Name: characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein
Uploaded: 2019-06-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי La ligue דשנה סרטן, l ' האגודה נוירופיבאטוטוסס ורקלינגהאוזן, ואת מרכז העיר וואל דה לואר. תודות לAurélie קסון ולדבוראה קסס לגבי מידע מעמיק של כתבי היד ולקיירון היקמן-לואיס.

1. הכנה לתא לתרגום מעגל
התראה: יש לבצע את כל השלבים של תרבות התא במעבדה ייעודית, והתאים מניפולציות בתוך ארון מיקרוביולוגי של Class 2.
<ol><li>זרע HEK-293 (האדם כליה עובריים) תאים ב-Ø 10 ס מ לוחות ב 10 מ ל של DMEM (מדיום הנשרים שונה של Dulbecco) שיושלם עם 10% סרום עגל עוברי. תרבות עבור 3 עד 5 ימים מתחת 5%...

<ol>
	<li>Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+protein+kinase+signaling+from+yeast+to+man.">Evolution of protein kinase signaling from yeast to man.</a> Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).</li><li>Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution,+dynamics+and+dysregulation+of+kinase+signalling.">Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling.</a> Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).</li><li>Bhullar, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase-targeted+cancer+therapies:+progress,+challenges+and+future+directions.">Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions.</a> Molecular Cancer. 17, 48 (2018).</li><li>Kaboord, B., Perr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+proteins+and+protein+complexes+by+immunoprecipitation.">Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.</a> Methods in Molecular Biology. 424, 349-364 (2008).</li><li>Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+strategies+for+the+use+of+affinity+tags+and+tag+removal+for+the+purification+of+recombinant+proteins.">Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins.</a> Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).</li><li>Wood, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+trends+and+affinity+tag+designs+for+recombinant+protein+purification.">New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).</li><li>Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+and+purification:+a+comprehensive+review+of+affinity+tags+and+microbial+applications.">Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications.</a> Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).</li><li>Greenwood, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins.">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li><li>Wang, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Dynamic+and+Heterogeneous+Proteasome+Complexes+Using+In+vivo+Cross-Linking-Assisted+Affinity+Purification+and+Mass+Spectrometry.">Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1844, 401-410 (2018).</li><li>Raykova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+There+Be+Light!.">Let There Be Light!.</a> Proteomes. 4, (2016).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).</li><li>Podobnik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+Study+Protein-protein+Interactions.">How to Study Protein-protein Interactions.</a> Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).</li><li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection:+methods+and+analysis.">Protein-protein interaction detection: methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).</li><li>Peck, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+phosphorylation:+methods+and+strategies+for+studying+kinases+and+substrates.">Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).</li><li>Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+in+vitro+kinase+assay+technologies:+the+quest+for+a+universal+format.">Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format.</a> Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).</li><li>Okano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+family+of+serine/threonine+kinases+containing+two+N-terminal+LIM+motifs.">Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).</li><li>Croft, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-mediated+transcriptional+regulation+and+activation+of+the+actin+cytoskeleton.">p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton.</a> Cell Research. 21, 666-682 (2011).</li><li>Tastet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1+is+a+Hominidae-Specific+Isoform+of+LIMK2+Expressed+in+Central+Nervous+System+and+Associated+with+Intellectual+Disability.">LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability.</a> Neuroscience. 399, 199-210 (2019).</li><li>Vallee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1,+a+new+isoform+of+human+LIMK2,+regulates+actin+cytoskeleton+remodeling+via+a+different+signaling+pathway+than+that+of+its+two+homologs,+LIMK2a+and+LIMK2b.">LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b.</a> The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).</li><li>Lee, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detergents+on+Membrane+Protein+Complex+Isolation.">Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation.</a> Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).</li></ol>

כאן, השתמשנו בכלים ביוכימיים חזקים כדי לאפיין ברמה המולקולרית חלבון חדש, LIMK2-1, האמינו להיות קינאז מבוסס על הרצף שלה ועל יומני ההומויום שלה, LIMK2a ו LIMK2b20.
ראשית, הדגמנו את קיומו של LIMK2-1 ברמת החלבון באמצעות ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי. בעקבות זאת, הערכנו את ה...

