Name: characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein
Uploaded: 2019-06-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein at JoVE.com

Bu çalışma la Ligue contre le Cancer, l 'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen ve La Région Centre Val de Loire tarafından destekleniyordu. Akış sitometri verileri için Aurélie Cosson ve Déborah Casas ve el yazması tam redaksiyon için keyron Hickman-Lewis çok teşekkür ederiz.

1. transfeksiyon için hücre hazırlığı
DIKKAT: hücre kültürünün tüm adımlarının özel bir laboratuvarda gerçekleştirilmesi gerekir ve hücreler sınıf 2 mikrobiyolojik kabine içinde manipüle edilir.
<ol><li>Tohum HEK-293 (Insan embriyonik böbrek) Ø 10 cm plaklarda 10 mL DMEM (Dulbecco 'nun modifiye Eagles Medium) hücrelerinde% 10 fetal buzağı serumu ile desteklenmektedir. Kültür 3 ila 5 gün altında 5% CO2, at 37 °c, hücreler ulaşıncaya kadar ~ 90% C...

<ol>
	<li>Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+protein+kinase+signaling+from+yeast+to+man.">Evolution of protein kinase signaling from yeast to man.</a> Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).</li><li>Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution,+dynamics+and+dysregulation+of+kinase+signalling.">Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling.</a> Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).</li><li>Bhullar, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase-targeted+cancer+therapies:+progress,+challenges+and+future+directions.">Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions.</a> Molecular Cancer. 17, 48 (2018).</li><li>Kaboord, B., Perr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+proteins+and+protein+complexes+by+immunoprecipitation.">Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.</a> Methods in Molecular Biology. 424, 349-364 (2008).</li><li>Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+strategies+for+the+use+of+affinity+tags+and+tag+removal+for+the+purification+of+recombinant+proteins.">Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins.</a> Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).</li><li>Wood, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+trends+and+affinity+tag+designs+for+recombinant+protein+purification.">New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).</li><li>Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+and+purification:+a+comprehensive+review+of+affinity+tags+and+microbial+applications.">Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications.</a> Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).</li><li>Greenwood, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins.">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li><li>Wang, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Dynamic+and+Heterogeneous+Proteasome+Complexes+Using+In+vivo+Cross-Linking-Assisted+Affinity+Purification+and+Mass+Spectrometry.">Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1844, 401-410 (2018).</li><li>Raykova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+There+Be+Light!.">Let There Be Light!.</a> Proteomes. 4, (2016).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).</li><li>Podobnik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+Study+Protein-protein+Interactions.">How to Study Protein-protein Interactions.</a> Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).</li><li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection:+methods+and+analysis.">Protein-protein interaction detection: methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).</li><li>Peck, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+phosphorylation:+methods+and+strategies+for+studying+kinases+and+substrates.">Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).</li><li>Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+in+vitro+kinase+assay+technologies:+the+quest+for+a+universal+format.">Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format.</a> Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).</li><li>Okano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+family+of+serine/threonine+kinases+containing+two+N-terminal+LIM+motifs.">Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).</li><li>Croft, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-mediated+transcriptional+regulation+and+activation+of+the+actin+cytoskeleton.">p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton.</a> Cell Research. 21, 666-682 (2011).</li><li>Tastet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1+is+a+Hominidae-Specific+Isoform+of+LIMK2+Expressed+in+Central+Nervous+System+and+Associated+with+Intellectual+Disability.">LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability.</a> Neuroscience. 399, 199-210 (2019).</li><li>Vallee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIMK2-1,+a+new+isoform+of+human+LIMK2,+regulates+actin+cytoskeleton+remodeling+via+a+different+signaling+pathway+than+that+of+its+two+homologs,+LIMK2a+and+LIMK2b.">LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b.</a> The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).</li><li>Lee, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detergents+on+Membrane+Protein+Complex+Isolation.">Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation.</a> Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).</li></ol>

Burada, moleküler düzeyde yeni bir protein olan LIMK2-1 ' e göre, dizisine ve homologlarında, LIMK2a ve LIMK2b20' ye dayanan bir kinaz olduğuna inanılan sağlam biyokimyasal araçlar kullandık.
Öncelikle, biz belirli bir antikor ile Batı Blot analizi kullanarak protein düzeyinde LIMK2-1 varlığını göstermiştir. Bunun ardından, LIMK2-1 homologlarını LIMK2a ve LIMK2b düzenleyen bilinen upstream kinaz rock1 ile etkileşimi değerlendirildi. Son olarak, L...

