Name: examination of mitotic and meiotic fission yeast nuclear dynamics by fluorescence live-cell microscopy
Uploaded: 2019-06-24T14:45:00
Duration: 12 min 4 s
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著者たちは、この原稿の準備をより楽しいものにしてくれたナタリア・ラ・フォーケードとモン・ラフェルテに感謝したいと思います。彼らの洞察力、実験のアイデア、道徳的なサポートでこの作業の完了に貢献したForsburgラボのメンバーに感謝します。このプロジェクトは、NIGMS R35 GM118109 から SLF にサポートされました。

<ol>
	<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy&#8211;tips+and+tools.">Live-cell microscopy&#8211;tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+techniques+to+examine+DNA+replication+in+fission+yeast.">Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast.</a> DNA Replication. (13-41), (2015).</li><li>Lee, J. 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Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates.">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622 (2012).</li><li>Klutstein, M., Fennell, A., Fern&#225;ndez-&#193;lvarez, A., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+regulates+meiotic+centromere+assembly.">The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).</li><li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates.">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622 (2012).</li><li>Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+yeast+Taz1+protein+is+required+for+meiotic+telomere+clustering+and+recombination.">Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination.</a> Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).</li><li>Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B+prevents+chromosome+arm+separation+defects+by+promoting+telomere+dispersion+and+disjunction.">Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction.</a> Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).</li><li>Mastro, T. L., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+meiotic+crossovers+and+reduced+genome+stability+in+absence+of+Schizosaccharomyces+pombe+Rad16+(XPF).">Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF).</a> Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).</li><li>Escorcia, W., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilization+of+the+replication+fork+protection+complex+disrupts+meiotic+chromosome+segregation.">Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).</li><li>Fennell, A., Fern&#225;ndez-&#193;lvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+and+centromeres+have+interchangeable+roles+in+promoting+meiotic+spindle+formation.">Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).</li><li>Forsburg, S. L., Rhind, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+methods+for+fission+yeast.">Basic methods for fission yeast.</a> Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in enzymology. 470, 759-795 (2010).</li><li>. ImageJ User Guide &#8212; IJ&#8201;1.46 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html</a> (2019)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+DNA+replication+checkpoint+to+MBF+cell&#8208;cycle+transcription+reveals+a+distinct+class+of+G1/S+genes.">Linking DNA replication checkpoint to MBF cell&#8208;cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes.</a> The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).</li><li>Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+anaphase+promoting+complex+substrates+in+S.+cerevisiae.">Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (9), e45895 (2012).</li><li>Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+Rec8+is+required+for+reductional+chromosome+segregation+at+meiosis.">Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis.</a> Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).</li><li>Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+fission+yeast+UNC-13/Munc13+protein+Ync13+in+late+stages+of+cytokinesis.">Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).</li><li>Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+global+Cdc42+guanine+nucleotide+exchange+factors+for+fission+yeast+cell+polarity+are+coordinated+by+microtubules+and+the+Tea1&#8211;Tea4&#8211;Pom1+axis.">Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1&#8211;Tea4&#8211;Pom1 axis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580 (2018).</li><li>Dudin, O., Bendez&#250;, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast.">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+secretory+cargo+transport+within+the+Golgi+apparatus.">Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li><li>Kraft, L. M., Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+mechanism+for+mitochondria-dependent+dynein+anchoring.">A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2019).</li></ol>

