Name: characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein
Uploaded: 2019-06-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein at JoVE.com

この研究は、ラ・リーグ・コントル・ル・ガン、ラ・アソシエーション・ニューロフィブロマトース、レックリングハウゼン、ラ・レジオン・センター・ヴァル・ド・ロワールによって支援されました。フローサイトメトリーデータのためのオーレリー・コッソンとデボラ・カサス、そして原稿の徹底的な校正のためのキーロン・ヒックマン・ルイスに感謝します。

1. トランスフェクションのための細胞製剤
注意:細胞培養のすべてのステップは、専用の実験室で行う必要があり、細胞はクラス2の微生物学的キャビネット内で操作されます。
<ol><li>種子HEK-293(ヒト胚性腎臓)細胞を10mLのDMEM(ダルベッコの改変イーグルス培地)で10cmプレートに入れ、10%の胎児子牛血清を補充した。5%CO2の下で3〜5日間培養し、37°Cで、細胞が約90%の...

<ol>
	<li>Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+protein+kinase+signaling+from+yeast+to+man.">Evolution of protein kinase signaling from yeast to man.</a> Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).</li><li>Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution,+dynamics+and+dysregulation+of+kinase+signalling.">Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling.</a> Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).</li><li>Bhullar, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase-targeted+cancer+therapies:+progress,+challenges+and+future+directions.">Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions.</a> Molecular Cancer. 17, 48 (2018).</li><li>Kaboord, B., Perr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+proteins+and+protein+complexes+by+immunoprecipitation.">Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.</a> Methods in Molecular Biology. 424, 349-364 (2008).</li><li>Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+strategies+for+the+use+of+affinity+tags+and+tag+removal+for+the+purification+of+recombinant+proteins.">Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins.</a> Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).</li><li>Wood, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+trends+and+affinity+tag+designs+for+recombinant+protein+purification.">New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).</li><li>Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+and+purification:+a+comprehensive+review+of+affinity+tags+and+microbial+applications.">Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications.</a> Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).</li><li>Greenwood, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins.">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li><li>Wang, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Dynamic+and+Heterogeneous+Proteasome+Complexes+Using+In+vivo+Cross-Linking-Assisted+Affinity+Purification+and+Mass+Spectrometry.">Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1844, 401-410 (2018).</li><li>Raykova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+There+Be+Light!.">Let There Be Light!.</a> Proteomes. 4, (2016).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).</li><li>Podobnik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+Study+Protein-protein+Interactions.">How to Study Protein-protein Interactions.</a> Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).</li><li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection:+methods+and+analysis.">Protein-protein interaction detection: methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).</li><li>Peck, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+phosphorylation:+methods+and+strategies+for+studying+kinases+and+substrates.">Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).</li><li>Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+in+vitro+kinase+assay+technologies:+the+quest+for+a+universal+format.">Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format.</a> Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).</li><li>Okano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+family+of+serine/threonine+kinases+containing+two+N-terminal+LIM+motifs.">Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).</li><li>Croft, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-mediated+transcriptional+regulation+and+activation+of+the+actin+cytoskeleton.">p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton.</a> Cell Research. 21, 666-682 (2011).</li><li>Tastet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1+is+a+Hominidae-Specific+Isoform+of+LIMK2+Expressed+in+Central+Nervous+System+and+Associated+with+Intellectual+Disability.">LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability.</a> Neuroscience. 399, 199-210 (2019).</li><li>Vallee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1,+a+new+isoform+of+human+LIMK2,+regulates+actin+cytoskeleton+remodeling+via+a+different+signaling+pathway+than+that+of+its+two+homologs,+LIMK2a+and+LIMK2b.">LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b.</a> The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).</li><li>Lee, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detergents+on+Membrane+Protein+Complex+Isolation.">Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation.</a> Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).</li></ol>

本明細物では、我々は、その配列およびそのホモログ、LIMK2aおよびLIMK2b20に基づいてキナーゼであると考えられる新しいタンパク質LIMK2-1を分子レベルで特徴付けるために堅牢な生化学的ツールを使用した。
まず、特定の抗体を用いたウエスタンブロット分析を用いてタンパク質レベルでLIMK2-1の存在を実証した。その後、LIMK2aとLIMK2bを調節することが知?...

