Name: examination of mitotic and meiotic fission yeast nuclear dynamics by fluorescence live-cell microscopy
Uploaded: 2019-06-24T14:45:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Natalia la Fourcade og Mon LaFerte for å gjøre utarbeidelsen av dette manuskriptet en morsommere oppgave. Takket være medlemmer av Forsburg Lab som bidro til fullføringen av dette arbeidet med sin innsikt, eksperiment ideer, og moralsk støtte. Dette prosjektet ble støttet av NIGMS R35 GM118109 til SLF.

<ol>
	<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy&#8211;tips+and+tools.">Live-cell microscopy&#8211;tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+techniques+to+examine+DNA+replication+in+fission+yeast.">Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast.</a> DNA Replication. (13-41), (2015).</li><li>Lee, J. Y., Kitaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner&#8217;s+guide+to+rigor+and+reproducibility+in+fluorescence+imaging+experiments.">A beginner&#8217;s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).</li><li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis:+an+overview+of+key+differences+from+mitosis.">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859 (2015).</li><li>Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+stress+in+early+S+phase+generates+apparent+micronuclei+and+chromosome+rearrangement+in+fission+yeast.">Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).</li><li>Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+cohesin-based+chromosome+structure+is+essential+for+homologous+chromosome+pairing+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).</li><li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates.">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622 (2012).</li><li>Klutstein, M., Fennell, A., Fern&#225;ndez-&#193;lvarez, A., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+regulates+meiotic+centromere+assembly.">The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).</li><li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates.">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622 (2012).</li><li>Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+yeast+Taz1+protein+is+required+for+meiotic+telomere+clustering+and+recombination.">Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination.</a> Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).</li><li>Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B+prevents+chromosome+arm+separation+defects+by+promoting+telomere+dispersion+and+disjunction.">Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction.</a> Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).</li><li>Mastro, T. L., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+meiotic+crossovers+and+reduced+genome+stability+in+absence+of+Schizosaccharomyces+pombe+Rad16+(XPF).">Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF).</a> Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).</li><li>Escorcia, W., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilization+of+the+replication+fork+protection+complex+disrupts+meiotic+chromosome+segregation.">Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).</li><li>Fennell, A., Fern&#225;ndez-&#193;lvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+and+centromeres+have+interchangeable+roles+in+promoting+meiotic+spindle+formation.">Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).</li><li>Forsburg, S. L., Rhind, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+methods+for+fission+yeast.">Basic methods for fission yeast.</a> Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in enzymology. 470, 759-795 (2010).</li><li>. ImageJ User Guide &#8212; IJ&#8201;1.46 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html</a> (2019)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+DNA+replication+checkpoint+to+MBF+cell&#8208;cycle+transcription+reveals+a+distinct+class+of+G1/S+genes.">Linking DNA replication checkpoint to MBF cell&#8208;cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes.</a> The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).</li><li>Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+anaphase+promoting+complex+substrates+in+S.+cerevisiae.">Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (9), e45895 (2012).</li><li>Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+Rec8+is+required+for+reductional+chromosome+segregation+at+meiosis.">Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis.</a> Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).</li><li>Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+fission+yeast+UNC-13/Munc13+protein+Ync13+in+late+stages+of+cytokinesis.">Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).</li><li>Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+global+Cdc42+guanine+nucleotide+exchange+factors+for+fission+yeast+cell+polarity+are+coordinated+by+microtubules+and+the+Tea1&#8211;Tea4&#8211;Pom1+axis.">Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1&#8211;Tea4&#8211;Pom1 axis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580 (2018).</li><li>Dudin, O., Bendez&#250;, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast.">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+secretory+cargo+transport+within+the+Golgi+apparatus.">Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li><li>Kraft, L. M., Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+mechanism+for+mitochondria-dependent+dynein+anchoring.">A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2019).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Live-celle Imaging under mitose og meiose gir mulighet til å undersøke kjernefysiske dynamikk uten vesentlig forstyrre fisjon gjær fysiologi under datainnhenting. Det må imidlertid utvises forsiktighet for å sikre at cellene vokser til den ønskede tettheten uten miljøbelastninger. og for meiose, at cellene er avbildet i løpet av tidspunktet for Terminal differensiering og ikke for tidlig eller sent. Overflødig cellulær trengsel, sult og upassende vekst temperaturer er vanlige faktorer som bidrar til ved uforklarlige observasjoner. I tillegg, under belastning konstruksjon, er det avgjørende å teste at fluorescerende koder ikke forstyrrer funksjonene til målet gener eller innvirkning generelle celle fitness. Unnlatelse av å undersøke nøye fenotyper av stammer som bærer fluorescerende markører kan resultere i inkonsekvente og uforlignelige resultater på tvers av lignende genotyper.
