Name: characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein
Uploaded: 2019-06-30T14:00:00
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Diese Arbeit wurde unterstützt von La Ligue contre le Cancer, l'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen und la Région Centre Val de Loire. Vielen Dank an Aurélie Cosson und Déborah Casas für Flow-Zytometrie-Daten und an Keyron Hickman-Lewis für das gründliche Korrekturlesen des Manuskripts.

1. Zellvorbereitung zur Transfektion
VORSICHT: Alle Schritte der Zellkultur müssen in einem speziellen Labor durchgeführt werden, und Zellen werden in einem mikrobiologischen Schrank der Klasse 2 manipuliert.
<ol><li>Samen HEK-293 (Human Embryonic Kidney) Zellen in 10 cm Platten in 10 ml DMEM (Dulbecco es Modified Eagles Medium) ergänzt durch 10% fetales Kalbsserum. Kultur für 3 bis 5Tage unter 5% CO2 , bei 37 °C, bis die Zellen 90% Zusammenfluss erreichen.</li>
	<li>Behandel...

<ol>
	<li>Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+protein+kinase+signaling+from+yeast+to+man.">Evolution of protein kinase signaling from yeast to man.</a> Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).</li><li>Manning, G., Whyte, D. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+in+vitro+kinase+assay+technologies:+the+quest+for+a+universal+format.">Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format.</a> Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).</li><li>Okano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+family+of+serine/threonine+kinases+containing+two+N-terminal+LIM+motifs.">Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).</li><li>Croft, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-mediated+transcriptional+regulation+and+activation+of+the+actin+cytoskeleton.">p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton.</a> Cell Research. 21, 666-682 (2011).</li><li>Tastet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1+is+a+Hominidae-Specific+Isoform+of+LIMK2+Expressed+in+Central+Nervous+System+and+Associated+with+Intellectual+Disability.">LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability.</a> Neuroscience. 399, 199-210 (2019).</li><li>Vallee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1,+a+new+isoform+of+human+LIMK2,+regulates+actin+cytoskeleton+remodeling+via+a+different+signaling+pathway+than+that+of+its+two+homologs,+LIMK2a+and+LIMK2b.">LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b.</a> The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).</li><li>Lee, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detergents+on+Membrane+Protein+Complex+Isolation.">Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation.</a> Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).</li></ol>

Hierbei haben wir robuste biochemische Werkzeuge eingesetzt, um auf molekularer Ebene ein neues Protein, LIMK2-1, zu charakterisieren, von dem angenommen wird, dass es sich um eine Kinase handelt, die auf ihrer Sequenz und ihren Homologen LIMK2a und LIMK2b20basiert.
Erstens haben wir die Existenz von LIMK2-1 auf Proteinebene anhand der Western Blot-Analyse mit einem spezifischen Antikörper nachgewiesen. Anschließend evaluierten wir seine Wechselwirkung mit der vorgela...