何十年もの間、多数のシグナル伝達経路が解明され、細胞分裂、分化、運動性、プログラムされた細胞死、免疫および神経生物学などの重要な細胞プロセスへの関与が示されている。キナーゼは、多くの場合、活性化または不活性化を細かく調節し、外部刺激1、2、3に応答する一過性汎用性の高い複合体の一部であるとして、これらのシグナル伝達経路において重要な役割を果たす。キナーゼの突然変異および調節不変は、しばしばヒトの疾患を引き起こすため、過去40年間で最も重要な薬物標的の一つとなっている4.
この文脈では、上流のレギュレータや下流の基板とのキナーゼ相互作用を検出し、新しいパートナーを特定できることが重要です。アフィニティ精製および免疫沈殿は、タンパク質複合体5の単離のための非常に強力な技術である。餌タンパク質またはキナーゼは、ペプチドを標的とする抗体と共有結合した市販ビーズの使用を可能にする特定のペプチド配列でタグ付けされてもよい。この材料は実験6、7、8の高い再現性を可能にする。内因性タンパク質は、餌タンパク質を直接標的とする抗体を用いて免疫沈殿することもできる。抗体は、タンパク質Aまたはタンパク質Gアガロースビーズに架橋されるか、または単にリサートを添加する前にこれらのビーズでインキュベートされてもよい。溶解バッファーは、相互作用を失うことなくタンパク質可溶化を可能にし、タンパク質の劣化を避けるために最適化する必要があります。このアプローチの主な欠点は、相互作用が細胞リシス時に検出されるということです。したがって、一時的または弱い相互作用は、細胞内のコンテキストを必要とする相互作用と共に見逃される可能性があります。その他の技術は、近接リゲーションアッセイ(PLA)9、生体内架橋支援親和性精製(XAP)10、生物発光共鳴エネルギー伝達(BRET)またはフェルスター共鳴エネルギーなどの細胞で直接働くために使用することができる。転送 (FRET)11,12.さらに、免疫沈殿は、表面プラズモン共鳴、イソテル微量カロリーム、マイクロスケール熱泳動などの物理的な技術が必要とされる結合の熱力学的定数を決定することは適切ではありません。13、14.
キナーゼ活性は、複数の技術を用いて評価されてもよい。本明細損では、ホスホ特異的抗体およびインビトロγ[32P]ATP(アデノシン三リン酸)標識に焦点を当てた。リン特異的抗体は、タンパク質内の特定の残留物のリン酸修飾を標的とする。それらは、細胞リシス後のウェスタンブロットまたはELISA(酵素結合免疫ソルベントアッセイ)、免疫組織化学、およびフローサイトメトリーまたは免疫蛍光を用いた無傷の細胞に使用することができる。彼らの欠点は、標的タンパク質の変異バージョンを使用して評価することができ、特異性の欠如を含むことができ、およびそれらのすべてのタンパク質に市販されていない。インビトロγ[32P]ATP標識は、非常に堅牢で、確立された、高感度な方法15である。免疫沈殿タンパク質または組換えタンパク質を使用して、異なる基質を試験してもよい。薬物の効果は、この方法が定量的であるとしても評価されてもよい。その主な欠点は、アプローチに関連する放射能は慎重に処理する必要がある点です。蛍光または発光ペプチド基質の測定に基づいて、リン酸化時に変化した蛍光/発光特性を利用する代替方法も可能です。このような方法はまた、高いスループットを可能にし、これは、例えば、標的キナーゼの潜在的な阻害剤でありうって可能な分子のスクリーニングにおいて必要とされる。実際、キナーゼは製薬会社16が追求する最大級の薬剤標的の1つである。
本研究では、LIMK2-1タンパク質(LIMK2-1はLin11、アイル1、Mec3キナーゼアイソフォーム2-1を表す)に着目した。LIMK2キナーゼタンパク質は、1995年17月に最初に記載された。LIMK2の3つのアイソフォームは、LIMK2a、LIMK2bおよびLIMK2-1の代替スプライシングによって生成される。現時点では、LIMK2-1は単一の研究18においてmRNAレベルでのみ記載されている。本明細物では、堅牢な生化学的アプローチを用いて、この潜在的な新しいキナーゼタンパク質を分子レベルで特徴付ける。まず、LIMK2-1が実際に合成されたことを示す。LIMK2aおよびLIMK2bの2つの対応するのと同様に、上流のキナーゼROCK(Rho関連タンパク質キナーゼ)と相互作用する。LIMK2-1はミエリン基本タンパク質(MBP)にキナーゼ活性を有するが、LIMキナーゼの正規基質であるコフィリンには活性を示す。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1978</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-c-Myc</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-21316</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3312/5175</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-GFP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-HA</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11687423001</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-phospho-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3313</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Anti-PP1i</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>designed for this study</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A-162B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PV3227</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>g[32P] ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG502A</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14280</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>111-541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P06-20166</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM4611</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie PageBlue Protein Staining Solution</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>24620</td>
			<td>for gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Protean</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZview Red anti-HA affinity gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6779</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneTolls software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-trap beads</td>
			<td>Chromtek</td>
			<td></td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405</td>
			<td>for transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-cofilin</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>12-556</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>710</td>
			<td>to remove carefully supernatant from beads without aspirating them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant TL software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>for radioactivity acquisition and quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIMK2 siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>s8191</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SP-04-2217</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBP</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>13-173</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1112</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-1504</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Okaidic acid</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>0-2220</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenylphosphate</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1026</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobillon-P</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPVH00010 pore size 0,45 mm</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating wheel</td>
			<td>Labinco</td>
			<td></td>
			<td>for bead incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe lock eppendorf</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120.086</td>
			<td>for kinase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td>for Laemmli and migration buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>S8507</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71501</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal West Dura</td>
			<td>Protein Biology</td>
			<td>34075</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene Pxi</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue extracts 
			 