著者は何も開示していない。

有分裂およびマイオシス中の生細胞イメージングは、データ取得中に核分裂酵母生理学を実質的に破壊することなく、核ダイナミクスを調べる機会を提供します。ただし、細胞が環境ストレスのない所望の密度に成長するように注意する必要があります。そして、マイオシスのために、細胞は、末端分化の時間の間に画像化され、あまりにも早くまたは遅くはありません。過剰な細胞の混雑、飢餓、および不適切な成長温度は、再現不可能な観察に寄与する一般的な要因です。さらに、歪み構築中に、蛍光タグが標的遺伝子の機能を妨げず、全体的な細胞適合性に影響を与えないことをテストすることが重要です。蛍光マーカーを運ぶ株の文種を綿密に検査しないと、類似のジェノタイプ間で一貫性がなく、比類のない結果が生じる可能性があります。
顕微鏡アガロースパッドは簡単に組み立てることができますが、貴重な画像データを得る上でハードルを生み出すこともあります。アガロースパッドの作成は、3つの顕微鏡スライドを平行に配置し、中央のスライドに溶融アガロースを分配し、他のスライドの上部を横切るスライドを置くことと同じくらい簡単です。しかし、耐シチュエーション、状況に特化したアガロースパッドを製造するために幅の変更を可能にするスライドメーカー装置を組み立てることは有用である。パッド幅の柔軟性を与えるシンプルなスライドメーカーは、プラットフォーム(ピペットチップホルダーまたはベンチ)、2つの顕微鏡スライド、およびパッド幅調整機構として機能するラボテープで構成されています(図1A)。正確なパッドの厚さは、イメージング時間の要件、アガローズブランド、温度、カバースリップシーラント、蒸発速度などに依存します。したがって、技術的な再現性を高め、生細胞イメージング1、2、3の品質を向上させるために、データ集録の前にイメージングシステムを校正することが重要である。パッド表面、剛性、組成は、長時間の画像集録時に不可欠です。アガロースは、背景蛍光が低く、容易に成形することができ、適切な濃度で、蒸発による構造変形に耐える。さらに、核分裂酵母培中とアガロースを組み合わせることで、画質を損なうおらず、複数のミトセスやマイオシスサイクルの延長観察が可能です。また、タイムラプス顕微鏡検査のための気泡を避けることも重要です。アガロースパッド内およびサンプル内では、エアポケットは時間の経過とともに膨張し、セルシフトを引き起こし、焦点面を破壊します。カバースリップ回転によって細胞が効率的に広がることで、研究者は核融合から胞子まで、数世代にわたる有電分裂プロセスや模倣事象に従うことができます。イメージング実験に適したパッドを作って選択するには時間がかかりますが、一度達成すれば、非常に有益な顕微鏡観察に貢献することができます。
他の方法と同様に、生細胞顕微鏡検査には技術的な制限はありません。蛍光タグ付きタンパク質の使用は、研究可能なものの範囲を制限する実験に境界を導入します。光漂白および光毒性は、長期画像取得の典型的な問題である。彼らはあまりにも長いまたはあまりにも頻繁に短い波長に細胞を公開しないことによって対抗することができます。GFP、CFP、YFP、mRFP、およびDsRedを含む実験では、核分裂酵母ライブセルイメージングに使用される典型的な蛍光タンパク質は、通常の実験に5〜15%の励起光と100-500ミリ秒の露光時間を使用するのが一般的です。しかし、これらのパラメータは、研究者の特定の実験要件に応じて変化します。さらに、60倍の目的を使用して0.5 μm間隔を持つ9~13のセクションで構成されるZスタックは、核分裂酵母細胞の厚さを解決するのに十分です。さらに、蛍光マーカーが標的タンパク質の適切な調節や機能を妨げなかったり、偽の動きを生成したりしないことを確認することが重要です。したがって、同じ標的遺伝子に対して異なる蛍光タグと親和性タグを含む株を構築し、異なる手段で観察を裏付けることをお勧めします。さらに、実験パラメータを実験全体で再現し、収集したデータが下流分析1、3に適合することを確認するのは、研究者の責任です。蛍光信号を検出する場合の線形性を注意深く観察し、厳密に調べることによって、実験システムを細心の注意を払って検証する時間テストの実践に取って代わる技術はありません。
最後に、生の画像を変更しない形式で顕微鏡データを分析することが重要です。フィジーは、生データ測定値を追跡するための優れたドキュメンテーションツールを提供し、研究者が単一のセッションで異なる細胞パラメータを調べることができます。これらの機能は、オンラインチュートリアルと広範な文献カバレッジの豊富さと同様に、フィジーは、人分裂とマイオシスにおける核分裂酵母の核ダイナミクスを記述するライブ細胞イメージングデータを測定、分析、および提示するための重要なツールにします。

