Name: examination of mitotic and meiotic fission yeast nuclear dynamics by fluorescence live-cell microscopy
Uploaded: 2019-06-24T14:45:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Natalia La Fourcade og mon LaFerte for at gøre forberedelsen af dette manuskript til en mere fornøjelig bestræbelse. Takket være medlemmer af Forsburg Lab, der bidrog til færdiggørelsen af dette arbejde med deres indsigt, eksperiment ideer, og moralsk støtte. Dette projekt blev støttet af NIGMS R35 GM118109 til SLF.

<ol>
	<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy&#8211;tips+and+tools.">Live-cell microscopy&#8211;tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+techniques+to+examine+DNA+replication+in+fission+yeast.">Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast.</a> DNA Replication. (13-41), (2015).</li><li>Lee, J. Y., Kitaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner&#8217;s+guide+to+rigor+and+reproducibility+in+fluorescence+imaging+experiments.">A beginner&#8217;s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).</li><li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis:+an+overview+of+key+differences+from+mitosis.">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859 (2015).</li><li>Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+stress+in+early+S+phase+generates+apparent+micronuclei+and+chromosome+rearrangement+in+fission+yeast.">Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).</li><li>Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+cohesin-based+chromosome+structure+is+essential+for+homologous+chromosome+pairing+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).</li><li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates.">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622 (2012).</li><li>Klutstein, M., Fennell, A., Fern&#225;ndez-&#193;lvarez, A., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+regulates+meiotic+centromere+assembly.">The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).</li><li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates.">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622 (2012).</li><li>Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+yeast+Taz1+protein+is+required+for+meiotic+telomere+clustering+and+recombination.">Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination.</a> Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).</li><li>Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B+prevents+chromosome+arm+separation+defects+by+promoting+telomere+dispersion+and+disjunction.">Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction.</a> Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).</li><li>Mastro, T. L., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+meiotic+crossovers+and+reduced+genome+stability+in+absence+of+Schizosaccharomyces+pombe+Rad16+(XPF).">Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF).</a> Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).</li><li>Escorcia, W., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilization+of+the+replication+fork+protection+complex+disrupts+meiotic+chromosome+segregation.">Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).</li><li>Fennell, A., Fern&#225;ndez-&#193;lvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+and+centromeres+have+interchangeable+roles+in+promoting+meiotic+spindle+formation.">Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).</li><li>Forsburg, S. L., Rhind, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+methods+for+fission+yeast.">Basic methods for fission yeast.</a> Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in enzymology. 470, 759-795 (2010).</li><li>. ImageJ User Guide &#8212; IJ&#8201;1.46 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html</a> (2019)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+DNA+replication+checkpoint+to+MBF+cell&#8208;cycle+transcription+reveals+a+distinct+class+of+G1/S+genes.">Linking DNA replication checkpoint to MBF cell&#8208;cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes.</a> The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).</li><li>Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+anaphase+promoting+complex+substrates+in+S.+cerevisiae.">Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (9), e45895 (2012).</li><li>Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+Rec8+is+required+for+reductional+chromosome+segregation+at+meiosis.">Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis.</a> Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).</li><li>Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+fission+yeast+UNC-13/Munc13+protein+Ync13+in+late+stages+of+cytokinesis.">Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).</li><li>Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+global+Cdc42+guanine+nucleotide+exchange+factors+for+fission+yeast+cell+polarity+are+coordinated+by+microtubules+and+the+Tea1&#8211;Tea4&#8211;Pom1+axis.">Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1&#8211;Tea4&#8211;Pom1 axis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580 (2018).</li><li>Dudin, O., Bendez&#250;, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast.">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+secretory+cargo+transport+within+the+Golgi+apparatus.">Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li><li>Kraft, L. M., Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+mechanism+for+mitochondria-dependent+dynein+anchoring.">A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2019).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Live-Cell Imaging under mitose og meiose giver mulighed for at undersøge nuklear dynamik uden væsentligt at forstyrre fission gær fysiologi under dataindsamling. Der skal dog udvises forsigtighed for at sikre, at cellerne vokser til de ønskede tætheder uden miljømæssige belastninger. og for meiosis, at cellerne er afbildet i tidspunktet for den terminale differentiering og ikke for tidligt eller sent. Overskydende cellulære fortrængning, sult og uhensigtsmæssige vækst temperaturer er almindelige faktorer, der bidrager til irreproducerbare observationer. Hertil kommer, under stammen byggeri, er det afgørende at teste, at fluorescerende Tags ikke forstyrrer funktionerne af Target gener eller indvirkning samlede celle egnethed. Manglende nøje inspektion af fænotyper af stammer, der transporterer fluorescerende markører kan resultere i inkonsekvente og uforlignelige resultater på tværs af lignende genotyper.
