Name: characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein
Uploaded: 2019-06-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af La Ligue contre Le cancer, l'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen og La Région Centre Val de Loire. Mange tak til Aurélie Cosson og Déborah Casas for flow cytometri data, og til Keyron Hickman-Lewis for grundig korrekturlæsning af manuskriptet.

1. celle forberedelse til transfektering
Forsigtig: alle trin i cellekulturen skal udføres i et dedikeret laboratorium, og cellerne manipuleres i et mikrobiologisk kabinet i klasse 2.
<ol><li>Seed HEK-293 (humane embryonale nyrer) celler i Ø 10 cm plader i 10 mL DMEM (Dulbecco's modificerede Eagles medium) suppleret med 10% føtalt kalv serum. Kultur for 3 til 5 dage under 5% CO2, ved 37 °c, indtil cellerne når ~ 90% Confluence.</li>
	<li>Behandl Ø 10 cm plader med collagen R...

<ol>
	<li>Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+protein+kinase+signaling+from+yeast+to+man.">Evolution of protein kinase signaling from yeast to man.</a> Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).</li><li>Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution,+dynamics+and+dysregulation+of+kinase+signalling.">Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling.</a> Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).</li><li>Bhullar, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase-targeted+cancer+therapies:+progress,+challenges+and+future+directions.">Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions.</a> Molecular Cancer. 17, 48 (2018).</li><li>Kaboord, B., Perr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+proteins+and+protein+complexes+by+immunoprecipitation.">Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.</a> Methods in Molecular Biology. 424, 349-364 (2008).</li><li>Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+strategies+for+the+use+of+affinity+tags+and+tag+removal+for+the+purification+of+recombinant+proteins.">Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins.</a> Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).</li><li>Wood, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+trends+and+affinity+tag+designs+for+recombinant+protein+purification.">New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).</li><li>Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+and+purification:+a+comprehensive+review+of+affinity+tags+and+microbial+applications.">Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications.</a> Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).</li><li>Greenwood, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins.">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li><li>Wang, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Dynamic+and+Heterogeneous+Proteasome+Complexes+Using+In+vivo+Cross-Linking-Assisted+Affinity+Purification+and+Mass+Spectrometry.">Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1844, 401-410 (2018).</li><li>Raykova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+There+Be+Light!.">Let There Be Light!.</a> Proteomes. 4, (2016).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).</li><li>Podobnik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+Study+Protein-protein+Interactions.">How to Study Protein-protein Interactions.</a> Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).</li><li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection:+methods+and+analysis.">Protein-protein interaction detection: methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).</li><li>Peck, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+phosphorylation:+methods+and+strategies+for+studying+kinases+and+substrates.">Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).</li><li>Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+in+vitro+kinase+assay+technologies:+the+quest+for+a+universal+format.">Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format.</a> Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).</li><li>Okano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+family+of+serine/threonine+kinases+containing+two+N-terminal+LIM+motifs.">Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).</li><li>Croft, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-mediated+transcriptional+regulation+and+activation+of+the+actin+cytoskeleton.">p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton.</a> Cell Research. 21, 666-682 (2011).</li><li>Tastet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1+is+a+Hominidae-Specific+Isoform+of+LIMK2+Expressed+in+Central+Nervous+System+and+Associated+with+Intellectual+Disability.">LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability.</a> Neuroscience. 399, 199-210 (2019).</li><li>Vallee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1,+a+new+isoform+of+human+LIMK2,+regulates+actin+cytoskeleton+remodeling+via+a+different+signaling+pathway+than+that+of+its+two+homologs,+LIMK2a+and+LIMK2b.">LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b.</a> The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).</li><li>Lee, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detergents+on+Membrane+Protein+Complex+Isolation.">Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation.</a> Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).</li></ol>

Heri har vi brugt robuste biokemiske værktøjer til at karakterisere på molekylært niveau et nyt protein, LIMK2-1, menes at være en kinase baseret på dens sekvens og på dens homologs, LIMK2a og LIMK2b20.
For det første demonstrerede vi eksistensen af LIMK2-1 på Proteinniveau ved hjælp af Western blot analyse med et bestemt antistof. Efter dette, vi evalueret sin interaktion med upstream kinase ROCK1, som er kendt for at regulere LIMK2a og LIMK2b, homologer af L...