Onlarca yıl boyunca, çok sayıda sinyalizasyon yolları aydınlatılamamıştır ve hücre bölünmesi, farklılaşma, motilite, programlanmış hücre ölümü, bağışıklık ve Nörobiyoloji gibi önemli hücresel süreçlere katılımı gösterildi. Kinazlar, bu sinyal yollarında, aktivasyon veya inaktivasyonunu genellikle ince olarak düzenleyen ve dış uyaranlara1,2,3yanıt veren geçici çok yönlü kompleksleri bir parçası olarak önemli bir rol oynamaktadır. Mutasyon ve kinazlar disregülasyon genellikle insanlarda hastalıklara yol, ve bu nedenle son 40 yıl içinde en önemli uyuşturucu hedefleri biri haline gelmiştir4.
Bu bağlamda, upstream regülatörleri veya aşağı alt substratlar ile kinaz etkileşimi tespit etmek ve yeni ortakları tespit edebilmek için önemlidir. Yakınlık arıtma ve immünoprecipitation protein kompleksleri yalıtımı için çok güçlü tekniklerdir5. Yem protein veya kinaz belirli bir peptit dizisi ile kovalently peptit hedefleyen antikorlar ile birleştiğinde ticari boncuk kullanımına izin etiketli olabilir. Bu malzeme deneyler6,7,8yüksek bir yeniden üretilebilirliği izin verir. Endojen proteinleri de doğrudan yem protein hedefleyen antikorlar kullanarak immünoprecip, olabilir. Antikorlar protein A veya protein G agaroz boncuklar çapraz bağlantılı olabilir ya da sadece lysate eklemeden önce bu boncuklar ile inkübe. Liziz tamponları, etkileşimi kaybetmeden protein çözünmesine izin vermek ve protein bozulmasını önlemek için optimize edilmelidir. Bu yaklaşımın büyük bir dezavantajı, etkileşimin hücre lizisi üzerine algılanması; Bu nedenle, geçici veya zayıf etkileşimler, alt hücre bağlamı gerektiren ile birlikte cevapsız olabilir. Diğer teknikler, Proximity ligasyon tahlil (PLA)9, In vivo çapraz bağlama destekli benzeşme arıtma (xap)10, Bioluminescence rezonans enerji transferi (Bret) veya Förster rezonans enerjisi gibi doğrudan hücrede çalışmak için kullanılabilir Transfer (fret)11,12. Ayrıca, immünoplikoterapi, yüzey plasmon rezonans, Isothermal titrasyon kalorimetri veya Microscale Thermophoresis gibi fiziksel tekniklerin gerekli olduğu bağlayıcı termodinamik sabitler belirlemek için uygun değildir 13,14.
Kinaz aktivitesi birden fazla teknik kullanılarak değerlendirilebilir. Burada, fosho spesifik antikorlar üzerinde duruldu ve in vitro γ [32P] ATP (adenozin trifosfat) etiketleme. Phospho spesifik antikorlar bir protein içinde belirli bir kalıntı fosfat modifikasyonu hedef. Onlar Batı Blot veya ELISA kullanılabilir (enzim bağlantılı Immünosorbent assay) hücre lizis sonra, immünhistokimya, ve aynı zamanda akış sitometri veya immünofluorescence kullanarak bozulmamış hücreler üzerinde. Bunların dezavantajları, hedef proteinin mutasyona uğramış bir versiyonunu kullanarak değerlendirilebilen ve tüm proteinler için ticari olarak kullanılmaması açısından özgüllük eksikliği içerebilir. In vitro γ [32P] ATP etiketleme çok sağlam, iyi kurulmuş ve son derece hassas bir yöntemdir15. İmmunopmanite veya rekombinant proteinler kullanılabilir ve farklı substratlar test edilebilir. Bu yöntem nicel olduğu için ilaçların etkileri de değerlendirilebilir. Büyük dezavantajı, yaklaşım ile ilişkili radyoaktivite dikkatli işleme gerektirir. Floresan veya ışıldayan peptid substratların ölçümüne dayalı ve fosforilasyon üzerine değiştirilmiş floresan/ışıldayan özelliklerinden yararlanarak alternatif yöntemler de mümkündür. Bu tür yöntemler de, örneğin, hedef kinaz potansiyel inhibitörleri olabilir moleküllerin taramasında gerekli olan yüksek verim, izin verir. Gerçekten de, kinazlar ilaç şirketleri tarafından izlenen uyuşturucu hedefleri en büyük sınıflarından birini temsil16.
Bu çalışmada LIMK2-1 proteini (LIMK2-1 Lin11, Isle1, Mec3 kinase izoformu 2-1) üzerinde duruldu. LIMK2 kinaz proteini ilk olarak 199517' de tanımlanmıştır. LIMK2 üç izoformlarının alternatif birleştirme tarafından üretilir: LIMK2a, LIMK2b ve LIMK2-1. Şu anda, LIMK2-1 sadece tek bir çalışmada18mRNA düzeyinde açıklanmıştır. Burada, bu potansiyel yeni kinaz proteini moleküler düzeyde güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak karakterize ediyoruz. Öncelikle, LIMK2-1 ' in gerçekten sentezlenmiş olduğunu gösteriyoruz. Onun iki karşı benzer, LIMK2a ve LIMK2b, upstream kinaz ROCK ile etkileşime girer (Rho-ilişkili protein kinaz). Biz LIMK2-1 myelin temel protein (MBP) üzerinde bir kinaz aktivite olduğunu göstermek, ama cofilin değil, LIM kinazlar ve kurallı substrat.