Name: examination of mitotic and meiotic fission yeast nuclear dynamics by fluorescence live-cell microscopy
Uploaded: 2019-06-24T14:45:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy at JoVE.com

作者们感谢娜塔莉亚·拉·福尔卡德和蒙·拉费尔特为本手稿的编写工作做了一个更愉快的努力。感谢福斯堡实验室的成员,他们凭借自己的洞察力、实验想法和道义支持为完成这项工作做出了贡献。该项目由NIGMS R35 GM118109向SLF支持。

<ol>
	<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy&#8211;tips+and+tools.">Live-cell microscopy&#8211;tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+techniques+to+examine+DNA+replication+in+fission+yeast.">Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast.</a> DNA Replication. (13-41), (2015).</li><li>Lee, J. Y., Kitaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner&#8217;s+guide+to+rigor+and+reproducibility+in+fluorescence+imaging+experiments.">A beginner&#8217;s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).</li><li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis:+an+overview+of+key+differences+from+mitosis.">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859 (2015).</li><li>Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+stress+in+early+S+phase+generates+apparent+micronuclei+and+chromosome+rearrangement+in+fission+yeast.">Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).</li><li>Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+cohesin-based+chromosome+structure+is+essential+for+homologous+chromosome+pairing+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).</li><li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates.">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622 (2012).</li><li>Klutstein, M., Fennell, A., Fern&#225;ndez-&#193;lvarez, A., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+regulates+meiotic+centromere+assembly.">The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).</li><li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates.">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622 (2012).</li><li>Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+yeast+Taz1+protein+is+required+for+meiotic+telomere+clustering+and+recombination.">Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination.</a> Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).</li><li>Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B+prevents+chromosome+arm+separation+defects+by+promoting+telomere+dispersion+and+disjunction.">Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction.</a> Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).</li><li>Mastro, T. L., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+meiotic+crossovers+and+reduced+genome+stability+in+absence+of+Schizosaccharomyces+pombe+Rad16+(XPF).">Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF).</a> Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).</li><li>Escorcia, W., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilization+of+the+replication+fork+protection+complex+disrupts+meiotic+chromosome+segregation.">Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).</li><li>Fennell, A., Fern&#225;ndez-&#193;lvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+and+centromeres+have+interchangeable+roles+in+promoting+meiotic+spindle+formation.">Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).</li><li>Forsburg, S. L., Rhind, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+methods+for+fission+yeast.">Basic methods for fission yeast.</a> Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in enzymology. 470, 759-795 (2010).</li><li>. ImageJ User Guide &#8212; IJ&#8201;1.46 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html</a> (2019)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+DNA+replication+checkpoint+to+MBF+cell&#8208;cycle+transcription+reveals+a+distinct+class+of+G1/S+genes.">Linking DNA replication checkpoint to MBF cell&#8208;cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes.</a> The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).</li><li>Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+anaphase+promoting+complex+substrates+in+S.+cerevisiae.">Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (9), e45895 (2012).</li><li>Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+Rec8+is+required+for+reductional+chromosome+segregation+at+meiosis.">Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis.</a> Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).</li><li>Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+fission+yeast+UNC-13/Munc13+protein+Ync13+in+late+stages+of+cytokinesis.">Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).</li><li>Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+global+Cdc42+guanine+nucleotide+exchange+factors+for+fission+yeast+cell+polarity+are+coordinated+by+microtubules+and+the+Tea1&#8211;Tea4&#8211;Pom1+axis.">Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1&#8211;Tea4&#8211;Pom1 axis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580 (2018).</li><li>Dudin, O., Bendez&#250;, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast.">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+secretory+cargo+transport+within+the+Golgi+apparatus.">Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li><li>Kraft, L. M., Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+mechanism+for+mitochondria-dependent+dynein+anchoring.">A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2019).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