I mange årtier er talrige signalerings veje blevet belyst, og deres involvering i afgørende cellulære processer såsom celledeling, differentiering, motilitet, programmeret celledød, immunitet og Neurobiologi, er blevet vist. Kinaser spiller en væsentlig rolle i disse signalerings veje, da de ofte finregulerer deres aktivering eller inaktivering og er en del af forbigående alsidige komplekser, der reagerer på eksterne stimuli1,2,3. Mutation og dysregulering af kinaser ofte fører til sygdomme hos mennesker, og de er derfor blevet et af de vigtigste Drug mål i løbet af de seneste 40 år4.
I denne sammenhæng er det vigtigt at kunne påvise kinase interaktion med deres upstream regulerende myndigheder eller downstream-substrater og at identificere nye partnere. Affinity rensning og immunopræcipitation er meget kraftfulde teknikker til isolering af protein komplekser5. Agn protein eller kinase kan mærkes med en specifik peptid sekvens tillader brug af kommercielle perler kovalent kombineret med antistoffer rettet mod peptid. Dette materiale muliggør en høj reproducerbarhed i forsøg6,7,8. Endogene proteiner kan også være immunoprecipitated ved hjælp af antistoffer rettet direkte agn protein. Antistofferne kan være kryds forbundne med protein A eller protein G agopstået perler eller blot inkuperet med disse perler før tilsætning af lysatet. Lysis buffere skal optimeres for at tillade protein solubilisering uden at miste interaktion og for at undgå proteinnedbrydning. En væsentlig ulempe ved denne fremgangsmåde er, at interaktionen opdages ved celle lysis; Derfor kan forbigående eller svage interaktioner sammen med dem, der kræver subcellulær kontekst, gå glip af. Andre teknikker kan anvendes til at arbejde direkte i cellen såsom nærheds ligation assay (PLA)9, in vivo Cross-Linking-assisteret Affinity rensning (xap)10, bioluminescens resonans energi Transfer (BRET) eller Förster resonans energi Transfer (fret)11,12. Desuden er immunopcipitation ikke egnet til at bestemme de termodynamiske konstanter for bindingen, for hvilke der kræves fysiske teknikker såsom overflade Plasmon resonans, isotermisk titrering Calorimetri eller Microscale Thermophorese 13,14.
Kinaseaktiviteten kan vurderes ved hjælp af flere teknikker. Heri fokuserede vi på fosho-specifikke antistoffer og in vitro γ [32P] ATP (adenosin TriPhosphate) mærkning. Phospho-specifikke antistoffer er rettet mod fosfat modifikationen af en bestemt rest i et protein. De kan anvendes i Western blot eller ELISA (enzym-linked ImmunoSorbent assay) efter celle lysis, til Immunohistokemi, og også på intakte celler ved hjælp af flow cytometri eller immunofluorescens. Deres ulemper kan omfatte deres manglende specificitet, som kan evalueres ved hjælp af en muteret version af målproteinet, og deres ikke er kommercielt tilgængelige for alle proteiner. In vitro γ [32P] ATP mærkning er en meget robust, veletableret og meget følsom metode15. Immunoprecipiterede eller rekombinante proteiner kan anvendes, og forskellige substrater kan testes. Virkningerne af narkotika kan også vurderes som denne metode er kvantitativ. Dens største ulempe er, at radioaktiviteten i forbindelse med tilgangen kræver håndtering med forsigtighed. Alternative metoder er også mulige baseret på måling af fluorescerende eller luminescerende peptidsubstrater og drage fordel af ændrede fluorescerende/luminescerende egenskaber ved fosforylering. Sådanne metoder giver også mulighed for høj gennemløb, som er nødvendig, for eksempel i screening af molekyler, der kan være potentielle hæmmere af målkinase. Kinaser udgør faktisk en af de største grupper af narkotika-mål, der forfølges af medicinalvirksomhederne16.