Seit vielen Jahrzehnten werden zahlreiche Signalwege aufgeklärt und ihre Beteiligung an entscheidenden zellulären Prozessen wie Zellteilung, Differenzierung, Beweglichkeit, programmiertem Zelltod, Immunität und Neurobiologie gezeigt. Kinasen spielen eine wichtige Rolle in diesen Signalwegen, da sie oft ihre Aktivierung oder Inaktivierung fein regulieren und Teil vorübergehender vielseitiger Komplexe sind, die auf äußere Reize reagieren1,2,3. Mutation und Dysregulation von Kiinasen führen oft zu Krankheiten beim Menschen, und sie sind daher zu einem der wichtigsten Drogenziele in den letzten vierzig Jahrengeworden 4.
In diesem Zusammenhang ist es wichtig, die Kinase-Wechselwirkung mit ihren vorgelagerten Regulatoren oder nachgelagerten Substraten erkennen zu können und neue Partner zu identifizieren. Affinitätsreinigung und Immunpräzipitation sind sehr leistungsfähige Techniken zur Isolierung von Proteinkomplexen5. Das Köderprotein oder die Ködernase kann mit einer bestimmten Peptidsequenz markiert werden, die die Verwendung von kommerziellen Perlen kovalent gekoppelt mit Antikörpern ermöglicht, die auf das Peptid abzielen. Dieses Material ermöglicht eine hohe Reproduzierbarkeit in den Experimenten6,7,8. Endogene Proteine können auch mit Antikörpern immunpräzipiert werden, die direkt auf das Köderprotein abzielen. Die Antikörper können mit Protein A oder Protein G Agarose Perlen vernetzt oder einfach mit diesen Perlen vor der Zugabe von Lysat inkubiert werden. Lysepuffer müssen optimiert werden, um eine Proteinlösung ohne Wechselwirkung zu ermöglichen und den Proteinabbau zu vermeiden. Ein großer Nachteil dieses Ansatzes ist, dass die Wechselwirkung bei der Zelllyse erkannt wird; daher können vorübergehende oder schwache Wechselwirkungen zusammen mit solchen, die einen subzellulären Kontext erfordern, übersehen werden. Andere Techniken können verwendet werden, um direkt in der Zelle zu arbeiten, wie Proximity Ligation Assay (PLA)9, in vivo cross-linking-assisted affinity purification (XAP)10, Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) oder Förster Resonance Energy Transfer (FRET)11,12. Darüber hinaus ist die Immunpräzipitation nicht geeignet, die thermodynamischen Konstanten der Bindung zu bestimmen, für die physikalische Techniken wie Surface Plasmon Resonance, Isothermale Titrationskalorimetrie oder Mikroskalige Thermophorese erforderlich sind. 13,14.
Die Kinase-Aktivität kann mit mehreren Techniken bewertet werden. Dabei konzentrierten wir uns auf phosphospezifische Antikörperund in vitro-ATP-Etikettierung (Adenosin-TriPhosphat). Phosphospezifische Antikörper zielen auf die Phosphatmodifikation eines bestimmten Rückstands innerhalb eines Proteins ab. Sie können in Western Blot oder ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) nach der Zelllyse, für die Immunhistochemie und auch auf intakten Zellen mit Durchflusszytometrie oder Immunfluoreszenz verwendet werden. Ihre Nachteile können ihr Mangel an Spezifität sein, die mit einer mutierten Version des Zielproteins bewertet werden kann, und sie sind nicht kommerziell für alle Proteine verfügbar. Die In-vitro-ATP-Kennzeichnung ist eine sehr robuste, etablierte und hochempfindliche Methode15. Immunpräzipierte oder rekombinante Proteine können verwendet werden, und verschiedene Substrate können getestet werden. Die Wirkung von Arzneimitteln kann auch bewertet werden, da diese Methode quantitativ ist. Sein Hauptnachteil ist, dass die Radioaktivität, die mit dem Ansatz verbunden ist, einen vorsichtigen Umgang erfordert. Alternative Methoden sind auch möglich, basierend auf der Messung von fluoreszierenden oder lumineszierenden Peptidsubstraten und unter Ausnutzung veränderter fluoreszierender/lumineszierender Eigenschaften bei phosphorylierter Phosphorylierung. Solche Methoden ermöglichen auch einen hohen Durchsatz, der z. B. beim Screening von Molekülen erforderlich ist, die potenzielle Inhibitoren der Zielkinase sein können. Tatsächlich stellen Kinasen eine der größten Klassen von Arzneimittelzielen dar, die von Pharmaunternehmen verfolgt werden16.
In dieser Studie konzentrierten wir uns auf das LIMK2-1 Protein (LIMK2-1 steht für Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). Das LIMK2-Kinase-Protein wurde erstmals1995 17 beschrieben. Durch alternatives Spleißen werden drei Isoformen von LIMK2 hergestellt: LIMK2a, LIMK2b und LIMK2-1. Derzeit wurde LIMK2-1 nur auf mRNA-Ebene in einer einzigen Studie18beschrieben. Hierbei charakterisieren wir dieses potentielle neue Kinase-Protein auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen. Erstens zeigen wir, dass LIMK2-1 tatsächlich synthetisiert ist. Ähnlich wie seine beiden Pendants LIMK2a und LIMK2b interagiert es mit der vorgelagerten Kinase ROCK (Rho-assoziierte Proteinkinase). Wir zeigen, dass LIMK2-1 eine Kinase-Aktivität auf Myelin Basic Protein (MBP) hat, aber nicht auf Cofilin, dem kanonischen Substrat von LIM-Kinasen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1978</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-c-Myc</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-21316</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3312/5175</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-GFP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-HA</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11687423001</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-phospho-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3313</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Anti-PP1i</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>designed for this study</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A-162B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PV3227</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>g[32P] ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG502A</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14280</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>111-541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P06-20166</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM4611</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie PageBlue Protein Staining Solution</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>24620</td>
			<td>for gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Protean</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZview Red anti-HA affinity gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6779</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneTolls software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-trap beads</td>
			<td>Chromtek</td>
			<td></td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405</td>
			<td>for transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-cofilin</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>12-556</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>710</td>
			<td>to remove carefully supernatant from beads without aspirating them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant TL software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>for radioactivity acquisition and quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIMK2 siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>s8191</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SP-04-2217</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBP</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>13-173</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1112</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-1504</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Okaidic acid</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>0-2220</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenylphosphate</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1026</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobillon-P</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPVH00010 pore size 0,45 mm</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating wheel</td>
			<td>Labinco</td>
			<td></td>
			<td>for bead incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe lock eppendorf</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120.086</td>
			<td>for kinase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td>for Laemmli and migration buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>S8507</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71501</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal West Dura</td>
			<td>Protein Biology</td>
			<td>34075</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene Pxi</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue extracts 
			 