			&#160;</td>
			<td>Biochain 
			 
			&#160;</td>
			<td>P1234035 Brain 
			P12345152 Lung 
			P1234149 Liver 
			P1234188 Pancreas 
			P1234260 Testis</td>
			<td>for Western Blot analysis 
			 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Trans-Blot</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094 B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA9500</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>3030-672</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein

広範な全ゲノムシーケンシングは、多くの潜在的なタンパク質を提供する多くのオープンリーディングフレーム(ORF)を同定しました。これらのタンパク質は、細胞に重要な役割を持ち、新しい細胞プロセスを解明する可能性があります。タンパク質の中でも、キナーゼは細胞シグナル伝達経路に属し、細胞の成長、分裂、分化、運動性、死など、細胞の運命に不可欠な多くのプロセスをオンまたはオフにする能力を持つ主要なアクターです。
本研究では、新しい潜在的なキナーゼタンパク質LIMK2-1に着目した。我々は、特定の抗体を用いてウェスタンブロットがその存在を実証した。我々は、共免疫沈殿実験を用いて上流調節タンパク質との相互作用を評価した。共免疫沈殿は、2つの標的タンパク質間の相互作用を検出できる非常に強力な技術です。また、餌タンパク質の新しいパートナーを検出するために使用されてもよいです。餌タンパク質は、その配列に対して設計されたタグを介して、またはそれを特異的に標的とする抗体を介して精製されてもよい。これらのタンパク質複合体は、SDS-PAGE(ナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル)によって分離され、質量分析法を用いて同定され得る。免疫沈殿LIMK2-1はまた、γ[32P]ATP標識によってインビトロでのキナーゼ活性を試験するためにも使用された。この確立されたアッセイは、多くの異なる基板を使用し、また、餌の変異バージョンを使用して、特定の残基の役割を評価するために使用され得る。薬理学的薬剤の効果は、この技術は、非常に敏感かつ定量的であるため、評価されることもできます。それにもかかわらず、放射能処理には特に注意が必要です。キナーゼ活性はまた、修飾アミノ酸のリン群を標的とする特異的抗体で評価されてもよい。これらの種類の抗体は、すべてのリン修飾残渣について市販されているわけではない。

LIMK2-1タンパク質を合成 LIMK2-1はデータバンクで言及されているが、これまでのところ、そのmRNA18の存在を示した論文は1つしかない。LIMK2aおよびLIMK2bの2つのホモログと比較して、LIMK2-1はタンパク質ホスファターゼ1阻害ドメイン(PP1i)として同定された余分なC末端ドメインを有する。このドメインのペプチドを標的とする抗体を設計し、...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein at JoVE.com