I denne undersøgelse fokuserede vi på LIMK2-protein (LIMK2-1 står for Lin11, Isle1, Mec3 kinase isoformen 2-1). LIMK2 kinaseproteinet blev først beskrevet i 199517. Tre isoformer af LIMK2 er produceret af alternative splejsning: LIMK2a, LIMK2b og LIMK2-1. På nuværende tidspunkt er LIMK2-1 kun blevet beskrevet på mRNA-niveau i en enkelt undersøgelse18. Heri, vi karakteriserer dette potentielle nye kinase protein på det molekylære niveau ved hjælp af robuste biokemiske tilgange. For det første viser vi, at LIMK2-1 faktisk er syntetiseret. I lighed med de to modparter, LIMK2a og LIMK2b, interagerer det med upstream kinase ROCK (Rho-associeret protein kinase). Vi viser LIMK2-1 har en kinase aktivitet på myelin Basic protein (MBP), men ikke på cofilin, det kanoniske substrat af LIM kinaser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1978</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-c-Myc</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-21316</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3312/5175</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-GFP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-HA</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11687423001</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-phospho-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3313</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Anti-PP1i</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>designed for this study</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A-162B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PV3227</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>g[32P] ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG502A</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14280</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>111-541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P06-20166</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM4611</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie PageBlue Protein Staining Solution</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>24620</td>
			<td>for gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Protean</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZview Red anti-HA affinity gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6779</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneTolls software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-trap beads</td>
			<td>Chromtek</td>
			<td></td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405</td>
			<td>for transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-cofilin</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>12-556</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>710</td>
			<td>to remove carefully supernatant from beads without aspirating them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant TL software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>for radioactivity acquisition and quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIMK2 siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>s8191</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SP-04-2217</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBP</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>13-173</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1112</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-1504</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Okaidic acid</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>0-2220</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenylphosphate</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1026</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobillon-P</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPVH00010 pore size 0,45 mm</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating wheel</td>
			<td>Labinco</td>
			<td></td>
			<td>for bead incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe lock eppendorf</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120.086</td>
			<td>for kinase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td>for Laemmli and migration buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>S8507</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71501</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal West Dura</td>
			<td>Protein Biology</td>
			<td>34075</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene Pxi</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue extracts 
			 
