Name: characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein
Uploaded: 2019-06-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da La Ligue contre le Cancer, l'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen e il Région Centre Val de Loire. Molte grazie ad Aurélie Cosson e Déborah Casas per i dati sulla citometria di flusso, e a Keyron Hickman-Lewis per una lettura approfondita del manoscritto.

1. Preparazione cellulare per la trasfezione
DESTRA: Tutti i passi della coltura cellulare devono essere eseguiti in un laboratorio dedicato e le cellule vengono manipolate all'interno di un mobile microbiologico di classe 2.
<ol><li>Cellule di semi HEK-293 (Rene embrionale umano) in piastre da 10 cm in 10 mL di DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) completate con siero di vitello fetale al 10%. Coltura per 3-5 giornisotto il 5% di CO 2, a 37 gradi centigradi, fino a raggiunger...

<ol>
	<li>Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+protein+kinase+signaling+from+yeast+to+man.">Evolution of protein kinase signaling from yeast to man.</a> Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).</li><li>Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution,+dynamics+and+dysregulation+of+kinase+signalling.">Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling.</a> Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).</li><li>Bhullar, K. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-mediated+transcriptional+regulation+and+activation+of+the+actin+cytoskeleton.">p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton.</a> Cell Research. 21, 666-682 (2011).</li><li>Tastet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1+is+a+Hominidae-Specific+Isoform+of+LIMK2+Expressed+in+Central+Nervous+System+and+Associated+with+Intellectual+Disability.">LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability.</a> Neuroscience. 399, 199-210 (2019).</li><li>Vallee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1,+a+new+isoform+of+human+LIMK2,+regulates+actin+cytoskeleton+remodeling+via+a+different+signaling+pathway+than+that+of+its+two+homologs,+LIMK2a+and+LIMK2b.">LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b.</a> The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).</li><li>Lee, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detergents+on+Membrane+Protein+Complex+Isolation.">Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation.</a> Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).</li></ol>

Qui, abbiamo usato robusti strumenti biochimici per caratterizzare a livello molecolare una nuova proteina, LIMK2-1, che si ritiene sia una chinasi basata sulla sua sequenza e sui suoi omologhi, LIMK2a e LIMK2b20.
In primo luogo, abbiamo dimostrato l'esistenza di LIMK2-1 a livello proteico usando l'analisi Western Blot con un anticorpo specifico. In seguito, abbiamo valutato la sua interazione con la chinasi a monte ROCK1, che è nota per regolare LIMK2a e LIMK2b, gli o...