Selvom mikroskop agopstået puder er enkle at samle, kan de også udgøre en forhindring i at få værdifulde billeddannelse data. Oprettelse af agrose Pads er så simpelt som at placere tre mikroskop glider parallelt med hinanden, dispensering smeltet agopstået på den midterste slide, og sætte et dias, der krydser toppen af de andre slides. Det er imidlertid nyttigt at samle et slide-Maker apparat, der giver mulighed for bredde modifikationer til fremstilling af resistente, situationsspecifikke agrose Pads. En simpel slide-Maker, der giver pad bredde fleksibilitet består af en platform (pipettespidser indehaveren eller bænken), to mikroskop slides, og lab tape fungerer som pad-bredde justeringsmekanismen (figur 1a). Nøjagtig pad tykkelse vil afhænge af Imaging tid krav, agopstået mærke, temperatur, dækglas fugemasse, fordampning sats, etc. Det er derfor vigtigt at kalibrere billed systemet før dataindsamlingen for at øge den tekniske reproducerbarhed og forbedre kvaliteten af levende celle billeder1,2,3. Pad overflade, stivhed, og sammensætning er afgørende ved længerevarende billed erhvervelse. Agopstået har lav baggrunds fluorescens, kan let formes, og i den relevante koncentration, modstår strukturel deformation på grund af fordampning. Desuden, kombinere fission gær medier med agopstået ikke kompromitterer billedkvaliteten og giver mulighed for udvidet observation af flere mitoser og meiose cyklusser. Det er også vigtigt at undgå luftbobler for time-lapse mikroskopi. Indvendige agrose Pads og inden i prøven, luftlommer ekspandere over tid, forårsager celle-skiftende og forstyrre brændfly. Forudsat celler effektivt spredes fra hinanden ved dækglas rotation, kan forskerne følge mitotiske processer på tværs af flere generationer og meiotiske begivenheder fra nuklear fusion til sporulation. At gøre og vælge den rigtige pad til billeddannelse eksperimenter tager tid at mestre, men når det er opnået, kan bidrage til meget informative mikroskop observationer.
Som det er tilfældet med andre metoder, er levende celle mikroskopi ikke fri for tekniske begrænsninger. Brugen af fluorescently-mærkede proteiner introducerer grænser til eksperimenter, der begrænser omfanget af, hvad der kan undersøgt. Foto-blegning og foto-toksicitet er problemer typisk for langvarig billed erhvervelse. De kan modvirkes ved ikke at udsætte celler for korte bølgelængder for længe eller for ofte. For eksperimenter, der involverer GFP, CFP, YFP, mRFP, og DsRed, typiske fluorescerende proteiner anvendes i fission gær Live-Cell Imaging, det er almindeligt at ansætte 5-15% excitation lys og 100-500 MS eksponeringstid for rutine eksperimenter. Disse parametre ændrer sig dog i henhold til forskeres specifikke eksperiment krav. Desuden z-stakke består af 9-13 sektioner med 0,5 μm afstand ved hjælp af en 60x mål er nok til at løse tykkelsen af en fission gær celle. Desuden er det vigtigt at bekræfte, at fluorescerende markører ikke forstyrrer korrekt regulering eller funktion af målproteiner eller genererer spuriøse fænotyper. Det er derfor tilrådeligt at konstruere stammer, der indeholder forskellige fluorescerende og affinitets Tags for det samme målgen til at underbygge observationer med forskellige midler. Det er endvidere forskernes ansvar at sikre, at eksperimentelle parametre kan gengives på tværs af eksperimenter, og at de indsamlede data er egnede til downstream-analyse1,3. Ingen teknologi kan erstatte den tidstestede praksis med omhyggeligt at validere eksperimentelle systemer ved omhyggelig observation og grundig undersøgelse af linearitet i påvisning fluorescerende signaler.
