Name: characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein
Uploaded: 2019-06-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door la Ligue contre le cancer, l'Association neurofibromatoses et Recklinghausen, en la Région Centre Val de Loire. Veel dank aan Aurélie Cosson en Déborah Casas voor flow Cytometry Data, en naar Keyron Hickman-Lewis voor grondige proeflezen van het manuscript.

1. Cell voorbereiding voor Transfectie
Let op: alle stappen van de cel cultuur moet worden uitgevoerd in een dedicated laboratorium, en cellen worden gemanipuleerd binnen een klasse 2 microbiologische kabinet.
<ol><li>Zaad HEK-293 (menselijke embryonale nier) cellen in Ø 10 cm platen in 10 mL DMEM (Dulbecco modified Eagles medium) aangevuld met 10% foetale kalf serum. Cultuur voor 3 tot 5 dagen onder 5% CO2, bij 37 °c, tot de cellen bereiken ~ 90% samenloop.</li>
	<li>Behandel ?...

<ol>
	<li>Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+protein+kinase+signaling+from+yeast+to+man.">Evolution of protein kinase signaling from yeast to man.</a> Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).</li><li>Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution,+dynamics+and+dysregulation+of+kinase+signalling.">Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling.</a> Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).</li><li>Bhullar, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase-targeted+cancer+therapies:+progress,+challenges+and+future+directions.">Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions.</a> Molecular Cancer. 17, 48 (2018).</li><li>Kaboord, B., Perr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+proteins+and+protein+complexes+by+immunoprecipitation.">Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.</a> Methods in Molecular Biology. 424, 349-364 (2008).</li><li>Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+strategies+for+the+use+of+affinity+tags+and+tag+removal+for+the+purification+of+recombinant+proteins.">Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins.</a> Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).</li><li>Wood, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+trends+and+affinity+tag+designs+for+recombinant+protein+purification.">New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).</li><li>Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+and+purification:+a+comprehensive+review+of+affinity+tags+and+microbial+applications.">Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications.</a> Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).</li><li>Greenwood, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins.">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li><li>Wang, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Dynamic+and+Heterogeneous+Proteasome+Complexes+Using+In+vivo+Cross-Linking-Assisted+Affinity+Purification+and+Mass+Spectrometry.">Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1844, 401-410 (2018).</li><li>Raykova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+There+Be+Light!.">Let There Be Light!.</a> Proteomes. 4, (2016).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).</li><li>Podobnik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+Study+Protein-protein+Interactions.">How to Study Protein-protein Interactions.</a> Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).</li><li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection:+methods+and+analysis.">Protein-protein interaction detection: methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).</li><li>Peck, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+phosphorylation:+methods+and+strategies+for+studying+kinases+and+substrates.">Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).</li><li>Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+in+vitro+kinase+assay+technologies:+the+quest+for+a+universal+format.">Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format.</a> Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).</li><li>Okano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+family+of+serine/threonine+kinases+containing+two+N-terminal+LIM+motifs.">Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).</li><li>Croft, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-mediated+transcriptional+regulation+and+activation+of+the+actin+cytoskeleton.">p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton.</a> Cell Research. 21, 666-682 (2011).</li><li>Tastet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1+is+a+Hominidae-Specific+Isoform+of+LIMK2+Expressed+in+Central+Nervous+System+and+Associated+with+Intellectual+Disability.">LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability.</a> Neuroscience. 399, 199-210 (2019).</li><li>Vallee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1,+a+new+isoform+of+human+LIMK2,+regulates+actin+cytoskeleton+remodeling+via+a+different+signaling+pathway+than+that+of+its+two+homologs,+LIMK2a+and+LIMK2b.">LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b.</a> The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).</li><li>Lee, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detergents+on+Membrane+Protein+Complex+Isolation.">Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation.</a> Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).</li></ol>

Hierin hebben we gebruik gemaakt van krachtige biochemische instrumenten te karakteriseren op moleculair niveau een nieuw eiwit, LIMK2-1, vermoedelijk een kinase gebaseerd op de volgorde en op de homologsen, LIMK2a en LIMK2b20.
Ten eerste, toonden wij het bestaan van LIMK2-1 op het eiwit niveau gebruikend westelijke vlek analyse met een specifiek antilichaam. Na dit, evalueerden wij zijn interactie met het stroomopwaarts kinase ROCK1, dat gekend is om LIMK2a en LIMK2b, ...