Per molti decenni, sono state chiarite numerose vie di segnalazione e il loro coinvolgimento in processi cellulari cruciali come la divisione cellulare, la differenziazione, la motilità, la morte cellulare programmata, l'immunità e la neurobiologia, è stato dimostrato. Le chinasi svolgono un ruolo significativo in questi percorsi di segnalazione in quanto spesso regolano finemente la loro attivazione o inattivazione e fanno parte di complessi versatili transitori che rispondono agli stimoli esterni1,2,3. La mutazione e la disregolazione delle chinasi spesso portano a malattie nell'uomo, e quindi sono diventate uno dei più importanti obiettivi farmacologici negli ultimi quarant'anni4.
In questo contesto, è importante essere in grado di rilevare l'interazione della chinasi con le loro autorità di regolamentazione a monte o conto rizzate a valle e identificare nuovi partner. La purificazione dell'affinità e l'immunoprecipitazioni sono tecniche molto potenti per l'isolamento dei complessi proteici5. La proteina o chinasi dell'esca può essere etichettata con una specifica sequenza di peptidi che consente l'uso di perline commerciali accoppiate covalentmente con anticorpi che colpiscono il peptide. Questo materiale permette un'elevata riproducibilità negli esperimenti6,7,8. Le proteine endogene possono anche essere immunoprecipitate utilizzando anticorpi che colpiscono direttamente la proteina esca. Gli anticorpi possono essere collegati in modo incrociato alle perle proteiche A o Agarose proteiche o semplicemente incubati con queste perline prima di aggiungere il lisato. I buffer di lisi devono essere ottimizzati per consentire la solubilità delle proteine senza perdere l'interazione ed evitare la degradazione delle proteine. Uno svantaggio principale di questo approccio è che l'interazione viene rilevata sulla lisi cellulare; pertanto, le interazioni transitorie o deboli, insieme a quelle che richiedono il contesto subcellulare possono essere perse. Altre tecniche possono essere utilizzate per lavorare direttamente nella cella come Proximity Ligation Assay (PLA)9, in vivo cross-linking-assisted affinity purification (XAP)10, Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) o F Trasferimento (FRET)11,12. Inoltre, l'immunoprecipitazioni non è appropriata per determinare le costanti termodinamiche dell'attacco, per le quali sono necessarie tecniche fisiche come la risonanza del Plasmona di superficie, la calorimetria della frequenza isotermale o la termofore microscala 13,14.
L'attività della chinasi può essere valutata utilizzando più tecniche. Qui, ci siamo concentrati sugli anticorpi specifici per il fosforo e in vitro:[32P] ATP (Adenosine TriPhosphate) etichettatura. Gli anticorpi specifici per il fosforo prendono di mira la modifica del fosfato di un particolare residuo all'interno di una proteina. Possono essere utilizzati in Western Blot o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) dopo la lisi cellulare, per l'immunohistochimica, e anche su cellule intatte utilizzando citometria di flusso o immunofluorescenza. I loro inconvenienti possono includere la loro mancanza di specificità, che può essere valutata utilizzando una versione mutata della proteina bersaglio, e non sono disponibili commercialmente per tutte le proteine. L'etichettaturaATP in vitro[32 P] è un metodo molto robusto, consolidato e altamente sensibile15. Possono essere utilizzate proteine immunoprecipitate o ricombinanti e possono essere testati diversi substrati. Gli effetti delle droghe possono anche essere valutati in quanto questo metodo è quantitativo. Il suo principale inconveniente è che la radioattività associata all'approccio richiede una gestione con cautela. Sono possibili anche metodi alternativi basati sulla misurazione dei substrati peptidi fluorescenti o luminescenti e sfruttando le proprietà fluorescenti/luminescenti alterate al fosforo. Tali metodi consentono anche un'elevata produttività, che è necessaria, ad esempio, nello screening di molecole che possono essere potenziali inibitori della chinasi bersaglio. Infatti, le chinasi rappresentano una delle più grandi classi di bersagli farmacologici perseguiti dalle aziende farmaceutiche16.
In questo studio, ci siamo concentrati sulla proteina LIMK2-1 (LIMK2-1 sta per Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). La proteina della chinasi LIMK2 è stata descritta per la prima volta nel 199517. Tre isoformi di LIMK2 sono prodotti da giunzioni alternative: LIMK2a, LIMK2b e LIMK2-1. Attualmente, LIMK2-1 è stato descritto solo a livello di mRNA in un singolo studio18. Qui, caratterizziamo questa potenziale nuova proteina della chinasi a livello molecolare usando approcci biochimici robusti. In primo luogo, dimostriamo che LIMK2-1 è effettivamente sintetizzato. Simile alle sue due controparti, LIMK2a e LIMK2b, interagisce con la chinasi a monte ROCK (chinasi proteica associata a Rho). Mostriamo che LIMK2-1 ha un'attività di chinasi sulle proteine di base mielina (MBP), ma non sulla cofilina, il substrato canonico delle chinasi LIM.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1978</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-c-Myc</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-21316</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3312/5175</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-GFP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-HA</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11687423001</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-phospho-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3313</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Anti-PP1i</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>designed for this study</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A-162B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PV3227</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>g[32P] ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG502A</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14280</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>111-541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P06-20166</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM4611</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie PageBlue Protein Staining Solution</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>24620</td>
			<td>for gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Protean</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZview Red anti-HA affinity gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6779</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneTolls software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-trap beads</td>
			<td>Chromtek</td>
			<td></td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405</td>
			<td>for transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-cofilin</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>12-556</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>710</td>
			<td>to remove carefully supernatant from beads without aspirating them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant TL software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>for radioactivity acquisition and quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIMK2 siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>s8191</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SP-04-2217</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBP</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>13-173</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1112</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-1504</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Okaidic acid</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>0-2220</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenylphosphate</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1026</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobillon-P</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPVH00010 pore size 0,45 mm</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating wheel</td>
			<td>Labinco</td>
			<td></td>
			<td>for bead incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe lock eppendorf</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120.086</td>
			<td>for kinase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td>for Laemmli and migration buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>S8507</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71501</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal West Dura</td>
			<td>Protein Biology</td>
			<td>34075</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene Pxi</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue extracts 
			 
