Name: characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein
Uploaded: 2019-06-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein at JoVE.com

Detta arbete stöddes av La Ligue contre le cancer, L' Association Neurofibromatoses et Recklinghausen, och la Région Centre Val de Loire. Ett stort tack till Aurélie Cosson och Déborah Casas för flödescytometri data, och till Keyron Hickman-Lewis för grundlig korrektur läsning av manuskriptet.

1. cell förberedelse för transfektion
Varning: alla steg i cell kulturen måste utföras i ett särskilt laboratorium, och celler manipuleras inom ett klass 2 mikrobiologiskt skåp.
<ol><li>Frö HEK-293 (Human embryonal njure) celler i Ø 10 cm plattor i 10 mL DMEM (Dulbecco ' s Modified Eagles medium) kompletteras med 10% Foster kalv serum. Kultur för 3 till 5 dagar under 5% CO2, vid 37 ° c, tills cellerna når ~ 90% confluence.</li>
	<li>Behandla Ø 10 cm plattor med kollage...

<ol>
	<li>Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+protein+kinase+signaling+from+yeast+to+man.">Evolution of protein kinase signaling from yeast to man.</a> Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).</li><li>Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution,+dynamics+and+dysregulation+of+kinase+signalling.">Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling.</a> Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).</li><li>Bhullar, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase-targeted+cancer+therapies:+progress,+challenges+and+future+directions.">Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions.</a> Molecular Cancer. 17, 48 (2018).</li><li>Kaboord, B., Perr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+proteins+and+protein+complexes+by+immunoprecipitation.">Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.</a> Methods in Molecular Biology. 424, 349-364 (2008).</li><li>Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+strategies+for+the+use+of+affinity+tags+and+tag+removal+for+the+purification+of+recombinant+proteins.">Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins.</a> Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).</li><li>Wood, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+trends+and+affinity+tag+designs+for+recombinant+protein+purification.">New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).</li><li>Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+and+purification:+a+comprehensive+review+of+affinity+tags+and+microbial+applications.">Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications.</a> Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).</li><li>Greenwood, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins.">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li><li>Wang, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Dynamic+and+Heterogeneous+Proteasome+Complexes+Using+In+vivo+Cross-Linking-Assisted+Affinity+Purification+and+Mass+Spectrometry.">Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1844, 401-410 (2018).</li><li>Raykova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+There+Be+Light!.">Let There Be Light!.</a> Proteomes. 4, (2016).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).</li><li>Podobnik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+Study+Protein-protein+Interactions.">How to Study Protein-protein Interactions.</a> Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).</li><li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection:+methods+and+analysis.">Protein-protein interaction detection: methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).</li><li>Peck, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+phosphorylation:+methods+and+strategies+for+studying+kinases+and+substrates.">Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).</li><li>Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+in+vitro+kinase+assay+technologies:+the+quest+for+a+universal+format.">Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format.</a> Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).</li><li>Okano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+family+of+serine/threonine+kinases+containing+two+N-terminal+LIM+motifs.">Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).</li><li>Croft, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-mediated+transcriptional+regulation+and+activation+of+the+actin+cytoskeleton.">p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton.</a> Cell Research. 21, 666-682 (2011).</li><li>Tastet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1+is+a+Hominidae-Specific+Isoform+of+LIMK2+Expressed+in+Central+Nervous+System+and+Associated+with+Intellectual+Disability.">LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability.</a> Neuroscience. 399, 199-210 (2019).</li><li>Vallee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1,+a+new+isoform+of+human+LIMK2,+regulates+actin+cytoskeleton+remodeling+via+a+different+signaling+pathway+than+that+of+its+two+homologs,+LIMK2a+and+LIMK2b.">LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b.</a> The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).</li><li>Lee, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detergents+on+Membrane+Protein+Complex+Isolation.">Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation.</a> Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).</li></ol>

Häri har vi använt robusta biokemiska verktyg för att karakterisera på molekylär nivå ett nytt protein, LIMK2-1, tros vara en Kinas baserat på dess sekvens och på dess homologs, LIMK2a och LIMK2b20.
För det första demonstrerade vi förekomsten av LIMK2-1 på protein nivå med hjälp av Western blot-analys med en specifik anti kropp. Efter detta utvärderade vi dess interaktion med uppströms Kinas ROCK1, som är känd för att reglera LIMK2a och LIMK2b, homolo...