Selv om mikroskop agarose pads er enkle å montere, kan de også utgjøre et hinder i å skaffe verdifulle bildedata. Opprette agarose pads er så enkelt som å plassere tre mikroskop lysbilder parallelt med hverandre, dosering smeltet agarose på midten lysbildet, og sette et lysbilde som Transverses toppen av de andre lysbildene. Det er nyttig, men å sette sammen en Slide-Maker apparat som gjør det mulig for bredde modifikasjoner for å produsere resistente, situasjon-spesifikke agarose pads. En enkel Slide-Maker som gir puten bredde fleksibilitet består av en plattform (pipette tips holderen eller benken), to mikroskop lysbilder, og Lab tape fungerer som puten-bredde justering mekanisme (figur 1a). Eksakt pad tykkelse vil avhenge Imaging tid krav, agarose merkevare, temperatur, dekkglass tetningsmasse, fordampning rate, etc. Derfor er det viktig å kalibrere avbildnings systemet før datainnhenting for å øke teknisk reproduserbarhet og for å forbedre kvaliteten på Live-Cell Imaging1,2,3. Pad overflate, stivhet, og sammensetning er avgjørende ved langvarig bildeoppkjøp. Agarose har lav bakgrunn fluorescens, kan lett formes, og ved riktig konsentrasjon, tåler strukturelle deformasjon på grunn av fordampning. Videre kombinerer fisjon gjær medier med agarose ikke kompromiss bildekvalitet og gir mulighet for utvidet observasjon av flere mitoses og meiose sykluser. Det er også viktig å unngå eventuelle luftbobler for time-lapse mikroskopi. I agarose pads og i prøven utvides Luftlommene over tid, noe som fører til celle forskyvning og forstyrrer fokal plan. Forutsatt celler er effektivt spres fra hverandre ved dekkglass rotasjon, kan forskerne følge mitotisk prosesser over flere generasjoner og meiotic hendelser fra kjernefysisk fusjon til sporulation. Making og velge riktig pad for Imaging eksperimenter tar tid å mestre, men når oppnådd, kan bidra til svært informative mikroskop observasjoner.
Som tilfellet er med andre metoder, er ikke direkte celle mikroskopi uten tekniske begrensninger. Bruken av fluorescensmerkete proteiner introduserer grenser for eksperimenter som begrenser omfanget av hva som kan bli studert. Foto-bleking og foto-toksisitet er problemer typisk for langvarig bildeoppkjøp. De kan motarbeides ved å ikke utsette celler for korte bølgelengder for lenge eller for ofte. For eksperimenter som involverer GFP, CFP, YFP, mRFP, og DsRed, typiske fluorescerende proteiner som brukes i fisjon gjær Live-celle Imaging, er det vanlig å ansette 5-15% eksitasjon lys og 100-500 MS eksponeringstid for rutinemessige eksperimenter. Disse parametrene endres imidlertid i henhold til de spesifikke eksperiment kravene til forskeren. I tillegg z-stabler består av 9-13 seksjoner med 0,5 μm avstand ved hjelp av en 60x mål er nok til å løse tykkelsen på en fisjon gjær celle. Videre er det viktig å bekrefte at fluorescerende markører ikke forstyrrer riktig regulering eller funksjon av mål proteiner eller genererer falske fenotyper. Derfor er det tilrådelig å konstruere stammer som inneholder ulike fluorescerende og affinitet koder for samme mål genet å bekrefte observasjoner av ulike virkemidler. Videre er det ansvaret til forskere for å sikre at eksperimentelle parametre kan reproduseres på tvers av eksperimenter og at de innsamlede dataene er egnet for nedstrøms analyse1,3. Ingen teknologi kan erstatte tid-testet praksis av omhyggelig validere eksperimentelle systemer ved nøye observasjon og grundig undersøkelse av linearitet i å oppdage fluorescerende signaler.