生細胞顕微鏡検査は、研究者が核のダイナミクスを核のダイナミクスを死滅させることなく調べ、致死的な固定剤や汚れの必要性を排除することを可能にします。膜や細胞骨格に加えて、染色体複製、組み換え、分離などの重要な事象に関与する蛍光タグ付きタンパク質の安定性、動き、局在、タイミングを観察することが可能です。動き。細胞の生存率と非毒性信号検出を維持することにより、生理的侵入を最小限に抑えます。適切に実行すると、この顕微鏡法は、拡張された技術的な取り扱いまたは偽の化学反応性から生じる交絡効果を低減することができます。さらに、実験中に、研究者は、不適切なイメージングパラメータや異常な細胞生理学を示す核分裂酵母の栄養とストレス状態、増殖効率、およびアポトーシス状態の適切な観察を行うことができます1 、2、3.
ミトシスとマイオシスは、核と細胞の分裂によって特徴付けされます。マイオシスでは、有人化とは対照的に、親細胞が娘細胞を生み出すにつれて遺伝的含有量が半減する4.生細胞イメージングは空間的な関係に加えて時間次元を提供するため、多数の細胞をリアルタイムで調べることができます。生細胞顕微鏡検査により、研究者はヒストン5、コヘシンサブユニット6、微小管7、セントロメレス8、キネトコレ9、成分の蛍光タグを用いて核分裂のダイナミクスを調べることを可能にした。スピンドルポール本体(SPB)10、及び染色体旅客複合体(CPC)11のもの。染色体分離装置の外では、生細胞イメージングは必要なタンパク質の挙動も捕捉しているが、染色体分離には直接関与していない。これらのタンパク質の機能は、複製、染色体の組み換え、核運動、および微小管12、13、14への染色体の付着に影響を与えることが示されている。これらの観察は、機能成分が生化学的または遺伝的検査に適していない細胞事象のより良い理解に貢献している。顕微鏡検査技術の新たな進歩により、分解能の低下、光漂白、光毒性、焦点安定性などの限界が軽減され、微量およびメオティック核ダイナミクス1のより良いリアルタイム観測が容易になります。 2,3.Meiosisは、タイミングに細心の注意を払う必要がある末端分化経路であるため、特に困難です。
このプロトコルの目的は、人芽分離とマイオシスにおけるリアルタイム核分裂酵母核ダイナミクスを調べるための比較的簡単な方法を提示することです。そのためには、環境ストレスにさらされていない細胞を使用し、長時間のイメージングに耐えうるアガロースパッドを用意し、単一細胞ダイナミクスの可視化を容易にする密度で細胞を取り付ける必要があります。さらに、このプロトコルは、核動態(Hht1-mRFPまたはHht1-GFP)、染色体分離(Sad1-DsRed)、細胞骨格ダイナミクス(Atb2-mRFP)、転写物の有用なマーカーとして有用なマーカーとして機能する蛍光タグ付きタンパク質を運ぶ細胞を利用しています。G1/S(Tos4-GFP)の活性化、およびmeiosis(Rec8-GFP)における凝着安定性。この方法はまた、特定の細胞プロセスに関する質問に対処するために異なる組み合わせで使用することができる追加の核マーカーおよびサイトソーリックマーカー(表I)を導入する。さらに、研究者が生細胞画像を処理し、さまざまな種類のデータを分析するのに役立つ基本的なフィジーツールが紹介されています。このアプローチの強さは、タンパク質ダイナミクス、タイミング、安定性のリアルタイム観察を使用して、人芽生およびマイオシスの適切な実行に不可欠なプロセスを記述することに由来します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60x Plan Apochromat objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>AMEP4694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>7558B</td>
			<td>IB4917-10 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer rotator</td>
			<td>Stovall</td>
			<td>US Patent #4.702.610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-6768-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H20,</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3306-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-0759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Convolve 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSnap HQ CCD camera</td>
			<td>Roper</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H20,</td>
			<td>END</td>
			<td>CX-2185-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaVision deconvolution fluorescence microscope</td>
			<td>GE Healthcare/Applied Precision</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffraction PSF 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2023;1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl2&#183;6H2O</td>
			<td>END</td>
			<td>FX9259-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat plate</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>Thermo Lyne</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris deconvolution software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Shell lab</td>
			<td>#3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iterative Deconvolve 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>6858-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7387-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5626-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract (ME)</td>
			<td>MP</td>
			<td>4103-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H20</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0288-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4,</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>6192-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-0878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2S04</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>8024-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid,</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pantothenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>s80119WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pombe glutamate medium (PMG)</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2060-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>softWorx v3.3 image processing software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sporulation Medium powder</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>1821-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allwgra 6KR xentrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0847-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Equaline</td>
			<td>F79658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.03753.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract plus supplements (YES)</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2011-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4382-04</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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examination of mitotic and meiotic fission yeast nuclear dynamics by fluorescence live-cell microscopy