Under många decennier har många signal vägar klarlagts och deras medverkan i viktiga cellulära processer såsom cell delning, differentiering, motilitet, programmerad celldöd, immunitet och neurobiologi, har visats. Kinases spelar en viktig roll i dessa signal vägar eftersom de ofta fint reglerar deras aktivering eller inaktive ring och är en del av övergående mångsidiga komplex som reagerar på yttre stimuli1,2,3. Mutation och Dysreglering av kinaser leder ofta till sjukdomar hos människor, och de har därför blivit en av de viktigaste drogen mål under de senaste 40 år4.
I detta sammanhang är det viktigt att kunna upptäcka Kinas interaktion med deras uppströms regulatorer eller nedströms substrat och att identifiera nya partners. Affinitet rening och immunutfällning är mycket kraftfulla tekniker för isolering av protein komplex5. Betet protein eller Kinas kan märkas med en specifik peptid sekvens gör det möjligt att använda kommersiella pärlor kovalent kombination med anti kroppar inriktade på peptiden. Detta material möjliggör en hög reproducerbarhet i experiment6,7,8. Endogena proteiner kan även vara immunutfällda med anti kroppar riktade direkt mot bete proteinet. Anti kropparna kan vara tvär bunden till protein A eller protein G AGA ros pärlor eller helt enkelt inkuberas med dessa pärlor innan du lägger lysate. Lysbuffertar måste optimeras för att möjliggöra proteinlösbilisering utan att förlora interaktion och för att undvika protein nedbrytning. En stor nackdel med detta tillvägagångs sätt är att interaktionen upptäcks vid celllys; Därför kan övergående eller svaga interaktioner, tillsammans med de som kräver subcellulär kontext, missas. Andra tekniker kan användas för att arbeta direkt i cellen som närhet ligation assay (PLA)9, in vivo tvär bindning-assisterad affinitet rening (XAP)10, bioluminescence resonans energi överföring (Bret) eller Förster resonans energi Överföring (fret)11,12. Dessutom är immunutfällning inte lämplig för bestämning av de termodynamiska konstanterna hos bindningen, för vilka fysikaliska tekniker såsom Ytplasmon-resonans, Isotermisk titrering Calorimetri eller Microscale Thermophoresis krävs 13,14.
Kinas aktivitet kan bedömas med hjälp av flera tekniker. Häri fokuserade vi på fosfospecifika anti kroppar och in vitro γ [32P] ATP (adenosintrifosfat) märkning. Fosfospecifika anti kroppar inriktar sig på fosfatmodifiering av en viss rest i ett protein. De kan användas i Western blot eller ELISA (enzymkopplad ImmunoSorbent assay) efter cell lysis, för immunhistokemi, och även på intakta celler med flödescytometri eller immunofluorescens. Deras nack delar kan omfatta deras brist på specificitet, som kan utvärderas med hjälp av en muterad version av mål proteinet, och att de inte är kommersiellt tillgängliga för alla proteiner. In vitro γ [32P] ATP märkning är en mycket robust, väletablerad och mycket känslig metod15. Immunoprecipiterade eller rekombinanta proteiner kan användas, och olika substrat kan testas. Effekterna av droger kan också bedömas eftersom denna metod är kvantitativ. Dess största nackdel är att radio aktiviteten i samband med metoden kräver hantering med försiktighet. Alternativa metoder är också möjligt baserat på mätning av fluorescerande eller självlysande peptid substrat och dra nytta av förändrade fluorescerande/självlysande egenskaper vid fosforylering. Sådana metoder möjliggör också hög genom strömning, vilket krävs, till exempel vid screening av molekyler som kan vara potentiella hämmare av mål Kinas. Faktum är att kinaser utgör en av de största klasserna av narkotika mål som eftersträvas av läkemedels företag16.
I denna studie fokuserade vi på LIMK2-1-proteinet (LIMK2-1 står för Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). LIMK2 Kinas protein beskrevs först i 1995-17. Tre ISO former av LIMK2 framställs genom alternativ skarvning: LIMK2a, LIMK2b och LIMK2-1. För närvarande har LIMK2-1 endast beskrivits på mRNA-nivå i en enda studie18. Häri karakteriserar vi detta potentiella nya Kinas protein på molekylär nivå med hjälp av robusta biokemiska metoder. För det första visar vi att LIMK2-1 är verkligen syntetiseras. Liknar dess två motsvarigheter, LIMK2a och LIMK2b, det interagerar med uppströms Kinas ROCK (Rho-associerade protein Kinas). Vi visar LIMK2-1 har en Kinas aktivitet på myelin Basic protein (MBP), men inte på cofilin, den kanoniska substrat av LIM kinaser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1978</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-c-Myc</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-21316</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3312/5175</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-GFP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-HA</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11687423001</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-phospho-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3313</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Anti-PP1i</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>designed for this study</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A-162B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PV3227</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>g[32P] ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG502A</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14280</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>111-541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P06-20166</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM4611</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie PageBlue Protein Staining Solution</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>24620</td>
			<td>for gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Protean</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZview Red anti-HA affinity gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6779</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneTolls software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-trap beads</td>
			<td>Chromtek</td>
			<td></td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405</td>
			<td>for transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-cofilin</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>12-556</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>710</td>
			<td>to remove carefully supernatant from beads without aspirating them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant TL software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>for radioactivity acquisition and quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIMK2 siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>s8191</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SP-04-2217</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBP</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>13-173</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1112</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-1504</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Okaidic acid</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>0-2220</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenylphosphate</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1026</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobillon-P</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPVH00010 pore size 0,45 mm</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating wheel</td>
			<td>Labinco</td>
			<td></td>
			<td>for bead incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe lock eppendorf</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120.086</td>
			<td>for kinase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td>for Laemmli and migration buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>S8507</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71501</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal West Dura</td>
			<td>Protein Biology</td>
			<td>34075</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene Pxi</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue extracts 
			 