Til slutt er det avgjørende å analysere mikroskopi data i formater som ikke endrer RAW-bilder. Fiji gir utmerket dokumentasjon verktøy for å holde styr på rådata målinger og gjør forskerne til å undersøke ulike celle parametre i en enkelt økt. Disse funksjonene, så vel som sin rikdom av online opplæringsprogrammer og omfattende litteratur dekning, gjør Fiji et viktig verktøy for å måle, analysere og presentere Live Cell Imaging data som beskriver kjernefysiske dynamikken i fisjon gjær i mitose og meiose.

Live-celle mikroskopi tillater forskere å undersøke kjernefysiske dynamikk uten å drepe fisjon gjærceller og eliminerer behovet for dødelige fiksativene og flekker. Det er mulig å observere stabilitet, bevegelse, lokalisering og timing av fluorescensmerkete merkede proteiner som er involvert i viktige hendelser som kromosom replikering, rekombinasjon, og segregering, i tillegg til membranen og cytoskjelettkomponenter Bevegelser. Ved å opprettholde celle levedyktighet og ikke-giftig signal deteksjon, det er minimal fysiologisk inntrenging. Når den utføres riktig, kan denne mikroskopi metoden redusere forvirrende effekter som oppstår fra den utvidede tekniske håndteringen eller fra falsk kjemisk reaktivitet. Videre, under et eksperiment, kan forskerne gjøre relevante observasjoner av fisjon gjær ernæringsmessige og stress tilstander, proliferativ effektivitet, og apoptotisk status som indikerer upassende bildebehandling parametere eller unormal celle fysiologi1 ,2,3.
Mitose og meiose er preget av kjernefysiske og cellulære divisjon. I meiose, i motsetning til mitose, er genetisk innhold halvert som overordnede celler gir opphav til datteren celler4. Ettersom sann tids avbildning gir en temporal dimensjon i tillegg til den romlige relasjonen, kan et stort antall celler undersøkes i sanntid. Live-Cell mikroskopi har gjort det mulig for forskere å undersøke dynamikken i kjernefysisk divisjon ved hjelp av fluorescerende koder for histoner5, cohesin under enheter6, mikrotubuli7, centromeres8, kinetochores9, komponenter i spindel Pol kroppen (SPB)10, og de av kromosom passasjer kompleks (CPC)11. Utenfor kromosom raseskille apparat, har Live-celle Imaging også fanget atferden til proteiner nødvendig, men ikke direkte involvert i kromosom segregering. Funksjonen av disse proteinene har vist å påvirke replikering, kromosom rekombinasjon, kjernefysisk bevegelse, og kromosom vedlegg til mikrotubuli12,13,14. Disse observasjonene har bidratt til en bedre forståelse av cellulære hendelser hvis funksjonelle komponenter ikke var mottagelig for biokjemiske eller genetisk undersøkelse. Med nye fremskritt innen mikroskopi teknologi, vil begrensninger som dårlig oppløsning, photobleaching, Phototoksisitet og fokus stabilitet minske, og dermed tilrettelegge for bedre sann tids observasjoner av mitotisk og meiotic kjernefysiske dynamikk1, 2,3. Meiose er spesielt utfordrende som det er en Terminal differensiering vei som krever nøye med timing.