			&#160;</td>
			<td>Biochain 
			 
			&#160;</td>
			<td>P1234035 Brain 
			P12345152 Lung 
			P1234149 Liver 
			P1234188 Pancreas 
			P1234260 Testis</td>
			<td>for Western Blot analysis 
			 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Trans-Blot</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094 B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA9500</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>3030-672</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein

Die umfangreiche Sequenzierung des gesamten Genoms hat viele Open Reading Frames (ORFs) identifiziert, die viele potenzielle Proteine liefern. Diese Proteine können wichtige Rollen für die Zelle spielen und neue zelluläre Prozesse entwirren. Unter den Proteinen sind Kiinasen wichtige Akteure, da sie zu Zellsignalwegen gehören und die Fähigkeit haben, viele Prozesse ein- oder auszuschalten, die für das Schicksal der Zelle entscheidend sind, wie Zellwachstum, Teilung, Differenzierung, Beweglichkeit und Tod.
In dieser Studie konzentrierten wir uns auf ein neues potenzielles Kinase-Protein, LIMK2-1. Wir haben seine Existenz durch Western Blot mit einem spezifischen Antikörper demonstriert. Wir haben seine Wechselwirkung mit einem vorgelagerten regulierenden Protein anhand von Coimmunopräzipitationsexperimenten bewertet. Coimmunoprecipitation ist eine sehr leistungsfähige Technik, die in der Lage ist, die Wechselwirkung zwischen zwei Zielproteinen zu erkennen. Es kann auch verwendet werden, um neue Partner eines Köderproteins zu erkennen. Das Köderprotein kann entweder über ein auf seine Sequenz konstruiertes Tag oder über einen Antikörper gereinigt werden, der speziell auf es abzielt. Diese Proteinkomplexe können dann durch SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamidE Gel) getrennt und mittels Massenspektrometrie identifiziert werden. Immunpräzipitor LIMK2-1 wurde auch verwendet, um seine Kinase-Aktivität in vitro durch die ATP-Kennzeichnung zu testen. Dieser etablierte Assay kann viele verschiedene Substrate verwenden, und mutierte Versionen des Köders können verwendet werden, um die Rolle spezifischer Rückstände zu beurteilen. Die Wirkung pharmakologischer Wirkstoffe kann ebenfalls bewertet werden, da diese Technik sowohl hochsensibel als auch quantitativ ist. Dennoch erfordert die Behandlung von Radioaktivität besondere Vorsicht. Die Kinase-Aktivität kann auch mit spezifischen Antikörpern bewertet werden, die auf die Phosphogruppe der modifizierten Aminosäure abzielen. Diese Arten von Antikörpern sind nicht für alle phosphomodifizierten Rückstände kommerziell erhältlich.