Endelig er det afgørende at analysere mikroskopi data i formater, der ikke ændrer RAW-billeder. Fiji giver fremragende dokumentationsværktøjer til at holde styr på rå data målinger og giver forskerne mulighed for at undersøge forskellige celle parametre i en enkelt session. Disse funktioner, samt dens rigdom af online tutorials og omfattende litteratur dækning, gøre Fiji et vigtigt redskab til at måle, analysere og præsentere levende celle billeddannelse data, der beskriver den nukleare dynamik af fissions gær i mitose og meiosis.

Levende celle mikroskopi giver forskerne mulighed for at undersøge nuklear dynamik uden at dræbe fissions gærceller og eliminerer behovet for dødbringende fikater og pletter. Det er muligt at observere stabilitet, bevægelse, lokalisering og timing af fluorescently mærkede proteiner, der er involveret i vigtige begivenheder såsom kromosom replikation, rekombination, og adskillelse, ud over membranen og cytoskelet Bevægelser. Ved at opretholde cellelevedygtighed og ikke-giftige signaldetektering, der er minimal fysiologisk indtrængen. Når det udføres korrekt, denne mikroskopi metode kan reducere forstyrrende virkninger, der opstår fra den udvidede tekniske håndtering eller fra falsk kemisk reaktivitet. Endvidere, under et eksperiment, forskere kan gøre relevante observationer af fission gær ernæringsmæssige og stress tilstande, proliferativ effektivitet, og apoptotiske status, der indikerer uhensigtsmæssige Imaging parametre eller unormal celle fysiologi1 ,2,3.
Mitose og meiose er karakteriseret ved nuklear og cellulær division. I meiosis, i modsætning til mitose, er genetisk indhold halveret som stamceller giver anledning til datter celler4. Da Live-Cell Imaging giver en tidsmæssig dimension ud over det rumlige forhold, kan et stort antal celler undersøges i realtid. Live-Cell mikroskopi har gjort det muligt for forskerne at undersøge dynamikken i nuklear division ved hjælp af fluorescerende Tags for histoner5, sammenhængende under enheder6, mikrotubuli7, centromeres8, kinetochores9, komponenter af spindel pole Body (SPB)10, og dem af kromosom passager Complex (CPC)11. Uden for kromosom segregation apparat, Live-Cell Imaging har også fanget opførsel af proteiner nødvendigt, men ikke direkte involveret i kromosom adskillelse. Funktionen af disse proteiner har vist sig at påvirke replikation, kromosom rekombination, nuklear bevægelse, og kromosom fastgørelse til mikrotubuli12,13,14. Disse observationer har bidraget til en bedre forståelse af cellulære hændelser, hvis funktionelle komponenter ikke var modtagelige for biokemiske eller genetiske undersøgelser. Med nye fremskridt inden for mikroskopi teknologi, begrænsninger såsom dårlig opløsning, foto blegning, fototoksicitet, og fokus stabilitet vil mindske, og dermed lette bedre real-time observationer af mitotisk og meiotisk nuklear dynamik1, 2,3. Meiosis er særlig udfordrende, da det er en terminaldifferentierings vej, der kræver nøje opmærksomhed på timing.