במשך עשורים רבים, מסלולי איתות רבים כבר הובהר ואת מעורבותם בתהליכים סלולריים מכריע כגון חלוקת תאים, בידול, תנועתיות, מוות תאים מתוכנת, חסינות ונוירוביולוגיה, הוכח. קינסים לשחק תפקיד משמעותי אלה מסלולים איתות כפי שהם לעתים קרובות מווסת את ההפעלה שלהם או איון פעלה הם חלק מתחמי רב-תכליתי ארעי כי להגיב גירויים חיצוניים1,2,3. מוטציה ודיסרגולציה של קינסים לעיתים קרובות להוביל מחלות בבני אדם, ולכן הם הפכו לאחד מטרות הסמים החשובים ביותר במהלך 40 השנים האחרונות4.
בהקשר זה, חשוב להיות מסוגל לזהות את האינטראקציה של קינאז עם הרגולטורים שלהם במעלה הזרם או מצעים במורד ולזהות שותפים חדשים. טיהור וimmunoprecipitation אהדה הם טכניקות רבות עוצמה לבידוד של מכלולי חלבונים5. חלבון הפיתיון או קינאז עשוי להיות מתויג עם רצף פפטיד מסוים המאפשר שימוש בחרוזים מסחריים בשילוב עם נוגדנים מיקוד הפפטיד. החומר הזה מאפשר הזיית הגדול בניסויים6,7,8. חלבונים אנדוגני עשויים גם להיות immunoprecipitated באמצעות נוגדנים מיקוד ישירות החלבון פיתיון. הנוגדנים יכול להיות מקושרת מקושרת חלבון A או חלבון G agarose חרוזים או פשוט מודבטים עם חרוזים אלה לפני הוספת lysate. מאגרי לליזה חייב להיות ממוטב כדי לאפשר מסיסות חלבונים מבלי לאבד אינטראקציה כדי למנוע השפלה חלבון. החיסרון העיקרי של גישה זו הוא כי האינטראקציה מזוהה על הליזה תאים; לפיכך, אינטראקציות זמניות או חלשות, יחד עם אלה הדורשות הקשר משנה-תאית עלול להיות חסר. טכניקות אחרות עשויות לשמש לעבודה ישירות בתא כגון שיטת הסמיכות הקרבה (PLA)9, ב vivo חוצה קישור-בסיוע לטיהור אהדה (xap)10, ביולומיאנמינציה העברת אנרגיה העברה (ברט) או Förster אנרגיית התהודה העברה (סריג)11,12. יתרה מזאת, הimmunoprecipitation אינו מתאים לקבוע את הקבועים התרמודינמיים של הכריכה, שעליהם טכניקות פיזיות כגון משטח תהודה במשטח, איזותרמי טיטור קלורימטריה או תרמופלאזיס מיקרוסקאלה . 13,14.
פעילות קינאז עשויה להיות מוערך באמצעות טכניקות מרובות. בזאת, אנו התמקדו נוגדנים ספציפיים פוספאו γ [32P] ATP (אדנוזין triphosphate) תיוג. הנוגדנים הספציפיים של פואהו מכוונים לשינוי פוספט של שאריות מסוימים בתוך חלבון. ניתן להשתמש בהם באבן החשופה המערבית או באליסה (השיטה החיסונית המקושרת באמצעות אנזימים) לאחר פירוק תאים, עבור אימונוהיסטוכימיה, וגם על תאים שלמים באמצעות הזרמת cy, או immunofluorescence. החסרונות שלהם עשויים לכלול חוסר ספציפיות, אשר ניתן להעריך באמצעות גרסה מוטציה של חלבון היעד, ושלהם לא להיות זמין מסחרית עבור כל החלבונים. בשנת החוץ γ [32P] תיוג ATP היא חזקה מאוד, שיטה מבוססת היטב ורגישה מאוד15. חלבונים Immunoprecipitated או רקומביננטי ניתן להשתמש, ומצעים שונים עשויים להיבדק. ההשפעות של תרופות ניתן גם להעריך כמו שיטה זו היא כמותית. החיסרון העיקרי שלה הוא כי הרדיואקטיביות הקשורה הגישה דורשת טיפול בזהירות. שיטות חלופיות אפשריות גם על בסיס מדידה של מצעים הפלורסצנט או של פפטיד ומנצלים את המאפיינים של פלורסנט משתנה/זורח על זירחון. שיטות כאלה גם לאפשר תפוקה גבוהה, אשר נדרש, למשל, בהקרנה של מולקולות שעלולות להיות מעכבי פוטנציאליים של קינאז היעד. אכן, הקינסים מייצגים את אחד השיעורים הגדולים ביותר של מטרות הסמים שנרדף על ידי חברות התרופות16.
במחקר זה, אנו מתמקדים LIMK2-1 חלבון (LIMK2-1 מייצג Lin11, Isle1, Mec3 קינאז isoform 2-1). חלבון LIMK2 קינאז תואר לראשונה ב-199517. שלושה איזוצורות של LIMK2 מיוצרים על ידי שחבור חלופיים: LIMK2a, LIMK2b ו LIMK2 -1. כיום, LIMK2-1 תוארה רק ברמת mRNA במחקר אחד18. להלן, אנו מגדירים את החלבון החדש הזה של קינאז ברמה המולקולרית, תוך שימוש בגישות ביוכימיות חזקות. ראשית, אנו להדגים כי LIMK2-1 אכן מסונתז. בדומה לשני עמיתיהם, LIMK2a ו-LIMK2b, היא מקיימת אינטראקציה עם ROCK קינאז במעלה (Rho-חלבון קינאז). אנו מראים LIMK2-1 יש פעילות קינאז על חלבון המיאלין Basic (MBP), אבל לא על קופפלין, המצע קאנוני של LIM.