			&#160;</td>
			<td>Biochain 
			 
			&#160;</td>
			<td>P1234035 Brain 
			P12345152 Lung 
			P1234149 Liver 
			P1234188 Pancreas 
			P1234260 Testis</td>
			<td>for Western Blot analysis 
			 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Trans-Blot</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094 B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA9500</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>3030-672</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein

Omfattande sekvensering av hela genomet har identifierat många öppna Läs ramar (ORFs) som ger många potentiella proteiner. Dessa proteiner kan ha viktiga roller för cellen och kan nysta upp nya cellulära processer. Bland proteiner, kinaser är stora aktörer som de tillhör cell signalering vägar och har förmågan att slå på eller av många processer som är avgörande för ödet för cellen, såsom cell tillväxt, uppdelning, differentiering, motilitet, och död.
I denna studie fokuserade vi på ett nytt potentiellt Kinas protein, LIMK2-1. Vi visade dess existens genom Western blot med hjälp av en specifik anti kropp. Vi utvärderade dess interaktion med ett uppströms reglerande protein med hjälp av coimmunoprecipitionexperiment. Coimmunonederbörd är en mycket kraftfull teknik som kan detektera samspelet mellan två mål proteiner. Det kan också användas för att upptäcka nya partners av ett bete protein. Bete proteinet kan renas antingen via en tagg konstruerad till dess sekvens eller via en anti kropp som specifikt riktar sig mot den. Dessa protein komplex kan sedan separeras av SDS-PAGE (natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel) och identifieras med hjälp av masspektrometri. Immunoprecipitated LIMK2-1 användes också för att testa dess Kinas aktivitet in vitro-av γ [32P] ATP märkning. Denna väletablerade analys kan använda många olika substrat, och muterade versioner av betet kan användas för att bedöma den roll som specifika rester. Effekterna av farmakologiska agens kan också utvärderas eftersom denna teknik är både mycket känslig och kvantitativ. Radio aktivitets hanteringen kräver dock särskild försiktighet. Kinas aktivitet kan också bedömas med specifika anti kroppar riktade mot fosfogruppen av den modifierade aminosyran. Dessa typer av anti kroppar är inte kommersiellt tillgängliga för alla fosfimodifierade rester.

LIMK2-1 protein syntetiseras LIMK2-1 nämns i databanks, men hittills har bara ett papper visat förekomsten av dess mRNA18. Jämfört med dess två homologs, LIMK2a och LIMK2b, LIMK2-1 har en extra C-Terminal domän identifierats som en protein fosfatas 1 hämmande domän (PP1i). Vi designade en anti kropp som inriktar sig på en peptid av denna domän, aminosyror 671-684 (figur 1a). BLAST forskning mot mänskli...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein at JoVE.com

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Vi karakteriserade ett nytt Kinas protein med hjälp av robusta biokemiska metoder: Western blot analys med en dedikerad specifik anti kropp på olika cellinjer och vävnader, interaktioner genom coimmunoprecipiten experiment, Kinas aktivitet detekteras av västerländska Blot med hjälp av en phospho-specifik anti kropp och γ [32P] ATP märkning.