在线虫和美西斯期间进行活细胞成像,在数据采集过程中,在不实质性干扰裂变酵母生理学的情况下,提供检查核动力学的机会。然而,必须谨慎行事,以确保细胞生长到所需的密度,没有环境压力;和梅氏菌病,细胞在终端分化期间成像,而不是太早或太晚。过度的细胞拥挤、饥饿和不适当的生长温度是导致不可重复观测的常见因素。此外,在应变结构期间,测试荧光标记是否干扰目标基因的功能或影响整体细胞健康至关重要。未能仔细检查携带荧光标记的菌株的表型可能会导致在相似基因型上产生不一致和无与伦比的结果。
虽然显微镜的甘蔗垫易于组装,但它们也可能在获取有价值的成像数据方面构成障碍。创建 Agarose 垫非常简单,只需将三张显微镜幻灯片彼此平行放置,在中间幻灯片上分配熔融的甘蔗,以及放置一个横向其他幻灯片顶部的幻灯片即可。然而,组装一种滑动机具设备是很有用的,它允许宽度修改,以制造耐抗、特定情况的角糖垫。提供垫宽度灵活性的简单滑动机包括平台(移液器吸头支架或工作台)、两个显微镜幻灯片和用作垫宽度调节机制的实验室胶带(图1A)。精确的焊盘厚度取决于成像时间要求、甘蔗品牌、温度、盖玻片密封剂、蒸发率等。因此,在数据采集前校准成像系统对于提高技术可重复性并提高活细胞成像1、2、3的质量非常重要。垫面、刚度和构图在长时间图像采集过程中至关重要。Agarose具有低背景荧光,易于成型,并在适当的浓度下,承受蒸发引起的结构变形。此外,将裂变酵母培养基与甘蔗素相结合不会损害图像质量,并允许对多个线粒体和美氏菌周期进行扩展观察。此外,避免任何气泡进行延时显微镜检查也非常重要。在Agarose垫内和样品内,气囊会随着时间的推移而膨胀,导致细胞移动并破坏焦点平面。如果细胞通过盖玻板旋转有效地分散,研究人员可以跟踪几代人的线粒过程以及从核聚变到孢子的中值事件。制作和选择适合成像实验的焊盘需要时间掌握,但一旦实现,将有助于高度信息性的显微镜观察。
与其他方法一样,活细胞显微镜并非没有技术限制。使用荧光标记的蛋白质为实验引入了边界,限制了可以研究的内容的范围。光漂白和光毒性是长时间采集图像的典型问题。它们可以通过不将细胞暴露在短波长下的时间过长或太频繁来抵消。对于涉及GFP、CFP、YFP、mRFP和DsRed的实验,在裂变酵母活细胞成像中使用的典型荧光蛋白,通常采用5-15%的激发光和100-500ms的暴露时间进行常规实验。然而,这些参数根据研究人员的具体实验要求而变化。此外,z-stack 由 9-13 节组成,使用 60x 物镜间距为 0.5 μm 间距,足以解决裂变酵母细胞的厚度。此外,确认荧光标记物不会破坏目标蛋白的正常调节或功能或产生虚假表型也很重要。因此,建议为同一目标基因构建包含不同荧光和亲和标记的菌株,以用不同方法证实观察结果。此外,研究人员有责任确保实验参数可以在实验中重现,并且收集的数据适合下游分析1,3。任何技术都无法取代经过时间考验的严格验证实验系统的做法,通过仔细观察和严格审查荧光信号的线性度。
最后,以不修改原始图像的格式分析显微镜数据至关重要。斐济提供了出色的文档工具来跟踪原始数据测量,并允许研究人员在一个会话中检查不同的单元参数。这些功能,以及丰富的在线教程和广泛的文献报道,使斐济成为测量、分析和呈现活细胞成像数据的重要工具,这些数据描述了裂变酵母在米氏体和美氏症中的核动力学。

