Name: characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein
Uploaded: 2019-06-30T14:00:00
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이 작품은 라 리그 콘트레 르 암, l'협회 신경 섬유종 에 레클링하우젠, 라 레지온 센터 발 드 루아르에 의해 지원되었다. 유세포 측정 데이터에 대한 오렐리 코슨과 데보라 카사스, 그리고 원고의 철저한 교정을 위해 키론 히크먼-루이스에게 많은 감사를 드립니다.

1. 형질 혈하기위한 세포 준비
주의: 세포 배양의 모든 단계는 전용 실험실에서 수행되어야 하며, 세포는 Class 2 미생물 캐비닛 내에서 조작됩니다.
<ol><li>DMEM 의 10 mL (덜베코의 수정 된 독수리 매체)에서 Ø 10cm 플레이트에서 10 % 태아 종아리 혈청을 보충 한 종자 HEK-293 (인간 배아 신장) 세포. 3~5일 동안 5%CO2미만에서, 37°C에서, 세포가 ~90% 합류에 도달할 때까지 배양한다...

<ol>
	<li>Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+protein+kinase+signaling+from+yeast+to+man.">Evolution of protein kinase signaling from yeast to man.</a> Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).</li><li>Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution,+dynamics+and+dysregulation+of+kinase+signalling.">Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling.</a> Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).</li><li>Bhullar, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase-targeted+cancer+therapies:+progress,+challenges+and+future+directions.">Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions.</a> Molecular Cancer. 17, 48 (2018).</li><li>Kaboord, B., Perr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+proteins+and+protein+complexes+by+immunoprecipitation.">Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.</a> Methods in Molecular Biology. 424, 349-364 (2008).</li><li>Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. 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S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection:+methods+and+analysis.">Protein-protein interaction detection: methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).</li><li>Peck, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+phosphorylation:+methods+and+strategies+for+studying+kinases+and+substrates.">Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).</li><li>Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+in+vitro+kinase+assay+technologies:+the+quest+for+a+universal+format.">Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format.</a> Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).</li><li>Okano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+family+of+serine/threonine+kinases+containing+two+N-terminal+LIM+motifs.">Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).</li><li>Croft, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-mediated+transcriptional+regulation+and+activation+of+the+actin+cytoskeleton.">p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton.</a> Cell Research. 21, 666-682 (2011).</li><li>Tastet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1+is+a+Hominidae-Specific+Isoform+of+LIMK2+Expressed+in+Central+Nervous+System+and+Associated+with+Intellectual+Disability.">LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability.</a> Neuroscience. 399, 199-210 (2019).</li><li>Vallee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1,+a+new+isoform+of+human+LIMK2,+regulates+actin+cytoskeleton+remodeling+via+a+different+signaling+pathway+than+that+of+its+two+homologs,+LIMK2a+and+LIMK2b.">LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b.</a> The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).</li><li>Lee, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detergents+on+Membrane+Protein+Complex+Isolation.">Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation.</a> Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).</li></ol>

본 명세서에서, 우리는 분자 수준에서 새로운 단백질, LIMK2-1을 특성화하기 위해 강력한 생화학 적 도구를 사용하였으며, 그 서열및 그 상동체, LIMK2a 및 LIMK2b20에기초하여 키나아제인 것으로 여겨진다.
첫째, 우리는 특정 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 단백질 수준에서 LIMK2-1의 존재를 입증했습니다. 그 후 LIMK2a와 LIMK2b, LIMK2-1의 상동체를 조절하?...