LIMK2-1 Protein wird synthetisiert LIMK2-1 wird in Datenbanken erwähnt, aber bisher hat nur ein Papier die Existenz seiner mRNA18gezeigt. Im Vergleich zu seinen beiden Homologen LIMK2a und LIMK2b verfügt LIMK2-1 über eine zusätzliche C-Terminal-Domäne, die als Proteinphosphatase 1 Inhibitory Domain (PP1i) identifiziert wurde. Wir haben einen Antikörper entwickelt, der auf ein Peptid dieser Domäne abzielt, Aminosäuren 671-684 (<strong cla...

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Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Wir charakterisierten ein neues Kinase-Protein mit robusten biochemischen Ansätzen: Western Blot-Analyse mit einem speziellen Antikörper an verschiedenen Zelllinien und Geweben, Wechselwirkungen durch Coimmunozipitungsexperimente, Kinase-Aktivität, die von Western Blot mit einem phosphospezifischen Antikörper und durch die ATP-Kennzeichnung von32P.

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Immunpräzipitation ist eine sehr leistungsfähige Technik, um ein Zielprotein zu isolieren und zu reinigen. Bei glatten Bedingungen können Proteine, Regulatoren oder Substrate mitimmunimmunprezipitiert werden. Anschließend kann ein neues Interaktionsnetzwerk entdeckt werden.Die Aktivität des immunpräzipitierten Proteins kann ebenfalls beurteilt werden. Insbesondere kann die Aktivität einer Kinase auf verschiedenen Substraten durch P32-ATP-Kennzeichnung getestet werden. Dennoch kann die Aktivität von Inhibitoren, die auf eine Kinase abzielen, die an einer Krankheit beteiligt ist, bewertet werden.Sie können Bleiverbindungen zur Entwicklung neuer Medikamente darstellen. Diese Methode kann von Säugetieren auf Hefe oder Bakterien ausgedehnt werden. Diese Technik ist nicht so schwierig.Zu den wichtigsten Punkten: Stellen Sie sicher, dass Sie eine negative Kontrolle haben, um sicherzustellen, dass die erkannte Interaktion spezifisch ist, und wählen Sie sorgfältig Lysebedingungen aus, um Interaktionen und Aktivitäten beizubehalten. Kleine Details und Gesten sind wichtig, um den Erfolg dieser Technik zu gewährleisten, und sie werden nie in Materialien und Methoden von Artikeln beschrieben. Die Vorführung des Verfahrens wird Fabienne Godin, eine Technikerin aus unserem Labor, sein.Nachdem zellenweise im Zellkulturraum im Biosicherheitsschrank zellenhaft zubereitet wurde, verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um das Medium von den Platten zu entfernen und in einer speziellen Abfallflasche mit Bleichmittel zu entsorgen. Dann fügen Sie 10 Milliliter frisch ergänzt DMEM, und legen Sie die Platten wieder in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Zur Herstellung des Transfektionsgemisches in einem 15-Milliliter-Rohr 450 Mikroliter 10 Millimolar Tris Hydrochloridlösung bei pH 7,5 hinzufügen, ergänzt durch eine Millimolar EDTA und 50 Mikroliter 2,5 Mol Calciumchloridlösung.Mix durch Inversion. Fügen Sie in die Röhre ein Volumen hinzu, das 10 Mikrogramm Plasma-DNA entspricht, verstärkt durch ein DNA-Midiprep-Kit, und mit dem Elutionspuffer dieses Kits verdünnt wird und dessen Konzentration bestimmt wurde. Invertieren Sie das Rohr zu mischen.Dann, mit glatter Erregung auf einem Wirbelmischer, langsam 500 Mikroliter BES gepuffert es aline 2X Konzentrat hinzufügen, Tropfen für Tropfen in die Röhre. Bewegen Sie es sehr vorsichtig, um die komplexe Bildung zwischen DNA und Calciumphosphat nicht zu stören. Mindestens 15 Minuten oder bis zu 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Übertragen Sie nun die Platte, um sie vom Inkubator in den Sicherheitsschrank zu transfekieren. Fügen Sie die vorbereiteten DNA-Komplexe Tropfen für Tropfen auf die Zellen auf der gesamten Oberfläche der Platte. 