			&#160;</td>
			<td>Biochain 
			 
			&#160;</td>
			<td>P1234035 Brain 
			P12345152 Lung 
			P1234149 Liver 
			P1234188 Pancreas 
			P1234260 Testis</td>
			<td>for Western Blot analysis 
			 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Trans-Blot</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094 B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA9500</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>3030-672</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein

Omfattende hele genomsekvensering har identificeret mange åbne læse rammer (Orf'er), der giver mange potentielle proteiner. Disse proteiner kan have vigtige roller for cellen og kan opklare nye cellulære processer. Blandt proteiner er kinaser store aktører, da de hører til celle signalering veje og har evnen til at tænde eller slukke mange processer afgørende for skæbnen for cellen, såsom cellevækst, division, differentiering, motilitet, og død.
I denne undersøgelse fokuserede vi på et nyt potentielt kinaseprotein, LIMK2-1. Vi demonstrerede sin eksistens af Western blot ved hjælp af et bestemt antistof. Vi evaluerede samspillet med et opstrømsregulerende protein ved hjælp af coimmunoprecipitation-eksperimenter. Coimmunoprecipitation er en meget kraftfuld teknik i stand til at detektere samspillet mellem to målproteiner. Det kan også bruges til at opdage nye partnere af en agn protein. Agn protein kan renses enten via et tag konstrueret til sin sekvens eller via et antistof specifikt rettet mod det. Disse protein komplekser kan derefter adskilles af SDS-PAGE (Natriumdodecyl sulfat Polyacrylamidgel) og identificeres ved hjælp af massespektrometri. Immunoprecipitated LIMK2-1 blev også brugt til at teste sin kinase aktivitet in vitro af γ [32P] ATP mærkning. Denne veletablerede analyse kan bruge mange forskellige substrater, og muterede versioner af agn kan anvendes til at vurdere den rolle, specifikke rester. Virkningerne af farmakologiske agenser kan også evalueres, da denne teknik både er meget følsom og kvantitativ. Ikke desto mindre kræver håndtering af radioaktivitet særlig forsigtighed. Kinaseaktiviteten kan også vurderes med specifikke antistoffer rettet mod fosfo-gruppen af den modificerede aminosyre. Disse former for antistoffer er ikke kommercielt tilgængelige for alle fosfo modificerede rester.

LIMK2-1 protein er syntetiseret LIMK2-1 er nævnt i databanker, men hidtil har kun ét papir vist eksistensen af mRNA18. Sammenlignet med de to homologs, LIMK2a og LIMK2b, har LIMK2-1 en ekstra C-Terminal domæne identificeret som en protein fosfatase 1 hæmmende domæne (PP1i). Vi designede et antistof, der er målrettet mod et peptid af dette domæne, aminosyrer 671-684 (figur 1a). BLAST Research mod humane pro...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein at JoVE.com

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Vi karakteriserede en ny kinase protein ved hjælp af robuste biokemiske tilgange: Western blot analyse med et dedikeret specifikt antistof på forskellige cellelinjer og væv, interaktioner ved coimmunoprecipitation eksperimenter, kinaseaktivitet detekteret af vestlige Blot ved hjælp af et phospho-specifikt antistof og ved γ [32P] ATP-mærkning.