Formålet med denne protokol er at fremlægge en forholdsvis enkel metode til undersøgelse af realtids fission af fissions gær i mitose og meiosis. For at opnå dette, er det nødvendigt at bruge celler, der ikke har været udsat for miljømæssig stress, forberede agrose Pads, der kan modstå langvarig billeddannelse, og montere celler på tætheder, som letter visualisering af enkelt celle dynamik. Desuden gør denne protokol brug af celler, der bærer fluorescently mærkede proteiner, som fungerer som nyttige markører for nuklear kinetik (Hht1-mRFP eller Hht1-GFP), kromosom adskillelse (Sad1-DsRed), cytoskelet dynamik (Atb2-mRFP), transkriptional aktivering i G1/S (Tos4-gfp) og samhørigheds stabilitet i meiose (Rec8-gfp). Denne metode introducerer også yderligere nukleare og cytosolisk markører (tabel I), der kan bruges i forskellige kombinationer til at løse spørgsmål om specifikke cellulære processer. Endvidere, grundlæggende Fiji værktøjer er featured for at hjælpe forskere behandle Live-celle billeder og analysere forskellige typer af data. Styrken af denne tilgang stammer fra brugen af real-time observationer af protein dynamik, timing, og stabilitet til at beskrive processer, der er integreret for korrekt udførelse af mitose og meiosis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60x Plan Apochromat objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>AMEP4694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>7558B</td>
			<td>IB4917-10 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer rotator</td>
			<td>Stovall</td>
			<td>US Patent #4.702.610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-6768-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H20,</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3306-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-0759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Convolve 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSnap HQ CCD camera</td>
			<td>Roper</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H20,</td>
			<td>END</td>
			<td>CX-2185-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaVision deconvolution fluorescence microscope</td>
			<td>GE Healthcare/Applied Precision</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffraction PSF 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2023;1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl2&#183;6H2O</td>
			<td>END</td>
			<td>FX9259-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat plate</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>Thermo Lyne</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris deconvolution software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Shell lab</td>
			<td>#3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iterative Deconvolve 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>6858-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7387-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5626-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract (ME)</td>
			<td>MP</td>
			<td>4103-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H20</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0288-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4,</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>6192-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-0878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2S04</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>8024-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid,</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pantothenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>s80119WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pombe glutamate medium (PMG)</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2060-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>softWorx v3.3 image processing software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sporulation Medium powder</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>1821-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allwgra 6KR xentrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0847-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Equaline</td>
			<td>F79658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.03753.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract plus supplements (YES)</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2011-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4382-04</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of mitotic and meiotic fission yeast nuclear dynamics by fluorescence live-cell microscopy

Live-Cell Imaging er en mikroskopi teknik, der anvendes til at undersøge celle-og protein dynamik i levende celler. Denne Imaging metode er ikke giftigt, generelt ikke forstyrrer celle fysiologi, og kræver minimal eksperimentel håndtering. De lave niveauer af teknisk interferens gør det muligt for forskerne at studere celler på tværs af flere cyklusser af mitose og observere meiose fra start til. Ved hjælp af fluorescerende Tags såsom grøn fluorescerende protein (GFP) og rødt fluorescerende protein (RFP), forskere kan analysere forskellige faktorer, hvis funktioner er vigtige for processer som transkriptionen, DNA-replikering, samhørighed, og adskillelse. Kombineret med dataanalyse ved hjælp af Fiji (en gratis, optimeret ImageJ version), Live-Cell Imaging tilbyder forskellige måder at vurdere protein bevægelse, lokalisering, stabilitet, og timing, samt nuklear dynamik og kromosom adskillelse. Men som det er tilfældet med andre mikroskopi metoder, er levende celle billeddannelse begrænset af de iboende egenskaber af lys, som sætter en grænse for opløsningen magt ved høje forstørrelser, og er også følsom over for foto blegning eller fototoksicitet ved høj bølgelængde Frekvenser. Men, med en vis omhu, efterforskere kan omgå disse fysiske begrænsninger ved omhyggeligt at vælge de rigtige betingelser, stammer, og fluorescerende markører for at muliggøre en passende visualisering af mitotiske og meiotiske hændelser.