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1978</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-c-Myc</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-21316</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3312/5175</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-GFP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-HA</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11687423001</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-phospho-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3313</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Anti-PP1i</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>designed for this study</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A-162B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PV3227</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>g[32P] ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG502A</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14280</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>111-541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P06-20166</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM4611</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie PageBlue Protein Staining Solution</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>24620</td>
			<td>for gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Protean</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZview Red anti-HA affinity gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6779</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneTolls software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-trap beads</td>
			<td>Chromtek</td>
			<td></td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405</td>
			<td>for transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-cofilin</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>12-556</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>710</td>
			<td>to remove carefully supernatant from beads without aspirating them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant TL software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>for radioactivity acquisition and quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIMK2 siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>s8191</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SP-04-2217</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBP</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>13-173</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1112</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-1504</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Okaidic acid</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>0-2220</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenylphosphate</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1026</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobillon-P</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPVH00010 pore size 0,45 mm</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating wheel</td>
			<td>Labinco</td>
			<td></td>
			<td>for bead incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe lock eppendorf</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120.086</td>
			<td>for kinase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td>for Laemmli and migration buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>S8507</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71501</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal West Dura</td>
			<td>Protein Biology</td>
			<td>34075</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene Pxi</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue extracts 
			 
