCR1 seguidas de anti-cabra IgG-FITC; verde. Barra de escala = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59819/59819fig06large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Aqui, nós descrevemos um método confocal simples da imagem latente para visualizar a localização in situ das pilhas que secretoras a gama do interferon do citocinas em órgãos lymphoid secundários murino. Este protocolo pode ser estendido para a visualização de outras citocinas em diversos tecidos.

Imagem latente da produção in situ da gama do interferon no spleen do rato depois da infecção dos monocytogenes de Listeria

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Este protocolo é significativo porque nos permite visualizar o microambiente onde as células produzem uma dada citocina, aqui, interferon gama. Admite-se que a amplitude de ação das citocinas é limitada porque os tecidos são tão complexos. É importante caracterizar as células que cercam as células produtoras de gamma de interferon para identificar quais células irão tomá-la.A principal vantagem da técnica é que ela não interrompe o microambiente presente no tecido de interesse. Além disso, como não repumos artificialmente as células para forçá-las a produzir interferon gama, isso nos dá uma melhor caracterização de se as células estão realmente produzindo interferon gama in situ. Este protocolo poderia ser potencialmente adaptado a outros órgãos e para a visualização de outras citocinas.A maioria das etapas deste protocolo são simples, mas o manuseio do tecido, congelamento e secção, deve ser realizado com cuidado para preservar a integridade do tecido. Para começar, transfira 300 microliters de LM cultivados geneticamente modificados para expressar OVA para uma infusão cardíaca de caldo a 37 graus Celsius em um frasco. Coloque o frasco em um shaker para agitação suave para crescer LM para uma fase exponencial até que o OD600 atinja 0,08 a 0,1.Depois de diluir a cultura LM OVA na PBS para uma concentração de 0,1 vezes a dose letal, 50% usam uma seringa de insulina de 29 bitola para injetar intravenosamente 100 microliters em C57 preto 6 receptores de camundongos do tipo selvagem com células OT1 GFP ou OT1 RFP. Para bloquear a secreção de citocinas 6 horas antes do sacrifício do rato, injete 250 microgramas de BFA e 200 microliters de PBS intraperitoneal com a seringa de insulina de 29 bitolas. Após a eutanização de camundongos usando dióxido de carbono e posterior luxação cervical, limpe o abdômen com 70% de etanol.No flanco esquerdo do rato onde está localizado o baço, corte a pele com uma tesoura para fazer uma incisão de um a dois centímetros. Em seguida, faça cuidadosamente uma incisão no peritônio para expor o baço e tirá-lo com pinças. Tenha cuidado para não espremê-lo com fórceps ou cortá-lo para evitar interromper a arquitetura do baço.Agora, prepare a solução fixativa misturando 3,75 mililitros de PBS e 3,75 mililitros de 0,2 molar L-lysine. Adicione 21 miligramas de m-periodato de sódio e misture bem. Em seguida, adicione 2,5 mililitros de 4%PFA e 20 microliters de 12 hidróxido de sódio normal.Corte o baço em três partes. Submergir o baço na fixação em uma placa de seis poços e fixar por um mínimo de quatro horas. Um período de fixação típico é de 16 a 20 horas a quatro graus Celsius sob agitação suave.Depois disso, descarte a solução fixa e adicione cinco mililitros de PBS por cinco minutos em temperatura ambiente sob suave agitação. Em seguida, substitua o PBS por cinco mililitros de 30% de sacarose e incubar por 12 a 24 horas para manter a morfologia tecidual. Agora, o órgão afunda no fundo da placa.Para congelar a amostra, coloque gelo seco em um recipiente grande e coloque um recipiente menor dentro contendo cerca de 50 mililitros de metanol puro e alguns pedaços de gelo seco. Seque suavemente o baço em um lenço sem fiapos. Goteie uma gota de composto OCT na parte inferior do molde base e coloque o baço dentro do molde.Tenha cuidado para não produzir bolhas. Adicione aproximadamente um mililitro de OCT sobre o baço. Com fórceps, deposite o molde base na superfície do metanol no banho de gelo seco, certificando-se de que o metanol não toque no OCT.O OCT vai engrossar e ficar branco quando congelado. Lembre-se de congelar o tecido o mais rápido possível para minimizar artefatos. Em um crio-microtoma, a temperatura de menos 20 graus Celsius.Selar o tecido à espessura desejada, em torno de 10 micrômetros. Use um pincel para coletar seções em lâminas de microscópio de vidro e inspecione visualmente. Permita que as seções cheguem à temperatura ambiente.Desenhe um círculo com bloqueador líquido, por exemplo, uma caneta PAP, ao redor da seção de tecido fora do OCT. Uma vez que o tecido tenha secado, reidrate a amostra pingando 100 microliters de PBS na seção tecidual por cinco minutos. Em seguida, remova o PBS da seção por aspiração e adicione 100 microliters de solução de bloqueio por seção de amostra.Incubar em uma câmara molhada coberta