수십 년 동안, 수많은 신호 경로 해명 되었습니다 및 세포 분열 등 중요 한 세포 프로세스에 그들의 참여, 분화, 운동성, 프로그램된 세포 죽음, 면역 및 신경 생물학, 표시 되었습니다. 키나아제는 종종 그들의 활성화 또는 불활성화를 미세하게 조절하고 외부 자극1,2,3에반응하는 일시적인 다목적 복합체의 일부이기 때문에 이러한 신호 경로에서 중요한 역할을 한다. 키나아제의 돌연변이 및 dysregulation는 수시로 인간에 있는 질병으로 이끌어 내고, 그러므로 과거40 년 4.
이러한 맥락에서, 그들의 업스트림 레귤레이터 또는 다운스트림 기판과의 키나제 상호 작용을 감지하고 새로운 파트너를 식별할 수 있어야 합니다. 친화성 정제 및 면역 침전은 단백질 복합체의 분리를위한 매우 강력한 기술5. 상기 미끼 단백질 또는 키나아제는 펩티드를 표적화하는 항체와 공유하여 상업적인 비드의 사용을 허용하는 특이적 펩티드 서열로 태그화될 수 있다. 이 물질은 실험 6,7,8에서높은 재현성을 허용한다. 내인성 단백질은 또한 미끼 단백질을 직접 표적화하는 항체를 사용하여 면역침전될 수 있다. 항체는 단백질 A 또는 단백질 G 아가로즈 비드에 가교또는 단순히 용해액을 추가하기 전에 이들 비드로 배양될 수 있다. 용해 완충제는 상호 작용을 잃지 않고 단백질 용해를 허용하고 단백질 분해를 피하기 위해 최적화되어야합니다. 이 접근의 중요한 결점은 상호 작용이 세포 lysis에 검출된다는 것입니다; 따라서, 과도 또는 약한 상호 작용, 세포 외 컨텍스트를 필요로 하는 그들과 함께 놓칠 수 있습니다. 다른 기술은 근접 결선 분석 (PLA) 9, 생체 간연결 보조 친화 정화 (XAP)10,생물 발광 공명 에너지 전송 (BRET) 또는 Förster 공명 에너지와 같은 세포에서 직접 작동하도록 사용될 수있다 전송 (FRET)11,12. 또한, 면역 침전은 표면 플라스몬 공명, 등온 적정 열량 열량 계열 계열 또는 마이크로 스케일 열열염과 같은 물리적 기술이 필요한 결합의 열역학 상수를 결정하는 데 적합하지 않습니다. 13,14.
키나아제 활성은 여러 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 본 명세서에서, 우리는 인광 특이적 항체 및시험관 내 γ[32 P] ATP(아데노신 트리포스페이트) 라벨링에 초점을 맞췄다. 인광 특이적 항체는 단백질 내의 특정 잔기의 인산염 변형을 표적으로 한다. 그(것)들은 세포 용해 후에 서쪽 Blot 또는 ELISA (효소 연결된 면역흡착 분석) 면역물분석, 및 유세포 측정 또는 면역 형광을 사용하여 온전한 세포에 사용될 수 있습니다. 그들의 단점은 표적 단백질의 돌연변이 버전을 사용하여 평가될 수 있는 특이성의 그들의 부족을 포함할 수 있고, 그들의 그들의 모든 단백질에 대해 상업적으로 이용가능하지 않다. 시험관내γ[32P] ATP 라벨링은 매우 견고하고, 잘 확립되고, 매우 민감한 방법15이다. 면역침전성 또는 재조합 단백질이 사용될 수 있고, 상이한 기질이 시험될 수 있다. 약물의 효과 또한이 방법은 정량으로 평가 될 수 있습니다. 주요 단점은 접근 방식과 관련된 방사능에 주의해서 처리해야 한다는 것입니다. 형광 또는 발광 펩타이드 기질의 측정과 인산화 시 변경된 형광/발광 특성을 활용하는 대체 방법도 가능합니다. 이러한 방법은 또한 표적 키나아제의 잠재적 억제제일 수 있는 분자의 스크리닝에서 요구되는 높은 처리량을 허용한다. 실제로, 키나제는 제약 회사가 추구하는 가장 큰 약물 표적 군수 중 하나를 나타냅니다16.
본 연구에서, 우리는 LIMK2-1 단백질에 초점을 맞췄다(LIMK2-1은 Lin11, Isle1, Mec3 키나아제 이소폼 2-1을 의미합니다). LIMK2 키나아제 단백질은 1995년17년에처음 기술되었다. LIMK2의 세 가지 이소폼은 LIMK2a, LIMK2b 및 LIMK2-1의 대체 접합에 의해 생성됩니다. 현재, LIMK2-1은 단일 연구18에서mRNA 수준에서만 기재되어 있다. 본 명세서에서, 우리는 강력한 생화학적 접근법을 사용하여 분자 수준에서 이러한 잠재적인 새로운 키나아제 단백질을 특성화한다. 첫째, 우리는 LIMK2-1이 실제로 합성된다는 것을 보여줍니다. 그것의 2개의 대응과 유사하게, LIMK2a 및 LIMK2b는, 상류 키나아제 ROCK (로-관련 단백질 키나아제)와 상호 작용한다. LIMK2-1은 미엘린 염단백질(MBP)에 키나아제 활성을 가지고 있지만, LIM 키나아제의 정식 기질인 코필린에는 적용되지 않는다는 것을 보여준다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1978</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-c-Myc</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-21316</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3312/5175</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-GFP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-HA</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11687423001</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-phospho-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3313</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Anti-PP1i</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>designed for this study</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A-162B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PV3227</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>g[32P] ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG502A</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14280</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>111-541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P06-20166</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM4611</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie PageBlue Protein Staining Solution</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>24620</td>
			<td>for gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Protean</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZview Red anti-HA affinity gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6779</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneTolls software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-trap beads</td>
			<td>Chromtek</td>
			<td></td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405</td>
			<td>for transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-cofilin</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>12-556</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>710</td>
			<td>to remove carefully supernatant from beads without aspirating them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant TL software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>for radioactivity acquisition and quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIMK2 siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>s8191</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SP-04-2217</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBP</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>13-173</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1112</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-1504</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Okaidic acid</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>0-2220</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenylphosphate</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1026</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobillon-P</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPVH00010 pore size 0,45 mm</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating wheel</td>
			<td>Labinco</td>
			<td></td>
			<td>for bead incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe lock eppendorf</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120.086</td>
			<td>for kinase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td>for Laemmli and migration buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>S8507</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71501</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal West Dura</td>
			<td>Protein Biology</td>
			<td>34075</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene Pxi</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue extracts 
			 