			&#160;</td>
			<td>Biochain 
			 
			&#160;</td>
			<td>P1234035 Brain 
			P12345152 Lung 
			P1234149 Liver 
			P1234188 Pancreas 
			P1234260 Testis</td>
			<td>for Western Blot analysis 
			 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Trans-Blot</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094 B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA9500</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>3030-672</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein

רצף הגנום השלם נרחב זיהה מסגרות קריאה פתוחות רבות (ORFs) מתן חלבונים פוטנציאליים רבים. חלבונים אלה עשויים להיות תפקידים חשובים לתא ועלול לפענח תהליכים סלולריים חדשים. בין החלבונים, קינסים הם שחקנים גדולים כפי שהם שייכים לתא איתות מסלולים ויש להם את היכולת לעבור או לבטל תהליכים רבים חיוניים לגורל התא, כגון צמיחת תאים, חלוקה, בידול, תנועתיות, ומוות.
במחקר זה התמקדנו בחלבון קינאז חדש, LIMK2-1. הדגמנו את קיומו על ידי אבן החשופה המערבית באמצעות נוגדן ספציפי. הערכנו את האינטראקציה שלה עם חלבון במעלה הזרם באמצעות ניסויים coimmunoprecipitation. Coimmunoprecipitation היא טכניקה רבת עוצמה מסוגל לזהות את האינטראקציה בין שני חלבונים היעד. זה יכול לשמש גם כדי לזהות שותפים חדשים של חלבון פיתיון. ניתן לטהר את חלבון הפיתיון באמצעות תגית המיועדת לרצף שלו או באמצעות נוגדן המכוון אותו במפורש. מכלולי חלבון אלה עשויים להיות מופרדים על-ידי SDS-PAGE (נתרן Dodecyl סולפט PolyAcrylamide ג'ל) ומזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה. Immunoprecipitated LIMK2-1 שימש גם כדי לבחון את פעילותה קינאז בתוך מבחנה על ידי γ [32P] ATP תיוג. שיטת מבוסס-היטב זו עשויה להשתמש במספר רב של מצעים שונים, וניתן להשתמש בגרסאות מוטציה של הפיתיון כדי להעריך את התפקיד של שאריות מסוימים. ההשפעות של סוכני תרופתי עשוי גם להיות מוערך מאז טכניקה זו הן רגישות מאוד כמותית. למרות זאת, הטיפול ברדיואקטיביות. דורש זהירות מיוחדת פעילות קינאז עשויה גם להיות מוערך עם נוגדנים ספציפיים מיקוד קבוצת פוספהו של חומצת האמינו ששונתה. סוגים אלה של נוגדנים אינם זמינים מסחרית עבור כל שאריות פוספהו שונה.

חלבון LIMK2-1 הוא מסונתז LIMK2-1 מוזכר מאגר נתונים, אבל עד כה רק נייר אחד הראה את קיומו של mRNA שלה18. לעומת שלה שני הומויומנים שלה, LIMK2a ו LIMK2b, LIMK2-1 יש מתחם C-terminal נוסף המזוהה כמו חלבון פוספספטאז 1 תחום מעכבות (PP1i). עיצבנו נוגדן המטרה פפטיד של תחום זה, חומצות אמינו...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein at JoVE.com