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody anti-actin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1978</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-c-Myc</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-21316</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3312/5175</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-GFP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-HA</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11687423001</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-phospho-cofilin</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>3313</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Anti-PP1i</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>designed for this study</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A-162B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PV3227</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>g[32P] ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG502A</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14280</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for Laemmli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>111-541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen R</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P06-20166</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM4611</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie PageBlue Protein Staining Solution</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>24620</td>
			<td>for gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Protean</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZview Red anti-HA affinity gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6779</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneSys software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneTolls software</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-trap beads</td>
			<td>Chromtek</td>
			<td></td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405</td>
			<td>for transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST-cofilin</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>12-556</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100 mL</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>710</td>
			<td>to remove carefully supernatant from beads without aspirating them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant TL software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>for radioactivity acquisition and quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIMK2 siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>s8191</td>
			<td>for PP1i antibody specificity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SP-04-2217</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBP</td>
			<td>Upstate Cell signaling</td>
			<td>13-173</td>
			<td>for g[32P] labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244589</td>
			<td>for kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1112</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-1504</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Okaidic acid</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>0-2220</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78830</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenylphosphate</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>1026</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane Immobillon-P</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPVH00010 pore size 0,45 mm</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating wheel</td>
			<td>Labinco</td>
			<td></td>
			<td>for bead incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe lock eppendorf</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120.086</td>
			<td>for kinase assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5030</td>
			<td>for Laemmli and migration buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>S8507</td>
			<td>for lysis and kinase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71501</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal West Dura</td>
			<td>Protein Biology</td>
			<td>34075</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syngene Pxi</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td></td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue extracts 
			 