			&#160;</td>
			<td>Biochain 
			 
			&#160;</td>
			<td>P1234035 Brain 
			P12345152 Lung 
			P1234149 Liver 
			P1234188 Pancreas 
			P1234260 Testis</td>
			<td>for Western Blot analysis 
			 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Trans-Blot</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094 B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA9500</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>3030-672</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein

광범위한 전체 게놈 시퀀싱은 많은 잠재적 단백질을 제공하는 많은 오픈 판독 프레임(ORFs)을 확인했습니다. 이 단백질은 세포를 위한 중요한 역할을 할 수 있고 새로운 세포 프로세스를 해명할 수 있습니다. 단백질 중, 키나아제는 세포 신호 통로에 속하고 세포 성장, 분열, 분화, 운동성 및 죽음과 같은 세포의 운명에 중요한 많은 프로세스를 켜거나 끄는 능력을 가진 주요 배우입니다.
본 연구에서는 새로운 잠재적 키나아제 단백질LIMK2-1에 초점을 맞추게 되었습니다. 우리는 특정 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 그것의 존재를 입증했습니다. 우리는 coimmunocipation 실험을 사용하여 상류 조절 단백질과의 상호 작용을 평가했습니다. 동면역침전은 두 표적 단백질 간의 상호작용을 검출할 수 있는 매우 강력한 기술이다. 그것은 또한 미끼 단백질의 새로운 파트너를 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다. 미끼 단백질은 그것의 서열에 설계된 꼬리표를 통해서 또는 항체를 통해서 구체적으로 그것을 표적으로 하기 위하여 정제될 수 있습니다. 이들 단백질 복합체는 SDS-PAGE(나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔)에 의해 분리되고 질량 분석법을 사용하여 확인될 수 있다. 면역침전성 LIMK2-1은 또한γ[32P] ATP 라벨링에 의해 시험관내에서의 키나아제 활성을 시험하기 위해 사용되었다. 이러한 잘 확립된 분석기는 많은 상이한 기판을 사용할 수 있고, 미끼의 돌연변이 된 버전은 특정 잔기의 역할을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이 기술은 매우 민감하고 정량적이기 때문에 약리학적 제제의 효과도 평가될 수 있다. 그럼에도 불구하고 방사능 처리에는 특별한 주의가 필요합니다. 키나아제 활성은 또한 변형된 아미노산의 인포 군을 표적화하는 특이적 항체로 평가될 수 있다. 이러한 종류의 항체는 모든 인광 변형 잔기에서 시판되지 않는다.