活细胞显微镜使研究人员能够在不杀死裂变酵母细胞的情况下检查核动力学,并消除对致命固定物和污渍的需求。除了膜和细胞骨骼外,还可以观察荧光标记蛋白的稳定性、运动、定位和时间,这些蛋白质涉及重要的事件,如染色体复制、重组和分离。运动。通过保持细胞活力和无毒信号检测,有最小的生理入侵。如果正确执行,这种显微镜方法可以减少因延长技术处理或杂散化学反应而产生的混淆效应。此外,在实验中,研究人员可以对裂变酵母的营养和应激状态、增殖效率和凋亡状态进行相关观察,以表明成像参数不当或细胞生理学异常1 ,2,3.
米氏症和美氏菌具有核和细胞分裂的特点。在美西斯,与线粒体相反,遗传含量减半,因为父细胞产生子细胞4。由于活细胞成像除了空间关系之外还提供时间维度,因此可以实时检查大量细胞。活细胞显微镜使研究人员能够利用荧光标记来研究核分裂的动态,其组蛋白5、合辛亚单位6、微管7、中心细胞8、基尼托利9、组分主轴杆体(SPB)10,和染色体乘客复合体(CPC)11。在染色体分离装置之外,活细胞成像也捕获了必要的蛋白质的行为,但不直接参与染色体分离。这些蛋白质的功能已被证明影响复制,染色体重组,核运动和染色体附着到微管12,13,14。这些观察有助于更好地了解细胞事件,其功能成分不适合生物化学或基因检查。随着显微镜技术的新进展,分辨率差、光漂白、光毒性和焦点稳定性等限制将会减少,从而有助于更好地实时观测线粒度和美微核动力学1。 2,3.梅氏菌是特别具有挑战性的,因为它是一个终端分化途径,需要密切关注时间。
该协议的目的是提出一种相对简单的方法来检查线突和美虫病中的实时裂变酵母核动力学。为此,必须使用未暴露于环境压力的细胞,制备能够承受长时间成像的甘蔗片,并在密度下安装细胞,以利于单细胞动力学的可视化。此外,该协议利用携带荧光标记蛋白质的细胞,作为核动力学(Hht1-mRFP或Hht1-GFP)、染色体分离(Sad1-DsRed)、细胞骨架动力学(Atb2-mRFP)、转录标记在 G1/S (Tos4-GFP) 中激活,并在梅氏菌(Rec8-GFP)中实现内聚稳定。该方法还引入了额外的核和细胞标记(表一),这些标记可用于不同的组合,以解决有关特定细胞过程的问题。此外,还介绍了基本的斐济工具,可帮助研究人员处理活细胞图像并分析不同类型的数据。这种方法的优势源于对蛋白质动力学、定时和稳定性的实时观察,来描述正确执行线虫和美虫病不可或缺的过程。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60x Plan Apochromat objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>AMEP4694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>7558B</td>
			<td>IB4917-10 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer rotator</td>
			<td>Stovall</td>
			<td>US Patent #4.702.610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-6768-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H20,</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3306-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-0759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Convolve 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSnap HQ CCD camera</td>
			<td>Roper</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H20,</td>
			<td>END</td>
			<td>CX-2185-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaVision deconvolution fluorescence microscope</td>
			<td>GE Healthcare/Applied Precision</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffraction PSF 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2023;1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl2&#183;6H2O</td>
			<td>END</td>
			<td>FX9259-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat plate</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>Thermo Lyne</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris deconvolution software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Shell lab</td>
			<td>#3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iterative Deconvolve 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>6858-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7387-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5626-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract (ME)</td>
			<td>MP</td>
			<td>4103-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H20</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0288-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4,</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>6192-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-0878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2S04</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>8024-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid,</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pantothenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>s80119WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pombe glutamate medium (PMG)</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2060-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>softWorx v3.3 image processing software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sporulation Medium powder</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>1821-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allwgra 6KR xentrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0847-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Equaline</td>
			<td>F79658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.03753.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract plus supplements (YES)</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2011-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4382-04</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of mitotic and meiotic fission yeast nuclear dynamics by fluorescence live-cell microscopy

活细胞成像是一种显微镜技术,用于检查活细胞中的细胞和蛋白质动力学。这种成像方法没有毒性,一般不会干扰细胞生理学,并且需要最少的实验处理。低水平的技术干扰使研究人员能够研究细胞的多个周期的线粒,并观察从头到尾的美虫病。使用荧光标记,如绿色荧光蛋白 (GFP) 和红色荧光蛋白 (RFP),研究人员可以分析不同的因素,其功能对转录、DNA 复制、内聚和分离等过程非常重要。结合使用斐济(免费、优化的 ImageJ 版本)的数据分析,活细胞成像提供了评估蛋白质运动、定位、稳定性和定时以及核动力学和染色体分离的各种方法。然而,与其他显微镜方法一样,活细胞成像受光的内在特性的限制,在高放大倍率下限制了分辨率,并且对高波长的光漂白或光毒性也非常敏感频率。然而,通过一些谨慎,研究人员可以通过仔细选择正确的条件、菌株和荧光标记来绕过这些物理限制,以便适当可视化线粒体和中微事件。