Voor vele decennia, zijn talrijke signalering trajecten opgehelderd en hun betrokkenheid bij cruciale cellulaire processen zoals celdeling, differentiatie, beweeglijkheid, geprogrammeerde celdood, immuniteit en Neurobiology, is aangetoond. Kinases spelen een belangrijke rol in deze signalering trajecten als ze vaak fijn reguleren hun activering of inactivatie en zijn onderdeel van voorbijgaande veelzijdige complexen die reageren op externe stimuli1,2,3. Mutatie en ontregeling van kinases vaak leiden tot ziekten bij de mens, en ze hebben daarom uitgegroeid tot een van de belangrijkste drug targets in de afgelopen 40 jaar4.
In deze context is het belangrijk om de kinase interactie met hun stroomopwaartse regulatoren of stroomafwaartse substraten te kunnen detecteren en nieuwe partners te identificeren. De reiniging van de affiniteit en Immunoprecipitation zijn zeer krachtige technieken voor de isolatie van eiwitcomplexen5. Het aas proteïne of kinase kan met een specifieke peptide opeenvolging worden geëtiketteerdd toestaand het gebruik van commerciële parels in combinatie met antilichamen die het peptide richten. Dit materiaal laat een hoge reproduceerbaarheid toe in experimenten6,7,8. Endogene proteïnen kunnen ook worden immunoprecipitated gebruikend antilichamen die direct het aas proteïne richten. De antilichamen kunnen cross-linked aan proteïne A of proteïne G agarose parels of eenvoudig met deze parels voorafgaand aan het toevoegen van lysate worden uitgebroed. Lysis buffers moeten worden geoptimaliseerd om proteïne oplosbaar maken te laten zonder interactie te verliezen en eiwit degradatie te vermijden. Een belangrijk nadeel van deze aanpak is dat de interactie wordt gedetecteerd op Cell Lysis; Daarom kunnen voorbijgaande of zwakke interacties, samen met die die subcellulaire context vereisen worden gemist. Andere technieken kunnen worden gebruikt om direct te werken in de cel, zoals proximity afbinding assay (PLA)9, in vivo cross-linking-Assisted affiniteit zuivering (XAP)10, bioluminescentie resonantie energieoverdracht (BRET) of Förster resonantie energie Overdracht (fret)11,12. Bovendien is Immunoprecipitation niet geschikt om de thermodynamische constanten van de binding te bepalen, waarvoor fysische technieken zoals oppervlakte Plasmon resonantie, isotherme titratie calorimetrie of Microscale Thermophoresis zijn vereist 13,14.
Kinase activiteit kan worden beoordeeld met behulp van meerdere technieken. Hierin hebben we ons geconcentreerd op phospho antilichamen en in vitro γ [32P] ATP (adenosine trifosfaat) etikettering. Phospho-specifieke antilichamen richten de fosfaat wijziging van een bepaald residu binnen een proteïne. Zij kunnen in westelijke vlek of ELISA (enzym-verbonden ImmunoSorbent assay) na cel lysis, voor Immunohistochemistry, en ook op intacte cellen worden gebruikt gebruikend Stroom Cytometry of immunofluorescentie. Hun nadelen kunnen hun gebrek aan specificiteit omvatten, die kan worden geëvalueerd gebruikend een gemuteerde versie van de doel proteïne, en hun die niet commercieel beschikbaar voor alle proteïnen zijn. In vitro γ [32P] ATP labeling is een zeer robuuste, goed gevestigde en zeer gevoelige methode15. Immunoprecipitated of recombinante eiwitten kunnen worden gebruikt, en verschillende substraten kunnen worden getest. De effecten van drugs kunnen ook worden beoordeeld als deze methode is kwantitatief. Het belangrijkste nadeel is dat de radioactiviteit in verband met de aanpak vereist behandeling met voorzichtigheid. Alternatieve methoden zijn ook mogelijk op basis van de meting van fluorescerende of lichtgevende peptide substraten en gebruik te maken van gewijzigde TL/lichtgevende eigenschappen op phosphorylation. Dergelijke methoden kunnen ook een hoge doorvoersnelheid, die nodig is, bijvoorbeeld in de screening van moleculen die kunnen worden potentiële remmers van de doelgroep kinase. Inderdaad, kinases vertegenwoordigen een van de grootste klassen van drugs doelstellingen nagestreefd door farmaceutische bedrijven16.