			&#160;</td>
			<td>Biochain 
			 
			&#160;</td>
			<td>P1234035 Brain 
			P12345152 Lung 
			P1234149 Liver 
			P1234188 Pancreas 
			P1234260 Testis</td>
			<td>for Western Blot analysis 
			 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Trans-Blot</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094 B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA9500</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>3030-672</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein

L'ampio sequenziamento dell'intero genoma ha identificato molti Open Reading Frame (ORF) che forniscono molte potenziali proteine. Queste proteine possono avere ruoli importanti per la cellula e possono svelare nuovi processi cellulari. Tra le proteine, le chinasi sono i principali attori in quanto appartengono ai percorsi di segnalazione cellulare e hanno la capacità di attivare o disattivare molti processi cruciali per il destino della cellula, come la crescita cellulare, la divisione, la differenziazione, la motilità e la morte.
In questo studio, ci siamo concentrati su una nuova potenziale proteina della chinasi, LIMK2-1. Abbiamo dimostrato la sua esistenza da Western Blot utilizzando un anticorpo specifico. Abbiamo valutato la sua interazione con una proteina a monte che regola utilizzando esperimenti di coimmunoprecipitazioni. La coimmunoprecipitazione è una tecnica molto potente in grado di rilevare l'interazione tra due proteine bersaglio. Può anche essere utilizzato per rilevare nuovi partner di una proteina esca. La proteina esca può essere purificata tramite un tag progettato alla sua sequenza o tramite un anticorpo che la ridestina specificamente. Questi complessi proteici possono quindi essere separati da SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) e identificati utilizzando la spettrometria di massa. Immunoprecipitato LIMK2-1 è stato utilizzato anche per testare la sua attività di chinasi in vitro da z[32P] ETICHETTAtura ATP. Questo saggio ben consolidato può utilizzare molti substrati diversi, e versioni mutate dell'esca possono essere utilizzate per valutare il ruolo di residui specifici. Gli effetti degli agenti farmacologici possono anche essere valutati poiché questa tecnica è sia altamente sensibile che quantitativa. Ciò nonostante, la manipolazione della radioattività richiede particolare cautela. L'attività della chinasi può anche essere valutata con anticorpi specifici che prendono di mira il gruppo di fosforo dell'amminoacido modificato. Questi tipi di anticorpi non sono disponibili in commercio per tutti i residui modificati al fosforo.

LA proteina LIMK2-1 è sintetizzata LIMK2-1 è menzionato nelle banche dati, ma finora solo un documento ha dimostrato l'esistenza del suo mRNA18. Rispetto ai suoi due omologhi, LIMK2a e LIMK2b, LIMK2-1 ha un dominio aggiuntivo di terminale C identificato come dominio inibitorio della proteina fosfogio 1 (PP1i). Abbiamo progettato un anticorpo che si rivolge a un peptide di questo dominio, aminoacidi 671-684 (Figura 1A</stro...

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Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Abbiamo caratterizzato una nuova proteina della chinasi utilizzando robusti approcci biochimici: analisi Western Blot con un anticorpo specifico dedicato su diverse linee cellulari e tessuti, interazioni con esperimenti di coimmunoprecipitazioni, attività della chinasi rilevata da Western Blot utilizzando un anticorpo specifico per ilfosforo e con l'etichettatura ATP di z[32 P].

Caratterizzazione a livello molecolare utilizzando robusti approcci biochimici di una nuova proteina Kinase