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

אנו מאופיינים חלבון קינאז חדש באמצעות גישות ביוכימיים חזקים: ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי ייעודי על קווי תאים שונים ורקמות, אינטראקציות על ידי ניסויים coimmunoprecipitation, הפעילות של קינאז שזוהו על ידי המערב כתם באמצעות נוגדן ספציפי פוספהו ועל ידי γ [32P] ATP תיוג.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Immunoprecipitation היא טכניקה חזקה מאוד לבודד ולטהר חלבון היעד. בתנאים חלקים, חלבונים, וסתים או מצעים עשויים להיות חיסוניים במשותף. לאחר מכן, ייתכן שתתגלה רשת אינטראקציה חדשה.ניתן להעריך גם את פעילות החלבון האימונופריפיטי. בפרט, פעילות של קינאז עשוי להיבדק על מצעים שונים על ידי תיוג P32-ATP. עם זאת, ניתן להעריך פעילות של מעכבים המכוונים לקינאז המעורב במחלה.הם עשויים להוות תרכובות עופרת לפתח תרופות חדשות. שיטה זו יכולה להיות מורחבת מיונקים לשמרים או חיידקים. טכניקה זו אינה כל כך קשה.לנקודות מפתח:ודא שיש לך שליטה שלילית כדי לוודא שהאינטראקציה שזוהתה היא ספציפית, ובחר בקפידה תנאי תיזה כדי לשמור על אינטראקציות ופעילות. פרטים קטנים ומחוות חשובים כדי להבטיח את ההצלחה של טכניקה זו, והם אף פעם לא מתוארים בחומרים ושיטות של מאמרים. הדגימה של ההליך תהיה פביאן גודין, טכנאית מהמעבדה שלנו.לאחר התאים מוכנים בחדר תרבות התא בתוך ארון biosafety, להשתמש פיפטה 10 מיליליטר כדי להסיר את התקשורת מן הצלחות להשליך אותו בבקבוק פסולת ייעודי עם אקונומיקה. לאחר מכן, מוסיפים 10 מיליליטר של DMEM טרי בתוספת, ומכניסים את הצלחות בחזרה לתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. כדי להכין את תערובת ההמרה, בצינור 15 מיליליטר, להוסיף 450 microliters של 10 מילימולר טריס הידרוכלוריד פתרון ב pH 7.5, בתוספת EDTA מילימולר אחד ו 50 microliters של 2.5 תווי סידן טוחנת.מערבבים על ידי היפוך. לתוך הצינור, להוסיף נפח המתאים 10 מיקרוגרם של DNA פלזמה, מוגברת על ידי ערכת midiprep DNA, ומדולל עם מאגר elution של ערכה זו, וריכוזו נקבע. להפוך את הצינור לערבב.לאחר מכן, עם תסיסה חלקה על מערבל מערבולת, לאט להוסיף 500 microliters של BES מאגר מלוחים 2X להתרכז, טיפה אחר טיפה לתוך הצינור. להזיז אותו בזהירות רבה, לא להפריע היווצרות מורכבת בין DNA וסידן פוספט. דגירה לפחות 15 דקות, או עד 45 דקות, בטמפרטורת החדר.עכשיו, להעביר את הצלחת כדי לעבור מהחממה לארון הבטיחות. מוסיפים את קומפלקס הדנ"א המוכן טיפה אחר טיפה על התאים על כל פני השטח של הצלחת. אינקובט במשך 24 עד 72 שעות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.כדי למנוע השפלת חלבונים, הכינו חיץ תזה על קרח, תוך התחשבות בארבעה מיליליטר של חיץ תזה לכל צלחת מקולבקת. קח את הצלחת עם תאים מנופלים מהאינקובטור. הסר את התקשורת והשליך אותה בבקבוק פסולת אקונומיקה ייעודי.כדי לשטוף את התאים, להוסיף שלושה מיליליטר של PBS קר בצד של צלחת טיפה על ידי טיפה, כדי למנוע ניתוק תאים מנודים. ובעדינות מערבל את הצלחת כדי להפיץ את החיץ על פני השטח. להטות את הצלחת כדי להסיר את PBS ולהשליך אותו לתוך בקבוק הפסולת.חזור על הכביסה פעם נוספת. מניחים את הצלחת על קרח. בסוף, להסיר בזהירות את שאר PBS.לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר תזה קרה לתאים שטופים מנופים. מורחים אותו על פני הלוח. דגירה במשך 10 דקות על קרח.מעת לעת, שוב להפיץ את המאגר על פני השטח של הלוח. לאחר מכן, השתמש מרית התא כדי לגרד את התאים מעל פני השטח ולאסוף אותם בצינור microcentrifuge. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 10, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס.לאסוף את ליסנטנט על טבעי לתוך צינור microcentrifuge חדש ולאסוף aliquot 50 microliter של שבר זה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש אחר. aliquot זה ישמש כדי לבדוק אם חלבונים מנוקטים באים לידי ביטוי היטב. השלך את גלולת האשפה לפח.ראשית, יש לעכל בעדינות את פתרון המלאי של חרוזי אגרוז יחד עם הנוגדן המתאים. חותכים את הקצה של קצה 200 מיקרוליטר כדי להפוך את פתח אחד עד שני מילימטר. חבר את הקצה למיקרופיגט וצייר 40 מיקרוליטרים של הפתרון, מה שמאפשר ל חרוזים להיכנס לקצה.