LIMK2-1 단백질 합성 LIMK2-1은 데이터 뱅크에서 언급되지만, 지금까지 하나의 논문만이 mRNA18의존재를 보여주었다. LIMK2a 및 LIMK2b의 두 호몰로그와 비교하여, LIMK2-1은 단백질 포스파타제 1 억제 도메인(PP1i)으로 확인된 추가 C-말단 도메인을 가지고 있다. 우리는 이 도메인의 펩티드, 아미노산 671-684(도1A)를표적으로 하는 항...

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Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

우리는 강력한 생화확적인 접근을 사용하여 새로운 키나아제 단백질을 특징으로 했습니다: 다른 세포주 및 조직에 있는 전용적인 항체를 가진 서쪽 얼룩 분석, coimmunocipation 실험에 의하여 상호 작용, 서쪽에 의해 검출된 키나아제 활동 인광 특이적 항체를 사용하여 블롯[32 P] ATP 라벨링에 의해.

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

면역 강수량은 표적 단백질을 분리하고 정화하는 매우 강력한 기술입니다. 매끄러운 조건에서, 단백질, 레귤레이터, 또는 기판은 공동 면역 전염될 수 있다. 그런 다음 새 상호 작용 네트워크가 검색될 수 있습니다.면역 절전 단백질의 활성도 평가될 수 있다. 특히, 키나아제의 활성은 P32-ATP 라벨링에 의해 상이한 기판상에서 시험될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 질병에 관여하는 키나아제표적억제제의 활성을 평가할 수 있다.그(것)들은 새로운 약을 개발하기 위하여 지도 화합물을 구성할 수 있습니다. 이 방법은 포유동물에서 효모 또는 박테리아로 확장될 수 있다. 이 기술은 그렇게 어렵지 않습니다.핵심 점:감지된 상호작용이 특정한지 확인하기 위해 음의 제어를 하고, 상호 작용과 활동을 유지하기 위해 리시스 조건을 신중하게 선택하십시오. 작은 세부 사항과 제스처는이 기술의 성공을 보장하는 데 중요하며, 문서의 재료와 방법에 설명되지 않습니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 기술자 인 Fabienne Godin이 될 것입니다.세포가 생물 안전 캐비닛 내의 세포 배양실에서 제조된 후, 10밀리리터 파이펫을 사용하여 플레이트에서 미디어를 제거하고 표백제로 전용 폐병에 버려십시오. 그런 다음 10 밀리리터의 신선한 보충 DMEM을 추가하고 접시를 섭씨 37도에서 인큐베이터에 다시 넣습니다. 15 밀리리터 튜브에 트랜스펙트 혼합물을 준비하려면 pH 7.5에 10 밀리머트리스 염산염용 10밀리미터 의 마이크로리터 450마이크로리터를 추가하고, 1밀리머 EDTA와 2.5개의 어금니 칼슘 염화물 용액50마이크로리터를 보충합니다.반전으로 섞으세요. 튜브에, 혈장 DNA의 10 마이크로 그램에 대응하는 볼륨을 추가, DNA 미디프 키트에 의해 증폭, 이 키트의 용출 버퍼로 희석, 누구의 농도가 결정되었다. 튜브를 반전하여 혼합합니다.그런 다음, 소용돌이 믹서에 부드러운 동요와 함께, 천천히 추가 500 BES 완충 식염수 2X 농축물의 마이크로 리터, 튜브에 드롭하여 드롭. DNA와 칼슘 인산염 사이의 복잡한 형성을 방해하지 않도록 매우 신중하게 움직입니다. 실온에서 최소 15분 또는 최대 45분 동안 배양합니다.