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy at JoVE.com

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Her præsenterer vi Live-Cell Imaging, som er en ikke-giftige mikroskopi metode, der giver forskerne mulighed for at studere protein adfærd og nuklear dynamik i levende fission gærceller under mitose og meiosis.

Undersøgelse af mitotisk og meiotisk fission gær nuklear dynamik ved fluorescens levende celle mikroskopi

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Levende celle mikroskopi giver forskerne mulighed for at studere fission gær nukleardynamik i mitose og meiose i realtid. Styrken af denne metode kommer fra at studere nukleare processer i levende celler under normale fysiologiske forhold, som eliminerer behovet for giftige fiksativer og pletter. Denne teknik omhandler spørgsmål relateret til protein timing, stabilitet og mobilitet, der ikke kan være modtagelige for genetisk eller biomekanisk manipulation.Det er afgørende at være meget opmærksomme på sundhed og fitness af fissions gær celler før billeddannelse. Undersøg altid morfologi og vækstegenskaber for at sikre konsistens i resultaterne på tværs af eksperimenter. Denne protokol viser den relativt enkle måde at forberede mikroskop dias, når mestrer korrekt kan forbedre konsistensen og reproducerbarheden af langvarig levende celle billeddannelse.At begynde afhente celle stof fra kryogene vågne op plade, Streak det på JA plader, og inkubere dem ved 25 grader Celsius eller 32 grader Celsius afhængigt af gær genotype at vågne op fission gær stammer fra kryogen konservering. Brug derefter en steril løkke til at plukke celler fra de enkelte kolonier i de vækkede fissionsgærstammer og inokuler dem i reagensglas, der indeholder tre milliliter JA flydende medium. Placer rørene i en shaker på 150 til 220 rpm at vokse på 25 eller 32 grader Celsius natten til sen-log fase med en ønsket optisk tæthed læsning af 0,7 til 1,0.Overfør 10 mikroliter af kulturen til et mikroskop dias. Sæt en dækslæd på og placere den under et mikroskop for at kontrollere for korrekt celle morfologi og ernæringsmæssige tilstand. For at oprette et mikroskop dias for mitose eller meiose analyse først tilføje to gram agarose i 500-milliliter kolbe indeholder 100 milliliter af enten minimal medium plus kosttilskud for mitose eller flydende sporulerende medium for meiose.Varm agaroseopløsningen i en mikrobølgeovn ved 60% effekt i intervaller på 10 sekunder, eller anlæg bægerglasset i et 55 grader Celsius-vandbad i 10 minutter. Hvirvler opløsningen for at sikre effektiv smeltning. Opsæt to mikroskopdias på en pipettespidsholder, hvor den øverste slide hviler på to stakke med labtape i begge ender som støtte, der laver en tværgående form.Juster afstanden mellem de to dias til større end to millimeter for at danne en tyk pude i de følgende trin for langvarig billedbehandling. Efter afkøling af det smeltede agarose i et minut ved stuetemperatur skal du fjerne den øverste rutsjebane og bruge en bred borepipettespids til at dispensere 50 til 100 mikroliter på det nederste dias for at gøre en plet. Før agarose køler ned placere den øverste slide på toppen for at generere en spredning pad på omkring en og 1/2 til to centimeter i diameter.Optimal live cellebilleddannelse er afgørende for efterfølgende databehandlingstrin. Sørg for at fjerne eventuelle luftkugler i det smeltede agarose og lav en tynd pude til billeddannelsesperioder på mere end fire timer. At undersøge mitotiske begivenheder vokse celler fra starter kulturer i enten flydende EMM eller PMG plus kosttilskud natten over.Overfør en milliliter af kulturen til en kuvette, og mål på spektrofotometeret ved en bølgelængde på 595 nanometer. Cellevæksten betragtes midt i logfasen, når