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

我々は、堅牢な生化学的アプローチを用いた新しいキナーゼタンパク質を特徴付けた:異なる細胞株および組織上の専用の特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析、共免疫沈殿実験による相互作用、西洋で検出されたキナーゼ活性ホスホ特異的抗体およびγ[32P]ATP標識を用いたブロット。

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

免疫沈降は、標的タンパク質を単離して精製する非常に強力な技術です。平滑な条件では、タンパク質、調節剤、または基質が共免疫沈降され得る。その後、新しいインタラクションネットワークが検出される可能性があります。免疫沈降タンパク質の活性も評価され得る。特に、キナーゼの活性は、P32-ATP標識によって異なる基質上で試験され得る。それにもかかわらず、疾患に関与するキナーゼを標的とする阻害剤の活性は評価され得る。彼らは新薬を開発する鉛化合物を構成する可能性があります。.この方法は、哺乳類から酵母または細菌に拡張することができます。このテクニックは難しいものではありません。キーポイントへ:検出された相互作用が特異的であることを確認するために否定的なコントロールを持っていることを確認し、相互作用と活動を維持するために慎重にlysis条件を選択します。このテクニックの成功を確実にするためには、細部やジェスチャーが重要であり、記事の資料や方法では決して記述されていない。手順を実証することは、私たちの研究室の技術者であるファビエンヌ・ゴディンです。細胞がバイオセーフティキャビネット内の細胞培養室で調製された後、10ミリリットルのピペットを使用してプレートから培地を取り出し、漂白剤付きの専用の廃棄物ボトルに捨てます。その後、新鮮な補充DMEMの10ミリリットルを追加し、37°Cでインキュベーターに戻します。トランスフェクション混合物を調製するために、15ミリリットルチューブに、pH 7.5で10ミリモルトリス塩酸塩溶液の450マイクロリットルを加え、1ミリモルEDTAと2.5モル塩化カルシウム溶液の50マイクロリットルを補った。反転によって混ぜる。チューブに、10マイクログラムの血漿DNAに相当する体積を加え、DNAミディプレップキットで増幅し、このキットの溶出バッファーで希釈し、その濃度が決定された。チューブを反転して混ぜます。次に、ボルテックスミキサーでの滑らかな撹拌で、500マイクロリットルのBES緩衝生理食塩水2X濃縮物をゆっくりと加え、チューブに滴下する。DNAとリン酸カルシウムの間の複雑な形成を妨げないように、非常に慎重に移動します。室温で少なくとも15分間、または最大45分間インキュベートする。次に、プレートをインキュベーターから安全キャビネットにトランスフェクトに移します。調製したDNA複合体をプレートの表面全体の細胞に滴下して追加します。37°Cでインキュベーターで24〜72時間インキュベート。タンパク質の分解を防ぐために、各トランスフェクトプレートに4ミリリットルのリシスバッファーを考慮して、氷上のリシスバッファーを調製します。インキュベーターからトランスフェクションされた細胞でプレートを取ります.メディアを取り出し、専用の漂白剤廃棄物ボトルに捨てます。細胞を洗浄するには、プレートの側面に3ミリリットルの冷たいPBSを滴下して添加し、トランスフェクトされた細胞を剥離することを避ける。そして、緩衝液を表面全体に広げるためにプレートをそっと旋回させます。プレートを傾けてPBSを取り除き、廃棄物ボトルに捨てます。もう一度洗い方を繰り返します。プレートを氷の上に置きます。最後に、PBS の残りの部分を慎重に削除します。次に、500マイクロリットルの冷たいライシスバッファーを、トランスフェクトされた洗浄された細胞に加える。プレートの表面全体に広げます。氷の上で10分間インキュベートします。時々、再びプレートの表面全体にバッファーを広げます。その後、セルスパチュラを使用して細胞を表面から削り取り、マイクロ遠心チューブに集めます。10,000倍Gと摂氏4度で10分間遠心分離機。上清のライセートを新しいマイクロ遠心チューブに集め、この分画の50マイクロリットルのアリコートを別の新しいマイクロ遠心管に集めます。このアリコートは、トランスフェクトされたタンパク質が十分に発現しているかどうかを確認するために使用されます。ゴミ箱にペレットを捨てます。まず、アガロースビーズのストック溶液を適切な抗体と結合して緩やかに再懸濁する。200マイクロリットルの先端を切って1~2ミリメートルの開口部を作ります。チップをマイクロピペットに取り付け、溶液を40マイクロリットルに引き出し、ビーズが先端に入るようにします。