In deze studie concentreerden we ons op de LIMK2-1 proteïne (LIMK2-1 staat voor Lin11, Isle1, Mec3 kinase isovorm 2-1). De LIMK2 kinase proteïne werd voor het eerst beschreven in 199517. Drie isovormen van LIMK2 worden geproduceerd door alternatieve splicing: LIMK2a, LIMK2b en LIMK2-1. Momenteel, is LIMK2-1 slechts beschreven op het niveau mRNA in één enkele studie18. Hierin karakteriseren we deze potentiële nieuwe kinase proteïne op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen. Ten eerste tonen we aan dat LIMK2-1 inderdaad gesynthetiseerd is. Gelijkaardig aan zijn twee tegenhangers, LIMK2a en LIMK2b, communiceert het met de stroomopwaarts kinase rots (Rho-bijbehorend proteïne kinase). We tonen LIMK2-1 heeft een kinase activiteit op myeline Basic protein (MBP), maar niet op cofilin, de canonieke substraat van LIM kinases.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1978</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-c-Myc</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-21316</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3312/5175</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-GFP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-HA</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11687423001</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-phospho-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3313</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Anti-PP1i</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>designed for this study</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A-162B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PV3227</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>g[32P] ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG502A</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14280</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>111-541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P06-20166</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM4611</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie PageBlue Protein Staining Solution</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>24620</td>
			<td>for gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Protean</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZview Red anti-HA affinity gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6779</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneTolls software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-trap beads</td>
			<td>Chromtek</td>
			<td></td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405</td>
			<td>for transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-cofilin</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>12-556</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>710</td>
			<td>to remove carefully supernatant from beads without aspirating them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant TL software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>for radioactivity acquisition and quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIMK2 siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>s8191</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SP-04-2217</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBP</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>13-173</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1112</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-1504</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Okaidic acid</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>0-2220</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenylphosphate</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1026</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobillon-P</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPVH00010 pore size 0,45 mm</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating wheel</td>
			<td>Labinco</td>
			<td></td>
			<td>for bead incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe lock eppendorf</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120.086</td>
			<td>for kinase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td>for Laemmli and migration buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>S8507</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71501</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal West Dura</td>
			<td>Protein Biology</td>
			<td>34075</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene Pxi</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue extracts 
			 