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy at JoVE.com

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

在这里,我们介绍活细胞成像,这是一种无毒显微镜方法,使研究人员能够研究在米氏体炎和美氏菌病期间活裂变酵母细胞中的蛋白质行为和核动力学。

荧光活细胞显微镜对微孔裂变酵母核动力学的检测

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

活细胞显微镜使研究人员能够实时研究裂变酵母核动力学的线粒体和美病。这种方法的强度来自于研究正常生理条件下活细胞的核过程，从而消除了对有毒固定剂和污渍的需要。该技术解决了与蛋白质计时、稳定性和流动性有关的问题，这些问题可能不易用于遗传或生物力学操作。在成像前密切关注裂变酵母细胞的健康和健康至关重要。始终检查形态和生长特征，以确保实验结果的一致性。该协议显示了相对简单的显微镜幻灯片，当掌握正确可以提高长期活细胞成像的一致性和可重复性。要开始从低温唤醒板中拾取细胞物质，请把它拖到 YES 板上，并在 25 摄氏度或 32 摄氏度时孵育它们，具体取决于酵母基因型，以唤醒低温保存中的裂变酵母菌株。然后使用无菌循环从觉醒的裂变酵母菌株中的单个菌落中挑选细胞，并接种到含有三毫升 YES 液体介质的试管中。将管以 150 至 220 rpm 的速度放在摇床中，在 25 或 32 摄氏度下在 25 或 32 摄氏度下生长到后期对数阶段，所需的光学密度读数为 0.7 至 1.0。将培养的 10 微升转移到显微镜幻灯片中。戴上盖玻片，放在显微镜下，检查细胞形态和营养状态。要建立一个显微镜幻灯片的线粒体或梅氏分析，首先添加两克阿加罗斯在500毫升的烧瓶中含有100毫升的最小介质加上补充的线粒体或液体孢子介质的梅氏病。在微波炉中以 60% 的功率以 10 秒的增量加热 agarose 溶液，或将烧杯放在 55 摄氏度的水浴中 10 分钟。旋转解决方案，确保高效熔化。在移液器尖端支架上设置两个显微镜幻灯片，顶部幻灯片位于两端的两叠实验室胶带上，作为交叉形状的支撑。将两个幻灯片之间的距离调整到大于两毫米，以便在以下步骤中形成厚垫，以便进行长时间成像。在室温下冷却熔融的气糖一分钟后，拆下顶部滑轨，并使用宽孔移液器尖端在底部滑轨上分配 50 到 100 微升以进行点。在 agarose 冷却之前，将顶部幻灯片放在顶部，生成直径约为 1 和 1/2 至 2 厘米的扩散垫。最佳活细胞成像对于后续数据处理步骤至关重要。确保消除熔融气中的任何气垫，并创建一个薄垫，用于成像时间超过四个小时。为了检查线粒体事件生长细胞从启动培养物在液体EMM或PMG加补充过夜。将培养的一毫升转移到一个宽小的培养器中，并在波长为595纳米的分光光度计上测量。当光密度达到0.4时，细胞生长被认为是中日志阶段。然后在1，375次g下将一毫升的细胞悬浮液离心一分钟。去除上一提液，在最小介质中重新暂停细胞颗粒，并补充至最终体积为100微升。要图像的美蒂事件生长细胞从启动培养在最小的中等加补充过夜。当 595 纳米的光密度在 0.7 和 1 之间时，细胞生长被认为是晚对数阶段。接下来，从晚日志培养物获得500微升各配合型菌株，H阴性与H阳性，并结合使一毫升细胞悬浮。将细胞以1，375倍g离心一分钟。取出上清液，将颗粒重新在一毫升液体麦芽糖提取物中。重复麦芽糖提取物再洗三次，以确保有效的营养去除。最后麦芽糖提取物洗涤后，将细胞重新倒入一毫升麦芽糖提取物中，将混合物转移到含有9毫升麦芽糖提取物的50毫升烧瓶中。在 22 至 25 摄氏度的最小转速下孵育 12 至 16 小时，转速在 50 至 100 rpm 之间。大量自絮产生的圆形裂变酵母团的出现表明有效的交配。接下来，以1，375次g的1，375倍g进行1毫升的交配培养，并离心机一分钟。取出750微升的上一液，并重新暂停剩余的上一液中的细胞。漩涡大力五秒钟，以扰乱团块。在2%的阿加罗斯垫上分配20微升的线粒体或美的细胞悬浮液。通过反转幻灯片并将其放在无绒纸巾顶部两到三秒钟，去除多余的介质。翻转幻灯片，轻轻将玻璃盖玻片放在垫的顶部，确保不会产生气泡。创建一个细胞单层顺时针旋转盖玻片用食指一个完整的转弯的分裂细胞或两个全转的梅病细胞。确保细胞物质分散在阿加罗斯垫上，从而更好地分离单细胞或阿西。借助一根小木棒，沿盖玻片边缘分配熔融碳氢化合物密封剂，以密封每个芳油垫。一旦阿加罗斯垫被密封，就把它放在显微镜台上。打开温度室并设置为所需温度。将带湿纸巾的盘子放入室内，以控制显微镜系统的湿度。让它在适当的成像条件下平衡 10 到 15 分钟。这允许任何剩余的气泡消散，并且任何最后一分钟的气糖转移都会发生。使用 40 倍目标查找适当的图像视野。