生細胞イメージングは、生細胞の細胞とタンパク質のダイナミクスを調べるために使用される顕微鏡検査技術です。このイメージング方法は毒性ではなく、一般に細胞生理学を妨げない、最小限の実験的処理を必要とする。技術的干渉のレベルが低いことから、研究者は複数のサイクルにわたる細胞の研究を行い、最初から最後までマイオシスを観察できます。グリーン蛍光タンパク質(GFP)や赤色蛍光タンパク質(RFP)などの蛍光タグを使用して、転写、DNA複製、凝着、分離などのプロセスに重要な機能を持つさまざまな因子を分析できます。フィジー(無料で最適化されたImageJバージョン)を使用したデータ解析と相まって、生細胞イメージングはタンパク質の動き、局在、安定性、タイミング、核ダイナミクス、染色体分離を評価するさまざまな方法を提供します。しかし、他の顕微鏡法と同様に、ライブセルイメージングは光の本質的な特性によって制限され、高倍率での分解能に限界があり、高波長での光漂白や光毒性にも敏感です。周波数。しかし、いくつかの注意を払って、研究者は、有線およびメオティックイベントの適切な視覚化を可能にするために、適切な条件、株、蛍光マーカーを慎重に選択することによって、これらの物理的な制限をバイパスすることができます。

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Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