Karakterisering på molekyleniveau ved hjælp af robuste biokemiske tilgange af et nyt kinase protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Immunoprecipitation er en meget kraftfuld teknik til at isolere og rense et mål protein. Under glatte forhold kan proteiner, regulatorer eller substrater medresektiteres. Derefter kan der blive fundet et nyt interaktionsnetværk.Aktiviteten af det immunafciperede protein kan også vurderes. Navnlig kan en kinases aktivitet afprøves på forskellige underlag ved P32-ATP-mærkning. Ikke desto mindre kan aktivitet af inhibitorer rettet mod en kinase involveret i en sygdom evalueres.De kan udgøre blyforbindelser til at udvikle nye lægemidler. Denne metode kan udvides fra pattedyr til gær eller bakterier. Denne teknik er ikke så svært.Til nøglepunkter:sikre at have et negativt kontrolelement for at være sikker på, at den registrerede interaktion er specifik, og vælg omhyggeligt lysisbetingelser for at holde interaktioner og aktivitet. Små detaljer og fagter er vigtige for at sikre succes for denne teknik, og de er aldrig beskrevet i materialer og metoder til artikler. Demonstrere proceduren vil være Fabienne Godin, en tekniker fra vores laboratorium.Når cellerne er udarbejdet i cellekulturrummet i biosikkerhedsskabet, skal du bruge en 10 milliliterpipette til at fjerne mediet fra pladerne og kassere det i en dedikeret affaldsflaske med blegemiddel. Derefter tilsættes 10 milliliter frisk suppleret DMEM, og læg pladerne tilbage i en inkubator ved 37 grader Celsius. Til fremstilling af transfektionsblandingen tilsættes i et 15 milliliterrør 450 mikroliter af 10 millimolar Tris hydrochloridopløsning ved pH 7,5 suppleret med en millimolar EDTA og 50 mikroliter 2,5 molar calciumchloridopløsning.Bland ved inversion. I røret tilsættes et volumen svarende til 10 mikrogram plasma-DNA, forstærket af et DNA midiprep-kit og fortyndes med elution-bufferen i dette kit, og hvis koncentration er blevet bestemt. Inverter røret til at blande.Derefter, med glat omrøring på en vortex mixer, langsomt tilføje 500 mikroliter af BES buffered saltvand 2X koncentrat, dråbe for dråbe i røret. Flyt det meget omhyggeligt, ikke at forstyrre den komplekse dannelse mellem DNA og calciumphosphat. Inkuberes i mindst 15 minutter eller op til 45 minutter ved stuetemperatur.Overfør nu pladen til transfekt fra inkubatoren til sikkerhedsskabet. Tilsæt de forberedte DNA-komplekser dråbe for dråbe på cellerne over hele pladens overflade. Inkubere i 24 til 72 timer i inkubatoren ved 37 grader Celsius.For at forhindre proteinnedbrydning skal lysisbufferen forberedes på is under hensyntagen til fire milliliter lysisbuffer for hver transficeret plade. Tag pladen med transinterede celler fra inkubatoren. Fjern medierne og kassér det i en dedikeret blegemiddel affald flaske.For at vaske cellerne tilsættes tre milliliter kold PBS på siden af pladen dråbe for dråbe for at undgå at løsne transficerede celler. Og forsigtigt hvirvle pladen til at sprede bufferen over hele overfladen. Vip pladen for at fjerne PBS og kassér den i affaldsflasken.Gentag vasken igen. Læg pladen på is. I slutningen skal du forsigtigt fjerne resten af PBS.Dernæst tilsættes 500 mikroliter af kold lysis buffer til de transficerede vaskede celler. Spred det over hele pladens overflade. Inkuber i 10 minutter på is.Fra tid til anden, igen sprede bufferen over hele overfladen af pladen. Derefter skal du bruge en cellespatel til at skrabe cellerne af overfladen og samle dem i et mikrocentrifugerør. Centrifuge i 10 minutter ved 10, 000 gange G og fire grader Celsius.Opsaml supernatantlyatet i et nyt mikrocentrifugerør, og opsaml en 50 mikroliter aliquot af denne fraktion til et andet nyt mikrocentrifugerør. Denne aliquot vil blive brugt til at kontrollere, om transficerede proteiner er godt udtrykt. Kassér pellet i papirkurven.Først forsigtigt resuspend bestanden opløsning af agarose perler kombineret med det relevante antistof. Skær slutningen af en 200 microliter tip til at gøre en en til to millimeter åbning. Fastgør spidsen til en mikropipette og lav 40 mikroliter af opløsningen, så perlerne kan komme ind i spidsen.Pipette perlerne op og ned flere gange for at mætte spidsen for at sikre den korrekte mængde perler og overføre perlerne til et mikrocentrifugerør. Tilføj 500 mikroliter TNET buffer, mix ved inversion, og centrifuge i to minutter ved 1, 000 gange G og fire grader Celsius. Fjern forsigtigt supernatanten, og tilsæt 500 mikroliter TNET-buffer.Inkuber på et roterende hjul i mindst en