Karakterisering på molekylär nivå med hjälp av robusta biokemiska metoder för ett nytt Kinas protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Immunoprecipitation är en mycket kraftfull teknik för att isolera och rena ett målprotein. Under jämna förhållanden kan proteiner, regulatorer eller substrat ko-immunoprecipiteras. Ett nytt interaktionsnätverk kan då upptäckas.Aktiviteten hos det immunutstämda proteinet kan också bedömas. I synnerhet kan aktivitet av en kinas provas på olika substrat genom P32-ATP-märkning. Ändå kan aktiviteten hos inhibitorer som riktar sig mot en kinas som är involverad i en sjukdom utvärderas.De kan utgöra bly föreningar att utveckla nya läkemedel. Denna metod kan utvidgas från däggdjur till jäst eller bakterier. Denna teknik är inte så svårt.Till viktiga punkter:se till att ha en negativ kontroll för att vara säker på att den upptäckta interaktionen är specifik, och välj noga lysförhållanden för att hålla interaktioner och aktivitet. Små detaljer och gester är viktiga för att säkerställa framgången för denna teknik, och de är aldrig beskrivs i material och metoder för artiklar. Demonstrerar proceduren blir Fabienne Godin, en tekniker från vårt laboratorium.När celler har tillretts i cellodlingsrummet i biosäkerhetsskåpet, använd en 10 milliliterpipett för att ta bort media från plattorna och kassera det i en särskild avfallsflaska med blekmedel. Tillsätt sedan 10 milliliter färsk kompletterad DMEM, och lägg tillbaka plattorna i en inkubator vid 37 grader Celsius. För att förbereda transfektionsblandningen, i ett 15 milliliterrör, tillsätt 450 mikroliter på 10 millimolar Tris hydrokloridlösning vid pH 7,5, kompletterad med en millimolär EDTA och 50 mikroliter av 2,5 molar kalciumkloridlösning.Blanda genom inversion. I röret, tillsätt en volym som motsvarar 10 mikrogram plasma-DNA, förstärkt av en DNA-midiprep-sats, och späds med elueringsbufferten av denna sats, och vars koncentration har fastställts. Invertera röret för att blanda.Sedan, med smidig agitation på en virvel mixer, långsamt lägga 500 mikroliter av BES buffrad saltlösning 2X koncentrat, droppe för droppe i röret. Flytta det mycket försiktigt, inte för att störa den komplexa formationen mellan DNA och kalciumfosfat. Inkubera i minst 15 minuter, eller upp till 45 minuter, i rumstemperatur.Nu, överför plattan till transfekt från inkubatorn till säkerhetsskåpet. Tillsätt de förberedda DNA-komplexen droppe för droppe på cellerna över hela ytan av plattan. Inkubera i 24 till 72 timmar i inkubatorn vid 37 grader Celsius.För att förhindra proteinnedbrytning, förbereda lysbuffert på is, med beaktande av fyra milliliter av lysbuffert för varje transfekterad platta. Ta plattan med transfekterade celler från inkubatorn. Ta bort media och kasta den i en särskild blekmedel avfall flaska.För att tvätta cellerna, tillsätt tre milliliter av kall PBS på sidan av plattan droppe för droppe, för att undvika att lossa transfekterade celler. Och snurra försiktigt plattan för att sprida bufferten över hela ytan. Luta plattan för att ta bort PBS och kasta den i avfallsflaskan.Upprepa tvätten en gång till. Placera plattan på is. I slutet, försiktigt bort resten av PBS.Därefter lägger du till 500 mikroliter av kalllyssbuffert till de transfekterade tvättade cellerna. Sprid det över hela ytan av plattan. Inkubera i 10 minuter på is.Från tid till annan, återigen sprida buffert över hela ytan av plattan. Efter det, använd en cellspatel för att skrapa bort cellerna från ytan och samla dem i ett mikrocentrifugrör. Centrifugera i 10 minuter vid 10, 000 gånger G och fyra grader Celsius.Samla den supernatant lysate i en ny microcentrifug röret och samla en 50 microliter alikvot av denna fraktion till en annan ny microcentrifug röret. Detta alikvot kommer att användas för att kontrollera om transfekterade proteiner är väl uttryckta. Kasta pelleten i papperskorgen.Först försiktigt resuspend stamlösningen av agaros pärlor tillsammans med lämplig antikropp. Klipp slutet av en 200 mikroliter spets för att göra en en till två millimeter öppning. Fäst spetsen på en mikropipette och dra upp 40 mikroliter av lösningen, vilket gör att pärlor att komma in i spetsen.Pipettera pärlorna upp och ner flera gånger för att mätta spetsen för att säkerställa rätt volym av pärlor och överföra pärlorna till ett mikrocentrifugrör. Tillsätt 500 mikroliter av TNET-buffert, blanda genom inversion och centrifug i två minuter vid 1, 000 gånger G och fyra grader Celsius. Ta försiktigt bort supernatanten och tillsätt 500 mikroliter TNET-buffert.Inkubera på ett