			&#160;</td>
			<td>Biochain 
			 
			&#160;</td>
			<td>P1234035 Brain 
			P12345152 Lung 
			P1234149 Liver 
			P1234188 Pancreas 
			P1234260 Testis</td>
			<td>for Western Blot analysis 
			 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Mini-Trans-Blot</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094 B</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA9500</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon Trio</td>
			<td>Amersham Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>to read autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>3030-672</td>
			<td>for Western Blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization at the molecular level using robust biochemical approaches of a new kinase protein

Geniş tüm genom sıralamasının birçok potansiyel protein sağlayan pek çok açık okuma çerçeveleri (ORFs) belirledi. Bu proteinlerin hücre için önemli rolleri olabilir ve yeni hücresel süreçleri çözebilir. Proteinler arasında, kinazlar, hücre sinyalizasyon yollarına ait olduğu ve hücre büyümesi, bölünme, farklılaşma, motilite ve ölüm gibi hücrenin kaderi için önemli olan birçok işlemi açma veya kapama yeteneğine sahip olduğu için önemli aktörlerdir.
Bu çalışmada, yeni bir potansiyel kinaz proteini, LIMK2-1 üzerinde duruldu. Biz Batı Blot tarafından belirli bir antikor kullanarak varlığını göstermiştir. Biz koimmünoprecipitation deneyler kullanarak upstream düzenleyen protein ile etkileşimi değerlendirdi. Coimmünoprecipitation iki hedef proteinleri arasındaki etkileşimi algılamak mümkün olan çok güçlü bir tekniktir. Ayrıca bir yem proteini yeni ortakları algılamak için kullanılabilir. Yem protein ya kendi sırasına yönelik bir etiket veya özellikle onu hedefleyen bir antikor yoluyla arındırılmış olabilir. Bu protein kompleksleri daha sonra SDS-PAGE (sodyum Dodecyl sülfat Poliakrilamid jel) ile ayrılabilir ve kütle spektrometresi kullanılarak tespit edilebilir. İmmunoprecip, LIMK2-1 de onun kinaz aktivitesini test etmek için kullanıldı in vitro tarafından γ [32P] ATP etiketleme. Bu iyi kurulan tahlil birçok farklı substratlar kullanabilirsiniz, ve yem mutasyonlu sürümleri belirli kalıntıları rolünü değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin hem son derece hassas hem de nicel olduğundan farmakolojik ajanların etkileri de değerlendirilebilir. Yine de, radyoaktivite işleme özellikle dikkatli gerektirir. Kinaz aktivitesi de değiştirilmiş amino asit Fosfo grubunu hedefleyen spesifik antikorlar ile değerlendirilebilir. Bu tür antikorlar tüm fosho değiştirilmiş kalıntıları için ticari olarak mevcut değildir.

LIMK2-1 protein sentezlenmiş LIMK2-1 databanks belirtilmiştir, ancak şimdiye kadar sadece bir kağıt onun mRNA18varlığını göstermiştir. İki homolog ile karşılaştırıldığında, LIMK2a ve LIMK2b, LIMK2-1 protein fosfataz 1 Inhibitör etki alanı (PP1i) olarak tanımlanan ekstra bir C-Terminal etki alanı vardır. Biz bu alan bir peptit hedefleyen bir antikor tasarladık, amino asitler 671-684 (Şekil 1a</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein at JoVE.com

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [32P] ATP etiketleme kullanarak Blot.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