24 bis 72 Stunden im Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren.Um den Proteinabbau zu verhindern, bereiten Sie den Lysepuffer auf Eis vor, wobei sie vier Milliliter Lysepuffer für jede transfizierte Platte berücksichtigen. Nehmen Sie die Platte mit transfizierten Zellen aus dem Inkubator. Entfernen Sie die Medien und entsorgen Sie sie in einer speziellen Bleichabfallflasche.Um die Zellen zu waschen, fügen Sie drei Milliliter kalte PBS auf der Seite der Platte Tropfen für Tropfen hinzu, um zu vermeiden, dass transfizierte Zellen abgelöst werden. Und wirbeln Sie die Platte sanft, um den Puffer über die oberfläche zu verteilen. Neigen Sie die Platte, um die PBS zu entfernen und entsorgen Sie sie in die Abfallflasche.Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal. Legen Sie die Platte auf Eis. Entfernen Sie am Ende vorsichtig den Rest der PBS.Als nächstes fügen Sie den transfizierten gewaschenen Zellen 500 Mikroliter Kaltlysepuffer hinzu. Verteilen Sie es über die gesamte Oberfläche der Platte. 10 Minuten auf Eis bebrüten.Von Zeit zu Zeit, wieder verteilen Sie den Puffer über die Oberfläche der Platte. Danach verwenden Sie einen Zellspachtel, um die Zellen von der Oberfläche abzukratzen und in einem Mikrozentrifugenrohr zu sammeln. Zentrifuge für 10 Minuten bei 10.000 mal G und vier Grad Celsius.Sammeln Sie das überstande Lysat in ein neues Mikrozentrifugenrohr und sammeln Sie einen 50-Mikroliter-Aliquot dieser Fraktion zu einem anderen neuen Mikrozentrifugenrohr. Dieses Aliquot wird verwendet, um zu überprüfen, ob transfizierte Proteine gut exprimiert sind. Entsorgen Sie das Pellet im Papierkorb.Erstens, die Lagerlösung von Agaroseperlen in Verbindung mit dem entsprechenden Antikörper vorsichtig wieder aufsetzen. Schneiden Sie das Ende einer 200-Mikroliter-Spitze, um eine ein bis zwei Millimeter Öffnung zu machen. Befestigen Sie die Spitze an einer Mikropipette und ziehen Sie 40 Mikroliter der Lösung, so dass Perlen in die Spitze gelangen können.Pipette die Perlen auf und ab mehrmals, um die Spitze zu sättigen, um das richtige Volumen der Perlen zu gewährleisten und die Perlen auf ein Mikrozentrifugenrohr übertragen. Fügen Sie 500 Mikroliter TNET-Puffer, mischen Sie durch Inversion, und Zentrifuge für zwei Minuten bei 1 000 mal G und vier Grad Celsius. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, und fügen Sie 500 Mikroliter TNET-Puffer hinzu.Mindestens eine Stunde lang bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad inkubieren. Dann zentrifugieren Sie das Rohr für zwei Minuten bei 1 000 mal G und vier Grad Celsius und waschen Sie die Perlen zweimal mit 500 Mikroliter Lysepuffer durch Invertieren und Zentrifugieren. Nach dem Waschen den zuvor gesammelten Gesamtanteil lysieren in die Röhre und zwei bis vier Stunden auf einem rotierenden Rad bei vier Grad Celsius brüten.Jetzt zentrifugieren Sie das Rohr mit den immunpräzipierten Perlen für zwei Minuten bei 1 000 mal G und vier Grad Celsius. Waschen Sie die Perlen fünfmal mit 500 Mikroliter Lysepuffer durch Invertieren und Zentrifugieren. Achten