den optiske tæthed når 0,4. Derefter centrifuge en milliliter af cellen suspension ved 1, 375 gange g i et minut.Fjern supernatanten og resuspend cell pellet i minimal medium plus kosttilskud til et endeligt volumen på 100 mikroliter. At billedet meiotiske begivenheder vokse celler fra starter kulturer i minimal medium plus kosttilskud natten over. Cellevækst betragtes som senlogfase, når den optiske tæthed ved 595 nanometer er mellem 0,7 og 1.Dernæst fra de sene log kulturer opnå 500 mikroliter af hver mate type stamme, H negativ og H positiv, og kombineres for at gøre en milliliter celle suspension. Centrifuge cellerne ved 1, 375 gange g i et minut. Fjern supernatanten og opsplit pellet i en milliliter flydende maltoseekstrakt.Gentag maltoseekstraktet vaskes tre gange mere for at sikre effektiv fjernelse af næringsstoffer. Efter det sidste maltoseekstrakt skal cellerne opsbruges i en milliliter maltoseekstrakt og overføres blandingen til en 50 milliliterkolbe indeholdende ni milliliter maltoseekstrakt. Inkubere i 12 til 16 timer ved 22 til 25 grader Celsius på en minimal rotationshastighed mellem 50 og 100 rpm.Udseendet af mange runde fission gær klumper som følge af rigelige selv-flokulation indikerer effektiv parring. Dernæst skal du tage en en-milliliter prøve af parring kultur og centrifuge ved 1, 375 gange g i et minut. Fjern 750 mikroliter af supernatanten og opsbrug cellerne i den resterende supernatant.Vortex kraftigt i fem sekunder for at forstyrre klumper. Dispensere 20 mikroliter af enten en mitotisk eller meiotisk celle suspension på en 2% agarose pad. Fjern eventuelt overskydende medium ved at vende diaset og sætte det på toppen af fnugfri køkkenrulle i to til tre sekunder.Vend sliden og læg forsigtigt en glasdækslæd på toppen af puden, så der ikke opstår luftbobler. For at oprette en celle monolag rotere coverslip med uret med pegefingeren for en fuld tur for mitose celler eller to fulde sving for meiose celler. Sørg for, at cellestofet spredes over agarosepuden, hvilket giver mulighed for bedre adskillelse af enkelte celler eller asci.Ved hjælp af en lille træpind dispensere smeltet kulbrinte fugemasse langs kanterne af coverslip at forsegle hver agarose pad. Når agarosepuden er forseglet, skal den på mikroskopstadiet. Tænd for temperaturkammeret og sæt det til den ønskede temperatur.Anlæg en plade med en våd køkkenrulle i kammeret for at styre luftfugtigheden i mikroskopsystemet. Lad det ligevægte i 10 til 15 minutter ved de relevante billeddannelsesforhold. Dette gør det muligt for eventuelle resterende luftbobler at sprede og eventuelle sidste-øjebliks agarose skift at forekomme.Brug 40X-målsætningen til at finde passende synsfelter, der skal afbildes. Skift til 60X-målsætningen for at starte dataindsamlingen. I den software, der styrer mikroskop funktion vælge mikroskop filter sæt, der bedst matcher fluorophores under observation.Juster excitationsbølgelængderne, så de svarer til de anvendte fluorophores, anvend den laveste excitationseffekt, der giver et ensartet signal, og brug eksponeringstider på fire til otte timer til at generere acceptable, men kvantificerbare billeddannelsesdata. Saml mindst seks anskaffelsestidspunkter hver time. I billedsamlingssoftwaren skal du vælge mindst én fluorescenskanal, hvorfra der kan hentes data og anvendes et Z-lager bestående af 13 sektioner med en afstand på 0,5 mikrometer.I Fiji-softwaren uploade et deconvolved billede ved at vælge Bio-Formater Importør funktion under plug-ins menuen. Vælg Hyperstack, Standardfarvetilstand i pop op-vinduet Importindstillinger, markér Autoskalering, og tryk på knappen OK. Sørg for, at det viste vindue har det korrekte antal fluorescenskanaler og tidsrammer ved at rulle sidelæns