por pelo menos uma hora em temperatura ambiente. Para coloração com anticorpos primários, substitua a solução de bloqueio pela mistura de anticorpos primários preparada para cada amostra. Incubar por quatro horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius em uma câmara molhada coberta antes de lavar de acordo com o manuscrito.Agora, diluir os anticorpos secundários de interesse para uma concentração ideal, geralmente 2,5 microgramas por mililitro, na solução de bloqueio. Remova a solução final de lavagem da seção e adicione a mistura de anticorpos secundários preparadas em cima da seção e incubar por uma a quatro horas em temperatura ambiente em uma câmara molhada coberta. Após lavar com tampão de lavagem de acordo com o manuscrito, remova a solução de lavagem e realize uma lavagem final com PBS.Aspire a solução salina tamponada com fosfato e permita que o PBS restante evapore sem que a seção seque completamente. Desenhe um círculo ao redor da seção na parte de trás do slide. Em seguida, coloque uma gota do meio de montagem em cima da amostra, certificando-se de que o meio cobre toda a seção e coloque cuidadosamente um copo de cobertura em cima.Deixe a amostra polimerase durante a noite à temperatura ambiente no escuro. Pela manhã, coloque o slide sob um microscópio de varredura espectral invertido. Ajuste o objetivo para 10x NA 0,40 ou 60x NA 1.4 para análise da localização subcelular de citocinas.Neste protocolo, as células que produzem interferon gama são visualizadas e localizadas. O marcador F4/80 rotula todos os macrófagos e destaca a polpa vermelha. O marcador B220 rotula células B e destaca folículos de células B ao redor da zona de células T.O marcador CD169 rotula macrófagos de zona marginal em torno da polpa branca. 24 horas após a infecção, o interferon gama é produzido por múltiplas células, incluindo células OT1 CD8 T e células T específicas de antígeno ativado. Sem o uso de BFA para inibir a secreção de citocinas, a detecção de gamma interferon por células NK foi muito prejudicada.Células B, macrófagos de zonas marginais e todos os macrófagos foram manchados para delinear a localização de células produtoras de gamma de interferon após a infecção por LM OVA. Curiosamente, células T específicas de antígeno agrupados foram encontradas localizadas em toda a polpa branca do baço, mas produzem gamma interferon apenas em regiões onde as células NK estavam coexistindo com elas. Diferentes localizações subcelulares de células T interferon e NK versus CD8 positivos foram mostrados.Enquanto a localização de interferon gama em células NK foi difundida no citosol, as células T positivas CD8 frequentemente recrutavam interferon gama para outra célula T. A injeção de brefeldin A é crucial para detectar a citocina in situ. As células muitas vezes se secretam rapidamente e tomam as citocinas e precisamos inibir a secreção de citocinas para deixá-la se acumular nas células.Este método é uma ferramenta de descoberta que coloca de volta as células produtoras de citocinas em seu ambiente nativo. Decifrar a composição desse ambiente nos permite focar nas células certas ou mediadores imunológicos presentes neste local que podem impactar ou ser impactados por interferon gama. Há uma compreensão crescente de que a localização precisa de uma célula em um tecido é crucial para sua função.Nosso protocolo nos permite identificar a localização das células produtoras de citocinas e, assim, caracterizar ainda mais sua função.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

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Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Imunologia e Infecção

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

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Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

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Transmissão Oral de<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Em camundongos através de ingestão de alimentos contaminados

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Microscopia intravital Imagem do Fígado seguinte<em&gt; Leishmania</em&gt; Infecção: Uma Avaliação de hepáticas Hemodinâmica

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Avaliação da invasão bacteriana de células cardíacas na cultura e colonização cardíaca em camundongos infectados usando listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

A purificação a partir de ARN intracelularmente Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Em macrófagos

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Responses

Infecção experimental com<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como um modelo para estudar o anfitrião Respostas interferão-y

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

Ensaio de ELISpot otimizado de Interferon-gama às respostas de célula T medida no modelo de porquinho da Índia após a vacinação

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...