이제 플레이트를 인큐베이터에서 안전 캐비닛으로 트랜스펙트로 옮기게 합니다. 준비된 DNA 복합체를 플레이트 표면 의 모든 세포에 떨어뜨려 놓습니다. 섭씨 37도에서 인큐베이터에서 24~72시간 동안 배양합니다.단백질 분해를 방지하기 위해, 각 전염판에 대한 용해 버퍼 4밀리리터를 고려하여 얼음에 용해 완충액을 준비한다. 인큐베이터에서 감염된 세포로 접시를 가져 가라. 미디어를 제거하고 전용 표백제 폐기물 병에 폐기하십시오.세포를 세척하려면, 감염된 세포를 분리하지 않도록, 드롭 드롭드롭 플레이트의 측면에 차가운 PBS의 세 밀리리터를 추가합니다. 그리고 부드럽게 표면 전체에 버퍼를 확산 플레이트를 소용돌이. 접시를 기울여 PBS를 제거하고 폐기병에 넣습니다.세탁을 한 번 더 반복합니다. 접시를 얼음 위에 놓습니다. 결국, 신중하게 PBS의 나머지 부분을 제거합니다.다음으로, 감염된 세척 된 세포에 차가운 리시스 버퍼 500 마이크로 리터를 추가합니다. 접시 의 표면에 걸쳐 확산. 얼음에 10 분 동안 배양.때때로 다시 버퍼를 플레이트 표면 전체에 퍼버링합니다. 그 후, 세포 주걱을 사용하여 표면에서 세포를 긁어 내고 미세 원심 분리기 튜브에서 수집하십시오. 원심분리기는 10분, G000회, 섭씨 4도에서 10분 간 분리됩니다.새로운 미세 원심 분리기 튜브로 상체 리자슈를 수집하고 다른 새로운 미세 원심 분리기 튜브에이 분획의 50 마이크로 리터 알리쿼트를 수집합니다. 이 알리쿼트(aliquot)는 전염된 단백질이 잘 표현되었는지 확인하기 위해 사용될 것이다. 쓰레기통에 펠릿을 버리십시오.먼저, 적절한 항체와 결합된 아가로즈 구슬의 스톡 용액을 부드럽게 재중단한다. 200 마이크로리터 팁의 끝을 잘라 1 ~ 2 밀리미터 개구부를 만듭니다. 팁을 마이크로파이프에 부착하고 용액의 40 마이크로리터를 그려 비즈가 팁에 들어갈 수 있도록 합니다.구슬을 여러 번 피펫하여 팁을 포화하여 올바른 구슬을 확보하고 구슬을 미세 원심분리기 튜브로 옮춥시다. TNET 버퍼 500마이크로리터를 넣고 반전으로 혼합하고 원심분리기를 1, 000배 G, 섭씨 4도에서 2분간 섞습니다. 상체를 조심스럽게 제거하고 TNET 버퍼 500 마이크로리터를 추가합니다.섭씨 4도에서 회전 휠에 1시간 이상 배양합니다. 그런 다음, 원심 분리튜브는 1, 000배, 섭씨 4도에서 2분간 튜브를 세척하고, 역향 및 원심분리를 통해 500마이크로리터의 용액으로 구슬을 두 번 씻는다. 세척 후, 이전에 수집된 총 분수를 튜브로 옮기고 2~4시간 동안 섭씨 4도에서 회전휠에 배양한다.지금, 원심분리기 는 1, 000 배 G 및 섭씨 4도에서 2 분 동안 면역 침전구구슬을 포함하는 관을 원심분리합니다. 역과 원심분리를 통해 500 마이크로리터의 용해 버퍼로 구슬을 5회 세척합니다. 구슬을 씻을 때, 슈퍼 나탄을 제거하는 동안 구슬에서 너무 가까이 가지 않도록주의하십시오.그렇지 않으면 구슬이 흡인되고 실험이 끝나면 더 이상 구슬이 남지 않습니다. 용출의 경우 첫 번째 원심 분리기는 1, 000 배 G 및 섭씨 4도에서 2 분 동안 사용할 수 있습니다. 1 밀리리터 마이크로파이프를 사용하여 상체를 조심스럽게 제거하십시오.그런 다음, 시멘트 바늘이 장착 된 해밀턴 주사기와 함께, 구슬의 포부를 피하기 위해 상체의 마지막 방울을 제거합니다. 