på de respektive søjler nederst.Gem som en Tiff-fil, der ikke komprimerer data. Under menuen Analysér skal du bruge indstillingen Angiv målinger til at vælge forskellige parametre. F.eks.:Område, Min max gråværdi, Integreret tæthed, Middelgråværdi, Median, Stakposition, Omkreds og Vis etiket.Vælg Farve, og klik på kanalværktøjet. I pop op-vinduet Kanaler skal du kontrollere den farvekanal, som intensiteten eller området skal måles for. Vælg Billede, og skriv derefter og klik på 32-bit.Vælg funktionerne Juster og Tærskel under menuen Billede. Markér feltet Mørk baggrund, vælg standardmetoden, og vælg Rød for at overlejre interessesignalerne. Brug tryllestavsværktøjet til at fremhæve hver struktur af interesse og trykke på bogstavet T på tastaturet for at føje det valgte investeringsafkast til pop op-vinduet til investeringsafkastet.Åbn derefter mappen med et zippet investeringsafkast for at indlæse roi-chefen, og klik på hvert investeringsafkast-id i venstre sidepanel. Vælg Målpunkt i menuen Analysér, og gentag denne kommando i hvert investeringsafkast-id for at kvantificere de objekter, der er interessepunkter i alle udsnit af billedstakken. Gem resultaterne som en CSV-fil til statistisk analyse.I denne undersøgelse, hvis celler sulter på grund af næringsstof begrænsning eller overvækst, de vil vise overskydende vakuoler og nedsat cellestørrelse. Logaritmiske celler viser aktiv DNA replikation og celledeling, samt pan-nukleare Tos4-GFP udtryk og Sad1-DsRed foci separation. Undladelse af at parre sig, som det er tilfældet, når cellerne ikke er tilstrækkeligt udsultet af kvælstof, vil forhindre dem i at komme ind meiose.Et par fissionsceller, der gennemgår karyogami, vises. Robust flokkulering af parringscelleaffjedringen øger celle-til-celle interaktion og indikerer således vellykket parring og effektiv meiotisk induktion. Zygotic asci antager flere former, herunder zig-zag og banan celle figurer.I mitose som celler overgang fra metafase til telophase, den første ændring indebærer en sammentrækning af nuklear størrelse i metafase, mens den anden viser kernen opdeling under anafase. Ud over at dele nogle adskillelsesdynamik med mitotiske celler udviser meiotiske celler nuklear oscillation under homolog rekombination og yderligere reduktion af nukleosider i slutningen af anaphase II.It er forskernes ansvar at sikre, at eksperimentparametre kan gengives på tværs af eksperimenter, og at de indsamlede data er egnede til downstream-analyse. Live celle billeddannelse har gjort det muligt for efterforskere at undersøge i detaljer mekanikken i nukleare division i mitose og meiose.Som fluorescerende tags og mikroskop kapaciteter forbedre antallet og typen af processer, vi kan observere vil stige.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitative levende celler fluorescens-mikroskopi Analyse af Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Erhvervelse Fluorescens Time-lapse film fra Spirende Gær og analysere encellede Dynamics hjælp poder

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Undersøgelse af<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver luftrør Terminal Cells ved lysmikroskopi

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Mikroskopi af fission Gær Seksuel Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporal Analyse af Cytokinetic Begivenheder i Fission Gær

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Live celle Fluorescens mikroskopi for at observere væsentlige processer under mikrobielle cellevækst

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live Cell Imaging til at vurdere dynamikken i metafase timing og celle skæbne efter mitotiske spindel forstyrrelser

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...