ここでは、有分裂・マイオシス時の生きた核分裂酵母細胞におけるタンパク質挙動や核ダイナミクスを研究者が研究できる非毒性顕微鏡法である生細胞イメージングを紹介する。

蛍光生細胞顕微鏡によるミトティック・マイオシス酵母核ダイナミクスの検討

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

生細胞顕微鏡は、研究者が核分裂と微膜分裂の核ダイナミクスをリアルタイムで研究することを可能にします。この方法の強さは、有毒な固定剤や汚れの必要性を排除する正常な生理学的条件下で生きている細胞の核プロセスを研究することから来る。この手法は、遺伝的または生体機械操作に適さない可能性のあるタンパク質のタイミング、安定性、および移動性に関連する質問に対処します。イメージングの前に、分裂酵母細胞の健康と適合性に細心の注意を払うことは重要です。常に形態と成長特性を調べて、実験全体の結果の一貫性を確保します。このプロトコルは、顕微鏡スライドを調製する比較的簡単な方法を示しており、正しくマスターすると、長時間の生細胞イメージングの一貫性と再現性を高めることができます。極低温ウェイクアッププレートから細胞物質を拾い始めるには、YESプレートにストリークし、酵母遺伝子型に応じて摂氏25度または摂氏32度でインキュベートし、極低温保存からフィッション酵母株を目覚めさせます。その後、滅菌ループを使用して、目覚めた分裂酵母株の個々のコロニーから細胞を選び、3ミリリットルのYES液体培地を含む試験管に接種します。150~220rpmのシェーカーにチューブを入れ、0.7~1.0の光学密度測定値を求める遅い段階で一晩で25度または32度で成長させます。培養液10マイクロリットルを顕微鏡スライドに移す。カバースリップを置き、顕微鏡の下に置き、適切な細胞形態と栄養状態を確認します。有糸分裂または明起分析のための顕微鏡スライドを設定するには、まず、最小培地プラス有糸分裂のためのサプリメントまたはマイオシスのための液体胞子体のサプリメントの100ミリリットルを含む500ミリリットルフラスコにアガロースの2グラムを追加します。アガロース溶液を電子レンジで60%の電力で10秒刻みで温めるか、ビーカーを摂氏55度の水浴に10分間入れます。溶液を旋回して効率的な融解を確保します。ピペットチップホルダーに2つの顕微鏡スライドを設置し、上部スライドを両端のラボテープの2つのスタックに置き、クロスシェイプを作ります。2つのスライド間の距離を2ミリメートル以上に調整して、イメージングを延長するために次の手順で厚いパッドを形成します。溶融アガロースを室温で1分間冷却した後、上部スライドを取り外し、広いボアピペットチップを使用して、下のスライドに50〜100マイクロリットルを分配してスポットを作ります。アガロースが冷却する前に、上部スライドを上に置き、直径約1センチメートルと1/2〜2センチメートルのスプレッドパッドを生成します。最適なライブセルイメージングは、後続のデータ処理ステップに不可欠です。溶融アガロースの空気ボーブルを排除し、4時間以上のイメージング期間のための薄いパッドを作成することを確認してください。有糸分裂性のイベントを調べることは、一晩液体EMMまたはPMGプラスサプリメントのいずれかのスターター培養物から細胞を成長させる。培養液を1ミリリットルをキュベットに移し、595ナノメートルの波長で分光光光度計を測定する。光学密度が0.4に達すると、細胞増殖は中間対数相と見なされます。次いで、1ミリリットルの細胞懸濁液を1ミリリットルで遠心し、1分間375回gを用いた。上清を取り除き、最小培地に加えて、100マイクロリットルの最終体積に補う細胞ペレットを再懸濁します。画像のメオティックイベントは、一晩最小限の培地プラスサプリメントでスターター培養から細胞を成長させます.595ナノメートルの光学密度が0.7と1の間にある場合、細胞増殖は遅対数相と考えられる。次に、レイトログ培養から、各合致型株の500マイクロリットルを得て、H陰性とH陽性、1ミリリットルの細胞懸濁液を作り組み合わせる。1分間、375回gで細胞を遠心分離する。上清を取り除き、液状マルトース抽出物の1ミリリットルでペレットを再懸濁します。マルトースエキスを3回繰り返し、効率的な栄養素除去を確実にします。最後のマルトース抽出物を洗浄した後、細胞を1ミリリットルのマルトース抽出物で再懸濁し、9ミリリットルのマルトース抽出物を含む50ミリリットルフラスコに混合物を移す。50~100rpmの最低回転速度で22~25°Cで12~16時間インキュベートします。豊富な自己凝集から生じる多くの丸い分裂酵母塊の出現は、効率的な交配を示す。次に、1,375回gの交配培養物と遠心分離機の1ミリリットルのサンプルを1分間服用する。750マイクロリットルの上清を取り除き、残りの上清の細胞を再懸濁する。塊を混乱させるために5秒間激しく渦を起こさせる。2%アガロースパッドに有糸分裂性または微粒子細胞懸濁液の20マイクロリットルを分配する。スライドを反転し、2〜3秒間、糸くずのないペーパータオルの上に置くことによって、余分な媒体を取り除きます。スライドを反転し、パッドの上部にガラスカバースリップをそっと置き、気泡を発生させないようにします。セル単層を作成するには、人差し指でカバースリップを1回回転させ、有糸分裂細胞を1回回転させるか、または重症細胞の場合は2回のフルターンを行います。細胞物質がアガロースパッド全体に分散し、単一細胞またはアシスのより良い分離を可能にすることを確認してください。小さな木製のスティックの助けを借りて、各アガロースパッドを密封するためにカバースリップの端に沿って溶融炭化水素シーラントを分配します。アガロースパッドが密封されたら顕微鏡のステージに置きます。温度チャンバのスイッチを入れ、希望の温度に設定します。濡れたペーパータオルを入れたプレートをチャンバーに入れ、顕微鏡システムの湿度を制御します。適切な撮像条件で10~15分間平衡させます。これにより、残りの気泡が消散し、最後の最後のアガロースシフトが発生します。40Xの目的を使用して、画像に対する適切な視野を見つけます。60Xの目標に切り替えて、データの取得を開始します。顕微鏡機能を制御するソフトウェアでは、観察中の蛍光ホルに最も一致する顕微鏡フィルターセットを選択します。