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

L'immunoprecipitazione è una tecnica molto potente per isolare e purificare una proteina bersaglio. In condizioni lisce, proteine, regolatori o substrati possono essere co-immunoprecipitati. È quindi possibile scoprire una nuova rete di interazione.Può anche essere valutata l'attività della proteina immunoprecipitata. In particolare, l'attività di una chinasi può essere testata su diversi substrati mediante etichettatura P32-ATP. Tuttavia, può essere valutata l'attività degli inibitori che prendono di mira una chinasi coinvolta in una malattia.Possono costituire composti di piombo per sviluppare nuovi farmaci. Questo metodo può essere esteso dai mammiferi al lievito o ai batteri. Questa tecnica non è così difficile.Ai punti chiave: assicurarsi di avere un controllo negativo per assicurarsi che l'interazione rilevata sia specifica e scegliere attentamente le condizioni di lysis per mantenere interazioni e attività. Piccoli dettagli e gesti sono importanti per garantire il successo di questa tecnica e non sono mai descritti nei materiali e nei metodi degli articoli. A dimostrare la procedura sarà Fabienne Godin, tecnico del nostro laboratorio.Dopo che le cellule sono state preparate nella stanza di coltura cellulare all'interno dell'armadio di biosicurezza, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per rimuovere il supporto dalle piastre e scartarlo in una bottiglia di rifiuti dedicata con candeggina. Quindi, aggiungere 10 millilitri di DMEM fresco integrato e rimettere le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Per preparare la miscela di trasfezione, in un tubo da 15 millilitri, aggiungere 450 microlitri di soluzione di cloridrato di Tris 10 millimolare a pH 7,5, integrato con un EDTA millimolare e 50 microlitri di soluzione di cloruro di calcio molare da 2,5.Mescolare per inversione. Nel tubo, aggiungere un volume corrispondente a 10 microgrammi di DNA plasmatico, amplificato da un kit midiprep di DNA e diluito con il tampone di eluizione di questo kit, e la cui concentrazione è stata determinata. Invertire il tubo per mescolare.Quindi, con agitazione liscia su un miscelatore a vortice, aggiungere lentamente 500 microlitri di concentrato 2X salino tamponato BES, goccia a goccia nel tubo. Spostalo con molta attenzione, per non disturbare la complessa formazione tra DNA e fosfato di calcio. Incubare per almeno 15 minuti, o fino a 45 minuti, a temperatura ambiente.Ora, trasferire la piastra per trasfettare dall'incubatore all'armadio di sicurezza. Aggiungere i complessi di DNA preparati cadere a goccia sulle cellule su tutta la superficie della piastra. Incubare per 24-72 ore nell'incubatore a 37 gradi Celsius.Per prevenire la degradazione delle proteine, preparare il tampone di lisi sul ghiaccio, prendendo in considerazione quattro millilitri di tampone di lisi per ogni piastra trasfettata. Prendi il piatto con le cellule trasfette dall'incubatrice. Rimuovere il supporto e scartarlo in una bottiglia di rifiuti di candeggina dedicata.Per lavare le cellule, aggiungere tre millilitri di PBS freddo sul lato della piastra goccia a goccia, per evitare di staccare le cellule trasfette. E ruotare delicatamente la piastra per stendere il tampone su tutta la superficie. Inclinare la piastra per rimuovere il PBS e scartarlo nella bottiglia di scarto.Ripetere ancora una volta il lavaggio. Metti il piatto sul ghiaccio. Alla fine, rimuovere con cura il resto del PBS.Successivamente, aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi fredda alle cellule lavate trasfette. Stenderlo su tutta la superficie del piatto. Incubare per 10 minuti sul ghiaccio.Di tanto in tanto, stendere nuovamente il buffer su tutta la superficie della piastra. Successivamente, utilizzare una spatola cellulare per raschiare le cellule dalla superficie e raccoglierle in un tubo di microcentrifugo. Centrifuga per 10 minuti a 10.000 volte G e quattro gradi Celsius.Raccogliere il lisciviato supernatante in un nuovo tubo di microcentrifugo e raccogliere un'aliquota di 50 microliter di questa frazione in un altro nuovo tubo di microcentrifugo. Questa aliquota sarà utilizzata per verificare se le proteine trasfette sono ben espresse. Scartare il pellet nella spazzatura.In primo luogo, rimorsi delicatamente la soluzione stock di perline di agarosio accoppiata con l'anticorpo appropriato. Tagliare