Målet med denne protokollen er å presentere en relativt enkel metode for å undersøke sanntids fisjon gjær kjernefysiske dynamikk i mitose og meiose. For å oppnå dette, er det nødvendig å bruke celler som ikke har vært utsatt for miljømessige stress, forberede agarose pads som tåler langvarig bildebehandling, og montere celler ved tetthet som letter visualisering av enkelt celle dynamikk. Videre gjør denne protokollen bruk av celler som frakter fluorescensmerkete merkede proteiner som fungerer som nyttige markører for kjernefysisk Kinetics (Hht1-mRFP eller Hht1-GFP), kromosom segregering (Sad1-DsRed), cytoskeleton dynamikk (Atb2-mRFP), transcriptional aktivering i G1/S (Tos4-GFP), og samhold stabilitet i meiose (Rec8-GFP). Denne metoden introduserer også flere kjernefysiske og cytosolic markører (tabell I) som kan brukes i ulike kombinasjoner for å løse spørsmål om spesifikke cellulære prosesser. Videre er grunnleggende Fiji verktøy kjennetegnet for å hjelpe forskere behandle Live-celle bilder og analysere ulike typer data. Styrken i denne tilnærmingen stammer fra bruk av sanntids observasjoner av protein dynamikk, timing, og stabilitet for å beskrive prosesser som er integrert for riktig utførelse av mitose og meiose.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60x Plan Apochromat objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>AMEP4694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>7558B</td>
			<td>IB4917-10 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer rotator</td>
			<td>Stovall</td>
			<td>US Patent #4.702.610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-6768-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H20,</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3306-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-0759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Convolve 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSnap HQ CCD camera</td>
			<td>Roper</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H20,</td>
			<td>END</td>
			<td>CX-2185-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaVision deconvolution fluorescence microscope</td>
			<td>GE Healthcare/Applied Precision</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffraction PSF 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2023;1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl2&#183;6H2O</td>
			<td>END</td>
			<td>FX9259-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat plate</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>Thermo Lyne</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris deconvolution software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Shell lab</td>
			<td>#3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iterative Deconvolve 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>6858-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7387-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5626-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract (ME)</td>
			<td>MP</td>
			<td>4103-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H20</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0288-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4,</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>6192-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-0878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2S04</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>8024-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid,</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pantothenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>s80119WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pombe glutamate medium (PMG)</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2060-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>softWorx v3.3 image processing software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sporulation Medium powder</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>1821-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allwgra 6KR xentrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0847-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Equaline</td>
			<td>F79658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.03753.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract plus supplements (YES)</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2011-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4382-04</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of mitotic and meiotic fission yeast nuclear dynamics by fluorescence live-cell microscopy

Live-celle Imaging er en mikroskopi teknikk som brukes til å undersøke celle og protein dynamikk i levende celler. Dette tenkelig metoden er ikke giftig, vanligvis ikke forstyrrer celle fysiologi, og krever minimal eksperimentell håndtering. De lave nivåene av teknisk interferens gjør det mulig for forskere å studere celler på tvers av flere sykluser med mitose og observere meiose fra begynnelse til slutt. Ved hjelp av fluorescerende koder som grønn fluorescerende protein (GFP) og røde fluorescerende protein (RFP), kan forskerne analysere ulike faktorer som funksjoner er viktig for prosesser som transkripsjon, DNA-replikering, samhold, og segregering. Sammen med dataanalyse ved hjelp av Fiji (en gratis, optimalisert ImageJ versjon), tilbyr live-celle Imaging ulike måter å vurdere protein bevegelse, lokalisering, stabilitet og timing, samt kjernefysiske dynamikk og kromosom segregering. Men som tilfellet er med andre mikroskopi metoder, er live-celle Imaging begrenset av den iboende egenskapene til lys, som satte en grense for oppløsnings kraft ved høye forstørrelser, og er også følsom for photobleaching eller Phototoksisitet ved høy bølgelengde Frekvenser. Men med litt omsorg, etterforskere kan omgå disse fysiske begrensningene ved nøye å velge riktig forhold, stammer, og fluorescerende markører for å muliggjøre den aktuelle visualisering av mitotisk og meiotic hendelser.

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy at JoVE.com

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Her presenterer vi Live-celle Imaging som er en ikke-giftig mikroskopi metode som gjør det mulig for forskere å studere protein atferd og kjernefysiske dynamikk i levende fisjon gjærceller under mitose og meiose.