פיפטה את חרוזים למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להרוות את הקצה כדי להבטיח את הנפח הנכון של חרוזים ולהעביר את חרוזים צינור microcentrifuge. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של חיץ TNET, ערבבו לפי היפוך וצנטריפוגה במשך שתי דקות במהירות של פי 1,000 G וארבע מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את העל-טבעי והוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר TNET.דגירה על גלגל מסתובב לפחות שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור במשך שתי דקות ב 1, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס ולשטוף את חרוזים פעמיים עם 500 microliters של חיץ תמוגה על ידי היפוך צנטריפוגה. לאחר הכביסה, מעבירים את השבר הכולל שנאסף בעבר לצינור ו דגירה על גלגל מסתובב בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד ארבע שעות.עכשיו, צנטריפוגה הצינור המכיל את חרוזים immunoprecipitated במשך שתי דקות ב 1, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. לשטוף את חרוזים חמש פעמים עם 500 microliters של חיץ תמוגה על ידי היפוך צנטריפוגה. בעת שטיפת חרוזים, יש לדאוג לא להתקרב יותר מדי מהחרוזים תוך הסרת על-טבעי.אחרת, חרוזים ישואף ובסוף הניסוי, לא יישארו עוד חרוזים. עבור אלוטיון, צנטריפוגה ראשונה במשך שתי דקות ב 1, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. השתמש במיקרופיגט מיליליטר אחד כדי להסיר בזהירות את העל-טבעי.לאחר מכן, עם מזרק המילטון מצויד במחט מבוצרת, להסיר את הטיפות האחרונות של supernatant כדי למנוע שאיפה של חרוזים. לאחר מכן, להוסיף 40 microliters של חיץ 4X Laemmli. הומוגניזציה על ידי הקשה עדין על הצינור.דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 10, 000 פעמים G וטמפרטורת החדר. עם מזרק המילטון, להעביר את העל טבעי eluate לתוך צינור microcentrifuge חדש.יש לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. תאי HEK-293 נותבו עם LIMK 2-1 לא מתויג או אחד מהאיסופורמים המתויגים של LIMK 2. LIMK 2-1 מתבטא היטב בתנאים השונים.נוגדן אנטי LIMK 2-1 אינו מזהה LIMK 2a ו LIMK 2b isoforms, וזה ספציפי, כמו האות שלה פוחתת כאשר תאים מומרים עם LIMK2 RNA מפריע קטן, לעומת שליטה RNA מפריע קטן. בשורות תאים אנושיים שונים, LIMK 2-1 נראה לידי ביטוי HEK-293 ו HeLa, אבל לא ב C6. ניסויי Coimmunoprecipitation שימשו להערכת האינטראקציה של LIMK2-1 עם רוק קינאז במעלה הזרם. כל אחד מהחלבונים השונים המקודדים על ידי הווקטורים המנודים בא לידי ביטוי היטב.שלושת האיסופורמים של LIMK2, כמו גם larp6, היו immunoprecipitated ביעילות. ב eluates, רוק זוהה ובכך coimmunoprecipitated עם שלושת isoforms של LIMK2, אבל לא עם larp6. האינטראקציה שזוהתה היא ספציפית לאחר מכן.Coimmunoprecipitated LIMK 2-1 נבדק עבור פעילות קינאז שלה באמצעות תיוג ATP גמא P32. LIMK 2-1 לא זרחן קופלין, ואילו זה עשה זרחן מילין חלבון בסיסי, או MBP. LIMK 2-1 הוא immunoprecipitated ביעילות במבחן זה.זה קריטי כדי לקבל שליטה שלילית בעת ביצוע immunoprecipitation כדי להיות בטוח האינטראקציה היא ספציפית. יש להגדיר בקפידה את ההרכב של מאגר תיזה כדי לשמר אינטראקציה ופעילות. לאחר immunoprecipitation, ניתן להעריך את פעילות קינאז כדי לספור מצעים שונים.מוטציה עשויה להיות הציגה בקלות ועשויה לפענח את התפקיד של שאריות ספציפיות. מחקרים פונקציונליים עשויים להתבצע גם כדי להבין את התפקיד הפיזיולוגי של אינטראקציות מודגשות חדשות. תאים חייבים להיות מתורבתים בחדר תרבות ייעודי בתוך ארון ביו-בטיחות.יש לטפל ב- P32 ATP בזהירות מסוימת. מגן להגנה מפני קרינה, מונה גייגר, איסוף פסולת ספציפית, תגי חזה ואצבע אישיים לזיהוי חשיפה רדיואקטיבית וטיפים לסינון.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

דם היקפי הדם נויטרופילים בידוד עבור חקירת פרקינסון הקשורים LRRK2 קינאז מסלול על ידי הערכת Rab10 זירחון

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

שיפור העפילו של תא גזע הנגרם לידי אדם-קרדיוציטים באמצעות עיכוב חולף של פעילות Rho קינאז

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...