l'estremità di una punta da 200 microlitri per fare un'apertura da uno a due millimetri. Attaccare la punta a una micropipetta e disegnare 40 microlitri della soluzione, consentendo alle perline di entrare nella punta.Pipettare le perline su e giù più volte per saturare la punta per garantire il corretto volume di perline e trasferire le perline in un tubo di microcentrifugo. Aggiungere 500 microlitri di tampone TNET, mescolare per inversione e centrifugare per due minuti a 1.000 volte G e quattro gradi Celsius. Rimuovere con cura il supernatante e aggiungere 500 microlitri di tampone TNET.Incubare su una ruota rotante per almeno un'ora a quattro gradi Celsius. Quindi, centrifugare il tubo per due minuti a 1.000 volte G e quattro gradi Celsius e lavare le perline due volte con 500 microlitri di tampone di lisi invertendo e centrifugando. Dopo il lavaggio, trasferire il lisato di frazione totale precedentemente raccolto nel tubo e incubare su una ruota rotante a quattro gradi Celsius per due o quattro ore.Ora, centrifuga il tubo contenente le perline immunoprecipitate per due minuti a 1.000 volte G e quattro gradi Celsius. Lavare le perline cinque volte con 500 microlitri di tampone di lysis invertendo e centrifugando. Quando si lavano le perline, fare attenzione a non andare troppo vicino dalle perline mentre si rimuove il supernatante.Altrimenti, le perline saranno aspirate e alla fine dell'esperimento non saranno più lasciate perline. Per l'eluizione, prima centrifuga per due minuti a 1.000 volte G e quattro gradi Celsius. Utilizzare una micropipetta millilitro per rimuovere con cura il supernatante.Quindi, con una siringa Hamilton dotata di ago cementato, rimuovere le ultime gocce del supernatante per evitare l'aspirazione delle perline. Aggiungere quindi 40 microlitri di tampone Laemmli 4X. Omogeneizzare toccando delicatamente il tubo.Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, centrifugare per cinque minuti a 10.000 volte G e temperatura ambiente. Con una siringa Hamilton, trasferire l'eluato supernatante in un nuovo tubo di microcentrifugo.Conservare a meno 80 gradi Celsius. Le cellule HEK-293 sono state trasfette con LIMK 2-1 senza tag o una delle isoforme taggate HA di LIMK 2. LIMK 2-1 è ben espresso nelle diverse condizioni.L'anticorpo Anti LIMK 2-1 non riconosce le isoforme LIMK 2a e LIMK 2b, ed è specifico, poiché il suo segnale diminuisce quando le cellule vengono trasfette con un piccolo RNA interferente LIMK2, rispetto al controllo di piccoli RNA interferenti. In varie linee cellulari umane, LIMK 2-1 sembrava essere espresso in HEK-293 e HeLa, ma non in C6. Esperimenti di coimmunoprecipitazione sono stati utilizzati per valutare l'interazione di LIMK2-1 con la chinasi a monte ROCK. Ognuna delle diverse proteine codificate dai vettori trasfettati era ben espressa.Le tre isoforme di LIMK2, così come la larp6, sono state immunoprecipitate in modo efficiente. Negli eluati, ROCK è stato rilevato e quindi coimmunoprecipitato con le tre isoforme di LIMK2, ma non con larp6. L'interazione rilevata è quindi specifica.Coimmunoprecipitated LIMK 2-1 è stato testato per la sua attività chinasi tramite l'etichettatura gamma P32 ATP. LIMK 2-1 non fosforilato cofilina, mentre faceva fosforilato mielina proteina di base, o MBP. LIMK 2-1 è efficacemente immunoprecipitato in questo test.È fondamentale avere un controllo negativo durante l'esecuzione dell'immunoprecipitazione per essere sicuri che l'interazione sia specifica. La composizione di un tampone dilisi deve essere accuratamente impostata per preservare l'interazione e l'attività. Al momento dell'immunoprecipitazione, l'attività della chinasi può essere valutata per contare diversi substrati.La mutazione può essere facilmente introdotta e può dipanare il ruolo di residui specifici. Possono anche essere eseguiti studi funzionali per comprendere il ruolo fisiologico delle nuove interazioni evidenziate. Le cellule devono essere coltivate in una stanza di coltura dedicata all'interno di un armadietto di biosicurezza.P32 ATP deve essere gestito con particolare cautela. Scudo per proteggere dalle radiazioni, contatore Geiger, raccolta di rifiuti specifici, badge personali per seno e dita per rilevare l'esposizione radioattiva e le punte dei filtri.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Ricerca

Biochimica

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