다음으로 4X Laemmli 버퍼의 마이크로리터 40을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 눌러 균질화하십시오.실온에서 5분간 배양하세요. 그런 다음 원심 분리기는 10, 000 배 G 및 실온에서 5 분 동안. 해밀턴 주사기를 사용하면 상피 용액을 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오.영하 80도에 보관하십시오. HEK-293 세포는 LIMK 2-1 또는 LIMK 2의 태그형 등소 형태 중 하나로 도형이 없는 LIMK 2-1로 전염되었다. LIMK 2-1은 다른 조건에서 잘 표현됩니다.항 LIMK 2-1 항체는 LIMK 2a 및 LIMK 2b 이소형을 인식하지 못하며, 세포가 LIMK2 소형 간섭 RNA로 감염될 때 신호가 감소함에 따라, 작은 간섭 RNA를 제어하는 것에 비해 특이적이다. 다양한 인간 세포주에서 LIMK 2-1은 HEK-293 및 HeLa에서 발현되는 것으로 나타났지만 C6에서는 발현되지 않았습니다. 공존성전성 실험은 상류 키나아제 ROCK과의 LIMK2-1의 상호작용을 평가하기 위해 사용되었다. 전감염된 벡터에 의해 인코딩된 각각의 상이한 단백질은 잘 표현되었다.LIMK2의 3가지 등소형태와 larp6은 효율적으로 면역절전을 했다. 용액에서, ROCK은 LIMK2의 3개의 동형과 면역성 전염되는 것을 검출하고, 그러나 larp6와 는 아닙니다. 그런 다음 감지된 상호 작용이 구체적입니다.공존성전성 LIMK 2-1은 감마 P32 ATP 라벨링을 통해 키나아제 활성을 테스트하였다. LIMK 2-1은 코필린을 인광하지 않았지만, 마이엘린 기본 단백질 또는 MBP를 인포량증으로 했다. LIMK 2-1은 이 시험에서 효율적으로 면역절전을 한다.상호 작용이 특정되어 있는지 확인하기 위해 면역 침전을 수행하면서 부정적인 제어를 갖는 것이 중요합니다. 리시스 버퍼의 구성은 상호 작용 및 활동을 보존하기 위해 신중하게 설정해야 합니다. 면역 침전시, 키나아제 활성은 상이한 기판을 계산하도록 평가될 수 있다.돌연변이는 쉽게 소개될 수 있고 특정 잔류물의 역할을 해명할 수 있습니다. 기능적 연구는 또한 새로운 강조된 상호 작용의 생리적 역할을 이해하기 위하여 수행될 수 있습니다. 세포는 생물 안전 캐비닛 내의 전용 배양실에서 배양되어야 합니다.P32 ATP는 신중하게 처리해야 합니다. 방사선으로부터 보호하기 위한 방패, 가이거 카운터, 특정 폐기물 수거, 개인 유방 및 손가락 배지를 사용하여 방사성 노출을 감지하고 팁을 필터링합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

연구

생화학

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Rab10 인산화를 평가하여 파킨슨병 관련 LRRK2 키나아제 경로를 심문하기 위한 인간 말초 혈액 호중구 격리

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 CK2 키 기판의 식별

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

로 키나아제 활성의 일시적인 억제를 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 생착을 강화

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...