time ved fire grader Celsius. Derefter centrifuge røret i to minutter ved 1, 000 gange G og fire grader Celsius og vask perlerne to gange med 500 mikroliter lysis buffer ved invertering og centrifugering. Efter vask overføres den tidligere indsamlede samlede fraktion lysate ind i røret og inkuberes på et roterende hjul ved fire grader Celsius i to til fire timer.Nu centrifuge røret indeholder immunoprecipiterede perler i to minutter ved 1, 000 gange G og fire grader Celsius. Vask perlerne fem gange med 500 mikroliter lysis buffer ved invertering og centrifugering. Når du vasker perlerne, skal du passe på ikke at gå for tæt på perlerne, mens du fjerner supernatant.Ellers vil perler blive aspireret og i slutningen af eksperimentet, vil der ikke være flere perler tilbage. For elution, første centrifuge i to minutter ved 1, 000 gange G og fire grader Celsius. Brug en mikropipette med en milliliter til forsigtigt at fjerne supernatanten.Derefter, med en Hamilton sprøjte udstyret med en cementeret nål, fjerne de sidste dråber af supernatant for at undgå aspiration af perlerne. Dernæst tilsættes 40 mikroliter af 4X Laemmli buffer. Homogeniser ved forsigtigt at banke på røret.Inkuber i fem minutter ved stuetemperatur. Derefter centrifuge i fem minutter ved 10,000 gange G og stuetemperatur. Med en Hamilton sprøjte, overføre supernatant eluate i en ny mikrocentrifuge rør.Opbevares på minus 80 grader Celsius. HEK-293 celler blev transfet med umærket LIMK 2-1 eller en af de HA mærkede isoformer af LIMK 2. LIMK 2-1 er godt udtrykt under de forskellige forhold.Anti LIMK 2-1 antistof genkender ikke LIMK 2a og LIMK 2b isoforms, og det er specifikt, da dets signal falder, når cellerne transinteres med LIMK2 små forstyrrende RNA, sammenlignet med kontrol små forstyrrende RNA. I forskellige menneskelige cellelinjer, LIMK 2-1 syntes at være udtrykt i HEK-293 og HeLa, men ikke i C6. Coimmunoprecipitationsforsøg blev anvendt til at vurdere samspillet mellem LIMK2-1 og upstream kinase ROCK. Hver af de forskellige proteiner kodet af de transfekterede vektorer var godt udtrykt.De tre isoformer af LIMK2, samt larp6, blev effektivt immunafciperet. I eluaterne blev ROCK påvist og dermed coimmunoprecipitated med de tre isoformer af LIMK2, men ikke med larp6. Den registrerede interaktion er derefter specifik.Coimmunoprecipitated LIMK 2-1 blev testet for sin kinase aktivitet via gamma P32 ATP mærkning. LIMK 2-1 ikke fosforlate cofilin, mens det gjorde fosforlate myelin grundlæggende protein, eller MBP. LIMK 2-1 immunrecipiteres effektivt i denne test.Det er afgørende at have negativ kontrol, mens du udfører immunoprecipitation for at være sikker på, at interaktionen er specifik. Sammensætningen af en lysisbuffer skal omhyggeligt konfigureres for at bevare interaktion og aktivitet. Ved immunrecipitation kan kinaseaktivitet vurderes til at tælle forskellige substrater.Mutation kan let indføres og kan optrævle rollen som specifikke rester. Funktionelle undersøgelser kan også udføres for at forstå den fysiologiske rolle nye fremhævede interaktioner. Celler skal dyrkes i et dedikeret kulturrum i et biosikkerhedsskab.P32 ATP skal håndteres med særlig forsigtighed. Shield for at beskytte mod stråling, Geiger counter, specifikt affald indsamle, personlige bryst og finger badges til at opdage radioaktiv eksponering og filter tips.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrsceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analyse af proteinkinaseaktivitet med radiomærket ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET på enkeltmolekyliveau for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrat Transport substrat-bindende-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikation af Cyclin-afhængig Kinase 1 specifikke fosforylering websteder ved en In Vitro -Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Human perifert blod Neutrofile Isolation for at forhøre Parkinsons Associated LRRK2 Kinase Pathway ved at vurdere Rab10 fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifikation af roman CK2 Kinase substrater ved hjælp af en alsidig biokemiske tilgang

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust sammenligning af Protein niveauer på tværs af væv og udvikling ved hjælp af standardiserede kvantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Forbedring af engraftment af humane inducerede pluripotente stamcelle afledte Kardiomyocytter via en forbigående hæmning af Rho Kinaseaktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...