roterande hjul i minst en timme vid fyra grader Celsius. Sedan centrifug röret i två minuter vid 1, 000 gånger G och fyra grader Celsius och tvätta pärlorna två gånger med 500 mikroliter av lysbuffert genom invertera och centrifugering. Efter tvätt, överför den tidigare insamlade totala fraktionen lysate i röret och inkubera på ett roterande hjul vid fyra grader Celsius i två till fyra timmar.Nu centrifug röret som innehåller immunutfällda pärlor i två minuter vid 1, 000 gånger G och fyra grader Celsius. Tvätta pärlorna fem gånger med 500 mikroliter av lysbuffert genom att vända och centrifugera. När du tvättar pärlorna, se till att inte gå för nära från pärlorna samtidigt som du tar bort supernatant.Annars kommer pärlor att aspirera och i slutet av experimentet kommer inga fler pärlor att lämnas. För eluering, första centrifug i två minuter vid 1, 000 gånger G och fyra grader Celsius. Använd en mikropipette med en milliliter för att försiktigt ta bort supernatanten.Sedan, med en Hamilton spruta utrustad med en cementerad nål, ta bort de sista dropparna av supernatanten för att undvika aspiration av pärlorna. Därefter lägger du till 40 mikroliter av 4X Laemmli buffert. Homogenisera genom att knacka försiktigt på tuben.Inkubera i fem minuter i rumstemperatur. Sedan centrifug i fem minuter vid 10, 000 gånger G och rumstemperatur. Med en Hamilton spruta, överföra supernatant eluat i en ny mikrocentrifug röret.Förvaras på minus 80 grader Celsius. HEK-293 celler var transfected med untagged LIMK 2-1 eller en av DE HA taggade isoformerna av LIMK 2. LIMK 2-1 uttrycks väl i de olika förutsättningarna.Anti LIMK 2-1 antikropp känner inte igen LIMK 2a och LIMK 2b isoformer, och det är specifikt, eftersom dess signal minskar när celler är transfekterade med LIMK2 små störande RNA, jämfört med kontroll små störande RNA. I olika mänskliga cellinjer verkade LIMK 2-1 uttryckas i HEK-293 och HeLa, men inte i C6. Coimmunoprecipitation experiment användes för att bedöma samspelet mellan LIMK2-1 med uppströms kinas ROCK. Var och en av de olika proteiner kodade av de transfected vektorerna uttrycktes väl.De tre isoforms av LIMK2, liksom larp6, var effektivt immunoprecipitated. I eluaterna upptäcktes ROCK och därmed coimmunoprecipitated med de tre isoformerna av LIMK2, men inte med larp6. Den identifierade interaktionen är då specifik.Coimmunoprecipitated LIMK 2-1 testades för sin kinas aktivitet via gamma P32 ATP märkning. LIMK 2-1 inte fosforylat cofilin, medan det gjorde fosforylera myelin grundläggande protein, eller MBP. LIMK 2-1 är effektivt immunutfälld i detta test.Det är viktigt att ha negativ kontroll medan du utför immunoprecipitation att vara säker på att interaktionen är specifik. Sammansättningen av en lysbuffert måste noggrant ställas in för att bevara interaktion och aktivitet. Vid immunoprecipitation kan kinasaktivitet bedömas för att räkna olika substrat.Mutation kan lätt införas och kan nysta upp rollen av specifika rester. Funktionella studier kan också utföras för att förstå den fysiologiska roll nya markerade interaktioner. Celler måste odlas i ett dedikerat kulturrum inom ett biosäkerhetsskåp.P32 ATP måste hanteras med särskild försiktighet. Shield för att skydda mot strålning, Geiger counter, specifikt avfall samla, personliga bröst och finger märken för att upptäcka radioaktiv exponering och filter tips.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analys av proteinkinasaktivitet med radiomärkt ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hög precision FRET vid en-molekylnivå för biomolekylstrukturbestämning

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiska och strukturell karaktärisering av den kolhydrat Transport substrat-bindande-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifiering av cyklin-beroende Kinase 1 särskilda fosforylering platser av ett In Vitro -Kinas Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Human perifert blod Neutrophil Isolering för förhör av Parkinsons associerade LRRK2 Kinas väg genom att bedöma Rab10 Fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifiering av romanen CK2 Kinase substrat med en mångsidig biokemisk metod

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust jämförelse av proteinnivåer över vävnader och hela utveckling med hjälp av standardiserade kvantitativa Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Förbättra inympningen av humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda Kardiomyocyter via en övergående hämning av Rho-Kinas aktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...