			&#160;</td>
			<td>Biochain 
			 
			&#160;</td>
			<td>P1234035 Brain 
			P12345152 Lung 
			P1234149 Liver 
			P1234188 Pancreas 
			P1234260 Testis</td>
			<td>for Western Blot analysis 
			 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Trans-Blot</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094 B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA9500</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>3030-672</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein

Het uitgebreide gehele genoom rangschikken heeft vele open lezings kaders (ORFs) geïdentificeerd die vele potentiële proteïnen verstrekken. Deze eiwitten kunnen belangrijke rollen voor de cel en kunnen ontrafelen nieuwe cellulaire processen. Onder eiwitten, kinases zijn belangrijke acteurs als ze behoren tot cel signalering paden en hebben de mogelijkheid om in-of uitschakelen vele processen van cruciaal belang voor het lot van de cel, zoals celgroei, divisie, differentiatie, beweeglijkheid, en de dood.
In deze studie, concentreerden wij ons op een nieuwe potentiële kinase proteïne, LIMK2-1. Wij toonden zijn bestaan door westelijke vlek gebruikend een specifiek antilichaam aan. We evalueerden de interactie met een upstream regulerend eiwit met behulp van coimmunoprecipitation experimenten. Coimmunoprecipitation is een zeer krachtige techniek in staat om de interactie tussen twee doel eiwitten te detecteren. Het kan ook worden gebruikt om nieuwe partners van een aas proteïne te ontdekken. Het aas proteïne kan of via een markering worden gezuiverd die aan zijn opeenvolging of via een antilichaam wordt ontworpen dat specifiek het richt. Deze eiwitcomplexen kunnen vervolgens worden gescheiden door SDS-pagina (natrium dodecyl sulfaat Polyacrylamide gel) en geïdentificeerd met behulp van massaspectrometrie. Immunoprecipitated LIMK2-1 werd ook gebruikt om zijn kinase activiteit in vitro te testen door γ [32P] ATP etikettering. Deze gerenommeerde assay kan gebruik maken van veel verschillende substraten, en gemuteerde versies van het aas kan worden gebruikt om de rol van specifieke residuen te beoordelen. De effecten van farmacologische agentia kunnen ook worden geëvalueerd, aangezien deze techniek zowel zeer gevoelig als kwantitatief is. Toch vereist de behandeling van radioactiviteit bijzondere voorzichtigheid. Kinase activiteit kan ook worden beoordeeld met specifieke antilichamen gericht op de phospho groep van het gemodificeerde aminozuur. Dit soort antilichamen zijn niet commercieel beschikbaar voor alle phospho gemodificeerde residuen.

LIMK2-1 proteïne wordt samengesteld LIMK2-1 wordt vermeld in databanken, maar tot dusver heeft slechts één document het bestaan van zijn mRNA18getoond. Vergeleken met de twee homologs, LIMK2a en LIMK2b, LIMK2-1 heeft een extra C-Terminal domein geïdentificeerd als een eiwit fosfatase 1 remmende domein (PP1i). We hebben een antilichaam ontworpen dat een peptide van dit domein target, aminozuren 671-684 (Figuur 1a...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein at JoVE.com

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

We kenmerkten een nieuwe kinase eiwit met behulp van robuuste biochemische benaderingen: Western Blot analyse met een dedicated specifieke antilichaam op verschillende cel lijnen en weefsels, interacties door coimmunoprecipitation experimenten, kinase activiteit gedetecteerd door westerse Vlek gebruikend een phospho-specifiek antilichaam en door γ [32P] ATP etikettering.

Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Immunoprecipitatie is een zeer krachtige techniek om een doeleiwit te isoleren en te zuiveren. In gladde omstandigheden kunnen eiwitten, regelaars of substraten co-immunoprecipitated zijn. Een nieuw interactienetwerk kan dan worden ontdekt.De activiteit van het immuunprecipiteerde eiwit kan ook worden beoordeeld. In het bijzonder kan de activiteit van een kinase op verschillende substraten worden getest door P32-ATP-etikettering. Niettemin kan de activiteit van remmers die zich richten op een kinase die betrokken is bij een ziekte worden geëvalueerd.Zij kunnen loodverbindingen vormen om nieuwe geneesmiddelen te ontwikkelen. Deze methode kan worden uitgebreid van zoogdieren tot gist of bacteriën. Deze techniek is niet zo moeilijk.Op belangrijke punten: zorg ervoor dat u een negatieve controle om er zeker van de gedetecteerde interactie is specifiek, en zorgvuldig kiezen lysis voorwaarden om interacties en activiteit te houden. Kleine details en gebaren zijn belangrijk om het succes van deze techniek te garanderen, en ze worden nooit beschreven in materialen en methoden van artikelen. Het aantonen van de procedure zal Fabienne Godin, een technicus uit ons laboratorium.Nadat cellen zijn bereid in de cel kweekruimte binnen de biosafety kabinet, gebruik maken van een 10 milliliter pipet om de media te verwijderen uit de platen en gooi het in een speciale afvalfles met bleekmiddel. Voeg vervolgens 10 milliliter verse aanvullende DMEM toe en zet de platen terug in een couveuse bij 37 graden Celsius. Om het transfectiemengsel voor te bereiden, in een buis van 15 milliliter, voeg 450 microliter van 10 millimolar Tris hydrochlorideoplossing toe bij pH 7.5, aangevuld met één millimolar EDTA en 50 microliter van 2,5 molaire calciumchlorideoplossing.Mix door inversie. Voeg in de buis een volume toe dat overeenkomt met 10 microgram plasma-DNA, versterkt door een DNA-midiprep-kit en verdund met de elutiebuffer van deze kit en waarvan de concentratie is bepaald. Keer de buis om te mengen.Voeg vervolgens, met een soepele agitatie op een vortexmixer, langzaam 500 microliters BES gebufferd zoutoplossing 2X-concentraat toe, druppel voor druppel in de buis. Verplaats het zeer zorgvuldig, niet om de complexe vorming tussen DNA en calciumfosfaat te verstoren. Incubeer gedurende ten minste 15 minuten, of tot 45 minuten, bij kamertemperatuur.Breng de plaat over om van de couveuse naar de veiligheidskast te gaan. Voeg de voorbereide DNA-complexen druppel voor druppel op de cellen over het hele oppervlak van de plaat. Incubeer gedurende 24 tot 72 uur in de couveuse bij 37 graden Celsius.Om eiwitafbraak te voorkomen, bereidt u lysebuffer op ijs, rekening houdend met vier milliliter lysebuffer voor elke transfected plaat. Neem de plaat met doorgefecteerde cellen uit de couveuse. Verwijder de media en gooi het weg in een speciale bleekmiddel afvalfles.Om de cellen te wassen, voeg drie milliliter koude PBS aan de zijkant van de plaat druppel voor druppel, om te voorkomen dat losmaken van transfected cellen. En draai voorzichtig de plaat om de buffer over het oppervlak te verspreiden. Kantel de plaat om de PBS te verwijderen en gooi deze in de afvalfles.Herhaal de was nogmaals. Leg de plaat op ijs. Verwijder aan het einde voorzichtig de rest van de PBS.Voeg vervolgens 500 microliters koude lyse buffer toe aan de transfected gewassen cellen. Verdeel het over het oppervlak van de plaat. 10 minuten incuberen op ijs.Van tijd tot tijd, opnieuw verspreid de buffer over het oppervlak van de plaat. Daarna gebruikt u een celspatel om de cellen van het oppervlak te schrapen en ze te verzamelen in een microcentrifugebuis. Centrifuge gedurende 10 minuten op 10,000 keer G en vier graden Celsius.Verzamel het supernatant lysaat in een nieuwe microcentrifugebuis en verzamel een 50 microliter aliquot van deze fractie tot een andere nieuwe microcentrifuge buis. Deze aliquot zal worden gebruikt om te controleren of transfected eiwitten goed worden uitgedrukt. Gooi de pellet in de prullenbak.Ten eerste, voorzichtig resuspend de voorraad oplossing van agarose kralen in combinatie met de juiste antilichaam. Snijd het einde van een 200 microliter tip om een een tot twee millimeter opening te maken. Bevestig de punt aan een micropipet en maak 40 microliter van de oplossing, zodat kralen in de punt kunnen komen.Pipette de kralen op en neer meerdere malen om de tip te verzadigen om het juiste volume van kralen te garanderen en de overdracht van de kralen naar een microcentrifuge buis. Voeg 500 