İmmünopreplinasyon, hedef proteini izole etmek ve arındırmak için çok güçlü bir tekniktir. Pürüzsüz koşullarda, proteinler, regülatörler veya substratlar birlikte immünopsipitated olabilir. Daha sonra yeni bir etkileşim ağı keşfedilebilir.İmmünopresipitated proteinaktivitesi de değerlendirilebilir. Özellikle, bir kizazın aktivitesi P32-ATP etiketleme ile farklı yüzeylerde test edilebilir. Bununla birlikte, bir hastalığa karışan bir kiniazı hedef alan inhibitörlerin aktivitesi değerlendirilebilir.Onlar yeni ilaçlar geliştirmek için kurşun bileşikleri oluşturabilir. Bu yöntem memelilerden maya veya bakterilere kadar uzatılabilir. Bu teknik o kadar da zor değil.Önemli noktalara: algılanan etkileşimin belirli olduğundan emin olmak için negatif bir denetime sahip olun ve etkileşimleri ve etkinliği korumak için lysis koşullarını dikkatlice seçin. Küçük ayrıntılar ve jestler bu tekniğin başarısını sağlamak için önemlidir ve onlar malzeme ve makalelerin yöntemleri açıklanmaz. Prosedürü gösteren Fabienne Godin, bizim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.Hücreler biyogüvenlik kabini içinde hücre kültür odasında hazırlandıktan sonra, plakalar medya kaldırmak ve çamaşır suyu ile özel bir atık şişesinde atmak için 10 mililitrelik pipet kullanın. Sonra, taze takviye DMEM 10 mililitre ekleyin ve 37 santigrat derece bir kuvöz içine plakaları geri koymak. Transfeksiyon karışımı hazırlamak için, bir 15 mililitretüp, 10 milimolar Tris hidroklorür çözeltisi 450 mikrolitre ekleyin 7.5, bir milimolar EDTA ve 50 mikrolitre ile takviye 2.5 molar kalsiyum klorür çözeltisi.Ters çevirme ile karıştırın. Tüpün içine, 10 mikrogram plazma DNA'sına karşılık gelen bir hacim ekleyin, DNA midiprep kiti ile güçlendirilmiş ve bu kitin elüsyon tamponu ile seyreltilmiş, ve konsantrasyonu tespit edilmiştir. Tüpü karıştırmak için ters çevirin.Daha sonra, bir girdap karıştırıcı üzerinde pürüzsüz ajitasyon ile, yavaş yavaş bes tamponlu tuzlu 2X konsantre 500 mikrolitre ekleyin, tüp içine damla damla. DNA ve kalsiyum fosfat arasındaki karmaşık oluşumu bozmak için değil, çok dikkatli hareket ettirin. Oda sıcaklığında en az 15 dakika veya 45 dakikaya kadar kuluçkaya yatın.Şimdi, tabağı kuvözden güvenlik kabinine aktarın. Hazırlanan DNA kompleksleri levha nın yüzeyindeki hücrelere damla damla ekleyin. 37 santigrat derecede kuvözde 24 ila 72 saat kuluçka.Protein bozulmasını önlemek için, her transfected plaka için lysis tampon dört mililitre dikkate alarak, buz üzerinde lysis tampon hazırlayın. Kuvözden transfected hücreleri ile plaka alın. Ortamı çıkarın ve özel bir çamaşır suyu atık şişesine atın.Hücreleri yıkamak için, transfected hücreleri ayırmakönlemek için, damla levha nın yan tarafında soğuk PBS üç mililitre ekleyin. Tamponu yüzeye yaymak için plakayı yavaşça döndürün. PBS'yi çıkarmak için plakayı yatırın ve atık şişeye atın.Yıkamayı bir kez daha tekrarlayın. Tabağı buza yerleştirin. Sonunda, PBS'nin geri kalanını dikkatlice çıkarın.Daha sonra, transfected yıkanmış hücrelere 500 mikrolitre soğuk lysis tampon ekleyin. Tabağın yüzeyine yayın. Buzda 10 dakika kuluçkaya yat.Zaman zaman, yine plaka yüzeyine tampon yayıldı. Bundan sonra, yüzeyden hücreleri kazımak ve bir mikrosantrifüj tüp onları toplamak için bir hücre spatula kullanın. 10 dakika santrifüj 10, 000 kez G ve dört santigrat derece.Yeni bir mikrosantrifüj tüp içine supernatant lysate toplamak ve başka bir yeni mikrosantrifüj tüp için bu kesir bir 50 mikrolitre aliquot toplamak. Bu aliquot transfected proteinler iyi ifade olup olmadığını kontrol etmek için kullanılacaktır. Pelet'i çöpe atın.İlk olarak, uygun antikor ile birleştiğinde agarose boncuk stok çözeltisi yavaşça resuspend. Bir ila iki milimetrelik bir açıklık yapmak için 200 mikrolitreucu ucunu kesin. Ucu bir mikropipete takın ve çözeltinin 40 mikrolitresini çizerek boncukların uca girmesini bekleyin.Pipet boncuklar birkaç kez yukarı ve aşağı boncuk doğru hacmini sağlamak ve bir mikrocentrifuge tüp boncuk aktarmak için ucu doygunluk. 500 mikrolitre TNET tamponu ekleyin, ters çevrilerek karıştırın ve 1,000 kez G ve dört santigrat derecede iki dakika santrifüj ekleyin. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve 500 mikrolitre TNET arabelleği ekleyin.Dört santigrat derecede en az bir saat dönen bir tekerlek üzerinde kuluçka. Daha sonra tüpü 1,000 kez G ve 4 santigrat derece de iki dakika santrifüj edin ve boncukları ters çevirerek ve santrifüj ederek 500 mikrolitre lysis tamponu ile iki kez yıkayın. Yıkadıktan sonra, daha önce toplanan toplam kesirli tüpün içine aktarın ve dört derece santigrat derecede iki ila dört saat boyunca kuluçkaya yatırın.Şimdi, immünoppresipated boncukları içeren tüpü 1,000 kez G ve 4 santigrat derecede iki dakika santrifüj edin. Boncukları 500 mikrolitre likis tamponu ile ters çevirerek ve santrifüj ederek beş kez yıkayın. Boncukları yıkarken, supernatant çıkarırken boncukçok yakın gitmek için dikkat edin.Aksi takdirde boncuklar aspire edilecek ve deneyin sonunda artık boncuk kalmayacak. Elüsyon için, 1, 000 kez G ve dört derece santigrat iki dakika için ilk santrifüj. Dikkatle supernatant kaldırmak için bir mililitre mikropipet kullanın.Sonra, bir Hamilton şırınga bir çimentolu iğne ile donatılmış, boncuk aspirasyon önlemek için supernatant son damla kaldırmak. Daha sonra, 4X Laemmli tampon 40 mikrolitre ekleyin. Yavaşça tüp dokunarak homojenize.Oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yat. Sonra, 10,000 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüj. Bir Hamilton şırıngası ile, yeni bir mikrosantrifüj tüp içine supernatant eluate aktarın.Eksi 80 derecede saklayın. HEK-293 hücreleri etiketsiz LIMK 2-1 veya LIMK 2'nin HA etiketli izoformlarından biri ile transfeksedildi. LIMK 2-1 farklı koşullarda iyi ifade edilir.Anti LIMK 2-1 antikor LIMK 2a ve LIMK 2b izoformlarını tanımaz ve hücreler LIMK2 küçük müdahale cihetli RNA ile transfeced olduğunda sinyali azalır gibi, küçük müdahale RNA kontrol etmek için karşılaştırıldığında, spesifiktir. Çeşitli insan hücre hatlarında, LIMK 2-1 HEK-293 ve HeLa ifade gibi görünüyordu, ama C6 değil. Limk2-1'in yukarı dakik KAYAsı ile etkileşimini değerlendirmek için koimmünenopret deneyleri kullanıldı. Transfected vektörler tarafından kodlanmış farklı proteinlerin her biri iyi ifade edildi.LIMK2'nin üç isoform'u ve larp6'nın üç isoformu etkin bir şekilde immünopsipitated edildi. Eluates'te ROCK tespit edildi ve böylece LIMK2'nin üç izoformu ile koimmünpresipitated, ancak larp6 ile değil. Algılanan etkileşim sonra özeldir.Koimmünpresipitated LIMK 2-1 gama P32 ATP etiketleme ile kizaz aktivitesi için test edildi. LIMK 2-1 kofilin fosforilasyon vermedi, oysa miyelin bazal proteinveya MBP fosforilit yaptı. LIMK 2-1 bu testte etkili bir şekilde immünopsipitated edilir.Etkileşimin spesifik olduğundan emin olmak için immünoprediyağış yaparken negatif kontrole sahip olmak çok önemlidir. Bir lysis arabelleği bileşimi dikkatle etkileşim ve etkinliği korumak için ayarlanmalıdır. İmmünyağış üzerine, kinaz aktivitesi farklı substratları saymak için değerlendirilebilir.Mutasyon kolayca ortaya çıkabilir ve spesifik kalıntıların rolünü çözebilir. Yeni vurgulanan etkileşimlerin fizyolojik rolünü anlamak için fonksiyonel çalışmalar da yapılabilir. Hücreler, biyogüvenlik kabini içinde özel bir kültür odasında kültürlendirilmelidir.P32 ATP belirli bir dikkatle ele alınmalıdır. Radyasyondan korumak için kalkan, Geiger sayacı, özel atık toplamak, radyoaktif maruziyeti tespit etmek ve ipuçlarını filtrelemek için kişisel göğüs ve parmak rozetleri.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Rab10 Fosforilasyon Değerlendirilmesi tarafından Parkinson İlişkili LRRK2 Kinas yolu Sorgulama için İnsan Periferik Kan Nötrofil İzolasyon

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Sağlam dokulara ve standart nicel Western Blot kullanarak geliştirme boyunca Protein düzeylerinin karşılaştırılması

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Rho kinase aktivitesinin geçici Inhibisyonu ile ınsan kaynaklı pluripotent kök hücreli türev Kardiyomiyositlerin engraftment artırılması

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...