使用される蛍光色素に合わせて励起波長を調整し、一貫した信号を生成する最も低い励起力を採用し、4〜8時間の露光時間を使用して、許容可能でありながら定量化可能で再現可能なイメージングデータを生成します。1 時間ごとに少なくとも 6 つの取得時点を収集します。画像収集ソフトウェアでは、データを取得する少なくとも1つの蛍光チャネルを選択し、0.5マイクロメートル間隔の13セクションからなるZストックを採用します。フィジーのソフトウェアでは、プラグインメニューの下のバイオフォーマットの輸入機能を選択して、デコンボルブ画像をアップロードします。[インポート オプション] ポップアップ ウィンドウで、[ハイパースタック]、[既定のカラー モード] を選択し、[自動スケール] をオンにして [OK] ボタンを押します。下部にある各バーを横にスクロールして、表示されるウィンドウの蛍光チャンネルと時間枠の数が正しいことを確認します。データを圧縮しない TIFF ファイルとして保存します。次に、[分析]メニューの[計測値を設定]オプションを使用して、異なるパラメータを選択します。たとえば、面積、最小最大グレー値、統合密度、平均グレー値、中央値、スタック位置、周長、表示ラベルなどです。[色]を選択し、[チャンネルツール]をクリックします。「チャンネル」ポップアップウィンドウで、強度または面積を測定するカラーチャンネルを確認します。[イメージ]を選択し、[タイプ]をクリックして[32ビット]をクリックします。[イメージ] メニューの [調整] および [しきい値] 機能を選択します。[暗い背景] チェックボックスをオンにし、[デフォルト] を選択して[赤]を選択して、対象のシグナルをオーバーレイします。wand ツールを使用して目的の各構造をハイライト表示し、キーボードの文字 T を押して、選択した ROI をポップアップ ROI マネージャ ウィンドウに追加します。次に、ZIP化されたROIフォルダを開いてROIマネージャをロードし、左側のパネルで各ROI識別子をクリックします。[分析] メニューから [測定] を選択し、各 ROI 識別子でこのコマンドを繰り返して、イメージ スタックのすべてのスライスで対象のオブジェクトを定量化します。統計分析のために結果を CSV ファイルとして保存します。この研究では、細胞が栄養の制限や過剰増殖のために飢えた場合、過剰な空胞子および細胞サイズの減少を示す。対数細胞は、活性DNA複製および細胞分裂、ならびに汎核Tos4-GFP発現およびSad1-DsRed病巣分離を示す。細胞が十分に窒素不足でない場合と同様に、交尾の失敗は、それらが間もない状態に入るのを妨げる。カルヨガミーを受けている核分裂細胞のペアが示されている。嵌合細胞懸濁液の堅牢な凝集は細胞間相互作用を増加させ、したがって成功した交配および効率的な微量誘導を示す。ジゴティック・アシは、ジグザグとバナナ細胞の形を含む複数の形態をとっている。細胞が形相からテロ相に移行する有糸分裂では、最初の変化は形相における核サイズの収縮を伴い、2番目の変化はアナフェーズ中に核分裂を示す。マイトティック細胞といくつかの分離ダイナミクスを共有することに加えて、meiotic細胞は相同組換え中に核振動を示し、アナフェーズII.Itの終わりにヌクレオシドのさらなる減少を示す実験パラメータが実験全体で再現され、収集されたデータが下流分析に適合することを確実にする研究者の責任です。生細胞イメージングにより、研究者は有糸分裂と間膜症における核分裂の仕組みを詳細に調べることができた。蛍光タグと顕微鏡機能が改善されるにつれて、観察できるプロセスの数と種類が増えます。

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

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蛍光を経由してF -アクチンダイナミクスの生細胞イメージングでは、顕微鏡のスペックル（FSM）

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

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Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

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Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

出芽酵母の蛍光タイムラプス作品を取得し、移植片を使用したシングルセルダイナミクスの解析

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

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の検討<em&gt;ショウジョウバエ</em光学顕微鏡で&gt;幼虫気管ターミナルセル

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In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

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成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

分裂酵母セクシャルライフサイクルの顕微鏡観察

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

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Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

微生物細胞の成長に不可欠なプロセスを遵守する細胞蛍光顕微鏡をライブします。

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

水動紡錘摂動後のメタフェイズタイミングと細胞運命のダイナミクスを評価するライブ細胞イメージング

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...