ビーズを数回上下にピペットして、チップを飽和させ、ビーズの正しい量を確保し、ビーズをマイクロ遠心チューブに移します。TNETバッファーの500マイクロリットルを追加し、反転によって混合し、遠心分離機は1,000倍Gと摂氏4度で2分間。上清を慎重に取り出し、500マイクロリットルのTNETバッファーを追加します。回転ホイールで摂氏4度で少なくとも1時間インキュベートします。その後、チューブを1,000倍Gと摂氏4度で2分間遠心し、反転と遠心分離により500マイクロリットルのリシスバッファーでビーズを2回洗浄します。洗浄後、以前に採取した総分率のライセートをチューブに移し、摂氏4度の回転ホイールで2〜4時間インキュベートします。さて、免疫沈降ビーズを含むチューブを1,000倍Gおよび摂氏4度で2分間遠心分離する。ビーズを500マイクロリットルのリシスバッファーで5回洗浄し、反転と遠心分離を行います。ビーズを洗うときは、上清を取り除きながらビーズから近づきすぎないように注意してください。さもなければ、ビーズは吸引され、実験の終わりにビーズはもう残らない。溶出のために、最初の遠心分離機は1,000倍Gと摂氏4度で2分間。上清を慎重に取り除くために1ミリリットルのマイクロピペットを使用してください。その後、セメント針を装備したハミルトン注射器で、ビーズの吸引を避けるために上清の最後の滴を取り除きます。次に、4Xレムリバッファーの40マイクロリットルを加えます。管を軽く叩いて均質化します。室温で5分間インキュベートします。その後、遠心分離機をGの10,000倍と室温で5分間行う。ハミルトンシリンジで、上清溶出物を新しいマイクロ遠心チューブに移します。マイナス80度で保管してください。HEK-293細胞は、タグなしLIMK 2-1またはLIMK 2のHAタグ付きアイソフォームの1つをトランスフェクトした。LIMK 2-1は、異なる条件でよく表現されます。抗LIMK 2-1抗体は、LIMK 2aおよびLIMK 2bアイソフォームを認識せず、細胞がLIMK2にトランスフェクトされるとシグナルが減少し、小さな干渉RNAを制御するのと比較して特異的である。様々なヒト細胞株において、LIMK 2-1はHEK-293およびHeLaで発現しているように見えたが、C6では発現していない。LIMK2-1と上流キナーゼROCKとの相互作用を評価するために、コイムノ沈降実験を用いた。トランスフェクトされたベクターによってコードされる異なるタンパク質のそれぞれは、よく発現していた。LIMK2の3つのアイソフォームは、larp6と同様に、効率的に免疫沈降した。溶出物では、ROCKが検出され、LIMK2の3つのアイソフォームで共免疫沈降したが、larp6では検出されなかった。検出された相互作用は、特定の操作です。コイムノ沈降LIMK 2-1は、ガンマP32 ATP標識を介してキナーゼ活性について試験した。LIMK 2-1はコフィリンをリン酸化しなかったのに対し、ミエリン塩基性タンパク質、またはMBPをリン酸化した。LIMK 2-1は、この試験で効率よく免疫沈降します。免疫沈降を行いながら陰性制御を行い、相互作用が特異的であることを確認することが重要です。ライシスバッファーの組成は、相互作用と活動を維持するために慎重に設定する必要があります。免疫沈降の際、キナーゼ活性は異なる基質をカウントするように評価され得る。突然変異は容易に導入され、特定の残基の役割を解明し得る。機能研究はまた、新たに強調された相互作用の生理学的役割を理解するために行われてもよい。細胞は、バイオセーフティキャビネット内の専用培養室で培養する必要があります。P32 ATP は、特定の注意を払って処理する必要があります。放射線から保護するためのシールド、ガイガーカウンター、特定の廃棄物の収集、個人の胸と指のバッジは、放射能暴露とフィルターの先端を検出します。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Rab10リン酸化を評価してパーキンソン病関連LRRK2キナーゼ経路を尋問するためのヒト末梢血好中球分離

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

タンパク質レベルの組織や標準化された定量ウェスタンブロットによる開発全体の堅牢な比較

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Rhoキナーゼ活性の一過性阻害によるヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞の増着増強

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...