切换到 60 倍目标，开始数据采集。在控制显微镜功能的软件中，选择与观测中荧光波最匹配的显微镜过滤器集。调整激发波长以匹配使用的荧光团，使用产生一致信号的最低激发功率，并使用四到八小时的曝光时间生成可接受的可量化和可重复的成像数据。每小时至少收集六个采集时间点。在图像采集软件中，选择至少一个荧光通道来获取数据，并采用由 13 个节组成的 Z 股，间距为 0.5 微米。在斐济软件中，通过选择插件菜单下的"生物格式导入程序"功能上传已解构的图像。在"导入选项"弹出窗口中，选择"超级堆栈""默认颜色模式"，选中"自动缩放"并按"确定"按钮。通过侧向滚动底部各条，确保显示的窗口具有正确的荧光通道和时间范围数。保存为不压缩数据的 Tiff 文件。然后在"分析"菜单下使用"设置测量"选项选择不同的参数。例如：面积、最小最大灰色值、集成密度、平均灰色值、中位数、堆栈位置、周长和显示标签。选择"颜色"并单击"通道工具"。在"通道"弹出窗口中，检查将测量强度或面积的颜色通道。选择"图像"，然后键入并单击 32 位。选择"图像"菜单下的"调整"和"阈值"功能。选中"深色背景"框，选择"默认"方法，然后选择"红色"以覆盖感兴趣的信号。使用魔杖工具突出显示每个感兴趣的结构，然后按键盘上的字母 T 将所选 ROI 添加到弹出式 ROI 管理器窗口中。接下来，打开压缩的 ROI 文件夹以加载 ROI 管理器，然后单击左侧面板中的每个 ROI 标识符。从"分析"菜单中选择"度量"，并在每个 ROI 标识符上重复此命令，以量化图像堆栈所有切片中感兴趣的对象。将结果另存为 CSV 文件，用于统计分析。在这项研究中，如果细胞因营养限制或过度生长而挨饿，它们将显示过多的真空和细胞大小的减小。对数细胞显示活性DNA复制和细胞分裂，以及泛核 Tos4-GFP 表达和Sd1-DsRed foci分离。如果交配失败，就像细胞没有足够的氮气时一样，会阻止它们进入脑膜。显示了一对进行卡约加米的裂变细胞。交配细胞悬浮液的强健的絮凝增加细胞对细胞的相互作用，从而表明成功的交配和高效的美的诱导。Zygotic asci 具有多种形式，包括锯齿形和香蕉细胞形状。在细胞从元相过渡到telophase时，第一个变化涉及元相核大小的收缩，而第二个变化则显示核在相位期间分裂。除了与线粒体细胞共享一些分离动力学外，在同源重组期间，美的细胞表现出核振荡，在相相II.It结束时进一步减少核苷酸，研究人员有责任确保实验参数能够在整个实验中重现，并且收集的数据适合下游分析。活细胞成像使研究者能够仔细研究分粒和脑膜的核分裂机制。随着荧光标签和显微镜功能的改进，我们可以观察到的过程的数量和类型将增加。

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

F - actin的动力学通过荧光活细胞成像斑点显微镜（密克罗尼西亚）

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

科研

生物学

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

有丝分裂的siRNA转染后的时间推移成像

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

裂殖酵母的活细胞定量荧光显微镜分析

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

获取荧光时间推移电影的芽殖酵母和分析单细胞动力学移植物

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

考试<em&gt;果蝇</em幼虫气管终端细胞光镜

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

在造血干细胞和祖细胞的成年小鼠颅骨骨髓体内四维跟踪

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

裂殖酵母性生命周期的显微镜

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

在裂殖酵母中Cytokinetic活动的时空分析

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

活体细胞荧光显微镜观察微生物细胞生长过程中的基本过程

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

活细胞成像，以评估在斜接主轴扰动后元相定时和细胞命运的动态

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...