Sie beim Waschen der Perlen darauf, nicht zu nah an die Perlen zu gehen, während Sie Überstand entfernen.Andernfalls werden Perlen angesaugt und am Ende des Experiments werden keine Perlen mehr übrig bleiben. Zur Elution die erste Zentrifuge für zwei Minuten bei 1 000 mal G und vier Grad Celsius. Verwenden Sie eine 1 Milliliter Mikropipette, um den Überstand sorgfältig zu entfernen.Dann, mit einer Hamilton-Spritze mit einer zementierten Nadel ausgestattet, entfernen Sie die letzten Tropfen des Überstandes, um das Streben der Perlen zu vermeiden. Als nächstes fügen Sie 40 Mikroliter 4X Laemmli Puffer hinzu. Homogenisieren Sie durch sanftes Antippen des Rohres.Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann Zentrifuge für fünf Minuten bei 10.000 mal G und Raumtemperatur. Mit einer Hamilton-Spritze das Überstand-Eluat in ein neues Mikrozentrifugenrohr übertragen.Bei minus 80 Grad Celsius lagern. HEK-293-Zellen wurden mit nicht markiertem LIMK 2-1 oder einer der HA-markierten Isoformen von LIMK 2 transfiziert. LIMK 2-1 ist in den verschiedenen Bedingungen gut ausgedrückt.Anti LIMK 2-1 Antikörper erkennt LIMK 2a und LIMK 2b Isoformen nicht und ist spezifisch, da sein Signal abnimmt, wenn Zellen mit LIMK2 small interfering RNA transfiziert werden, im Vergleich zur Kontrolle kleiner störender RNA. In verschiedenen menschlichen Zelllinien schien LIMK 2-1 in HEK-293 und HeLa exprimiert zu werden, aber nicht in C6. Coimmunopräzipitationsexperimente wurden verwendet, um die Wechselwirkung von LIMK2-1 mit der vorgelagerten Kinase ROCK zu bewerten. Jedes der verschiedenen Proteine, die von den transfizierten Vektoren kodiert wurden, waren gut exprimiert.Die drei Isoformen von LIMK2 sowie Larp6 wurden effizient immunwirksam immunwirksam. In den Eluaten wurde ROCK mit den drei Isoformen von LIMK2, nicht aber mit Larp6, nachgewiesen und damit koimmunisiert. Die erkannte Interaktion ist dann spezifisch.Coimmunoprecipitated LIMK 2-1 wurde auf seine Kinase-Aktivität mittels Gamma P32 ATP-Kennzeichnung getestet. LIMK 2-1 nicht Phosphorylat Cofilin, während es Phosphorylat Myelin Basisprotein, oder MBP. LIMK 2-1 wird in diesem Test effizient immunpräzipiert.Es ist wichtig, negative Kontrolle zu haben, während Immunpräzipitation durchzuführen, um sicherzustellen, dass die Interaktion spezifisch ist. Die Zusammensetzung eines Lysepuffers muss sorgfältig eingerichtet werden, um Interaktion und Aktivität zu erhalten. Bei Immunpräzipitation kann die Kinaseaktivität bewertet werden, um verschiedene Substrate zu zählen.Mutationen können leicht eingeführt werden und die Rolle bestimmter Rückstände entwirren. Funktionelle Studien können auch durchgeführt werden, um die physiologische Rolle neuer hervorgehobener Wechselwirkungen zu verstehen. Zellen müssen in einem eigenen Kulturraum innerhalb eines Biosicherheitsschranks kultiviert werden.P32 ATP ist mit besonderer Vorsicht zu behandeln. Schutzschild zum Schutz vor Strahlung, Geigerzähler, spezifische Abfallsammlung, persönliche Brust- und Fingerabzeichen zum Erkennen radioaktiver Exposition und Filterspitzen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Forschung

Biochemie

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

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Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

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