microliters TNET-buffer toe, meng door inversie en centrifuge gedurende twee minuten bij 1,000 keer G en vier graden Celsius. Verwijder voorzichtig de supernatant en voeg 500 microliter TNET-buffer toe.Broeden op een roterend wiel gedurende ten minste een uur op vier graden Celsius. Vercentrifugeert vervolgens de buis gedurende twee minuten bij 1.000 keer G en vier graden Celsius en was de kralen twee keer met 500 microliters lysisbuffer door omkeren en centrifugeren. Breng na het wassen het eerder verzamelde totaalfractie in de buis en broed twee tot vier uur op een draaiend wiel bij vier graden Celsius.Centrifuge de buis met de immuunprecipiteerde kralen gedurende twee minuten bij 1.000 keer G en vier graden Celsius. Was de kralen vijf keer met 500 microliters lysebuffer door het omkeren en centrifugeren. Let er bij het wassen van de kralen op dat je niet te dicht bij de kralen komt terwijl je supernatant verwijdert.Anders worden kralen aangezogen en aan het einde van het experiment blijven er geen kralen meer over. Voor elutie, eerste centrifuge gedurende twee minuten op 1,000 keer G en vier graden Celsius. Gebruik een micropipet van één milliliter om de supernatant voorzichtig te verwijderen.Dan, met een Hamilton spuit uitgerust met een gecementeerde naald, verwijder de laatste druppels van de supernatant om aspiratie van de kralen te voorkomen. Voeg vervolgens 40 microliter van 4X Laemmli buffer toe. Homogeniseren door zachtjes op de buis te tikken.Vijf minuten incubeer maken bij kamertemperatuur. Dan, centrifuge gedurende vijf minuten op 10,000 keer G en kamertemperatuur. Met een Hamilton spuit, breng de supernatant eluate in een nieuwe microcentrifuge buis.Bewaar op min 80 graden Celsius. HEK-293 cellen werden doorfected met niet-gelabelde LIMK 2-1 of een van de HA gelabelde isovormen van LIMK 2. LIMK 2-1 wordt goed uitgedrukt in de verschillende omstandigheden.Anti LIMK 2-1 antilichaam herkent LIMK 2a en LIMK 2b-isovormen niet, en het is specifiek, omdat het signaal afneemt wanneer cellen worden getransfecteerd met LIMK2 klein storend RNA, in vergelijking met kleine storende RNA. In verschillende menselijke cellijnen bleek LIMK 2-1 te worden uitgedrukt in HEK-293 en HeLa, maar niet in C6. Co-immuunsyxatie-experimenten werden gebruikt om de interactie van LIMK2-1 met upstream kinase ROCK te beoordelen. Elk van de verschillende eiwitten gecodeerd door de transfected vectoren werden goed uitgedrukt.De drie isovormen van LIMK2, evenals larp6, werden efficiënt geïprecipiteerd. In de eluates werd ROCK ontdekt en dus gecoördineerd met de drie isovormen van LIMK2, maar niet met larp6. De gedetecteerde interactie is dan specifiek.Coimmunoprecipitated LIMK 2-1 werd getest op zijn kinase activiteit via gamma P32 ATP etikettering. LIMK 2-1 heeft geen cofilin gefossileerd, terwijl het fosforylelaatyeïne, of MBP deed. LIMK 2-1 wordt in deze test efficiënt geïprecipiteerd.Het is van cruciaal belang om negatieve controle te hebben tijdens het uitvoeren van immunoprecipitatie om er zeker van te zijn dat de interactie specifiek is. De samenstelling van een lysebuffer moet zorgvuldig worden ingesteld om interactie en activiteit te behouden. Bij immunoprecipitatie kan kinaseactiviteit worden beoordeeld om verschillende substraten te tellen.Mutatie kan gemakkelijk worden geïntroduceerd en kan de rol van specifieke residuen ontrafelen. Functionele studies kunnen ook worden uitgevoerd om de fysiologische rol van nieuwe gemarkeerde interacties te begrijpen. Cellen moeten worden gekweekt in een speciale cultuurruimte in een bioveiligheidskast.P32 ATP moet met specifieke voorzichtigheid worden behandeld. Schild om te beschermen tegen straling, Geiger teller, specifieke afval verzamelen, persoonlijke borst en vinger badges om radioactieve blootstelling en filter tips te detecteren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analyse van proteïnekinaseactiviteit met radiolabelde ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Menselijke perifere bloed neutrofiele isolatie voor het ondervragen van de Parkinson Geassocieerde LRRK2 Kinase Pathway door de beoordeling van Rab10 fosforylatie

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identificatie van nieuwe CK2 Kinase substraten met behulp van een veelzijdige benadering van de biochemische

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Verbetering van de Engraftment van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten via een voorbijgaande remming van de activiteit van Rho kinase

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...