Undersøkelse av mitotisk og Meiotic fisjon gjær Nuclear Dynamics av fluorescens Live-Cell mikroskopi

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Levende cellemikroskopi gjør det mulig for forskere å studere fisjon gjær kjernefysisk dynamikk i mitose og meiose i sanntid. Styrken av denne metoden kommer fra å studere kjernefysiske prosesser i levende celler under normale fysiologiske forhold som eliminerer behovet for giftige fikseringsmidler og flekker. Denne teknikken tar for seg spørsmål knyttet til proteintiming, stabilitet og mobilitet som kanskje ikke er mottagelig for genetisk eller biomekanisk manipulasjon.Det er viktig å være oppmerksom på helse og egnethet av fisjon gjær celler før avbildning. Undersøk alltid morfologi og vekstegenskaper for å sikre konsistens av resultater på tvers av eksperimenter. Denne protokollen viser den relativt enkle måten å forberede mikroskoplysbilder som når de mestres riktig, kan forbedre konsistensen og reproduserbarheten til langvarig levende celleavbildning.For å begynne å plukke opp celle materie fra kryogen våkne opp plate, Streak det på JA plater, og inkubere dem på 25 grader Celsius eller 32 grader Celsius avhengig av gjær genotype å våkne opp fisjon gjær stammer fra kryogen bevaring. Bruk deretter en steril løkke for å plukke celler fra individuelle kolonier i de vekkede fisjonsgjærstammene og inokulere dem i reagensrør som inneholder tre milliliter YES flytende medium. Plasser rørene i en shaker på 150 til 220 rpm for å vokse ved 25 eller 32 grader Celsius over natten til sen-logg fase med en ønsket optisk tetthet lesing på 0,7 til 1,0.Overfør 10 mikroliter av kulturen til et mikroskop lysbilde. Sett en dekkslip på og plasser den under et mikroskop for å se etter riktig cellemorfologi og ernæringsmessig tilstand. For å sette opp et mikroskop lysbilde for mitose eller meiose analyse først legge til to gram agarose i 500-milliliter kolbe som inneholder 100 milliliter av enten minimal medium pluss kosttilskudd for mitose eller flytende sporulating medium for meiose.Varm agaroseløsningen i en mikrobølgeovn ved 60% effekt i trinn på 10 sekunder eller plasser begeret i et 55 grader Celsius vannbad i 10 minutter. Virvle løsningen for å sikre effektiv smelting. Sett opp to mikroskopsklier på en pipettespissholder med det øverste lysbildet som hviler på to stabler med laboratorietape i begge ender som støtte for å lage en kryssform.Juster avstanden mellom de to lysbildene til større enn to millimeter for å danne en tykk pute i følgende trinn for langvarig avbildning. Etter kjøling av smeltet agarose i ett minutt ved romtemperatur, fjern topplysbildet og bruk en bred pipettespiss til å dispensere 50 til 100 mikroliter på det nederste lysbildet for å lage et sted. Før agarose kjøles ned, plasser det øverste lysbildet på toppen for å generere en spredningspute på omtrent en og 1/2 til to centimeter i diameter.Optimal live celleavbildning er avgjørende for påfølgende databehandlingstrinn. Sørg for å eliminere eventuelle luftbaubles i smeltet agarose og skape en tynn pute for bildeperioder lenger enn fire timer. For å undersøke mitotiske hendelser vokse celler fra startkulturer i enten flytende EMM eller PMG pluss kosttilskudd over natten.Overfør en milliliter av kulturen til en cuvette, og mål på spektrofotometeret ved en bølgelengde på 595 nanometer. Celleveksten anses midt i loggfasen når den optiske tettheten når 0,4. Deretter sentrifuge en milliliter av cellesuspensjonen på 1, 375 ganger g i ett minutt.Fjern den supernatante og resuspend cellepellet i minimal medium pluss kosttilskudd til et endelig volum på 100 mikroliter. For å bilde meiotiske hendelser vokse celler fra startkulturer i minimal medium pluss kosttilskudd over natten. Cellevekst anses sen-logg fase når den optiske tettheten på 595 nanometer er mellom 0,7 og en.Deretter, fra sen-logg kulturer få 500 mikroliter av hver kompis type belastning, H negativ og H positiv, og kombineres for å gjøre en en milliliter celle suspensjon. Sentrifuger cellene ved 1, 375 ganger g i ett minutt. Fjern den overnaturlige og resuspend pellet i en milliliter flytende maltose ekstrakt.Gjenta maltoseekstraktet tre ganger til for å sikre effektiv fjerning av næringsstoffer. Etter den siste maltoseekstraktet vasker cellene i en milliliter maltoseekstrakt og overfører blandingen til en 50-milliliter kolbe som inneholder ni milliliter maltoseekstrakt. Inkuber i 12 til 16 timer ved 22 til 25 grader Celsius på en minimal rotasjonshastighet mellom 50 og 100 omdr./min.Utseendet til mange runde fisjonsgjærklumper som følge av rikelig selvflocculation indikerer effektiv parring. Deretter tar du en ett milliliter prøve av parringskulturen og sentrifuge på 1, 375 ganger g i ett minutt. Fjern 750 mikroliter av de supernatante og gjenoppuss cellene i de gjenværende supernatante.Vortex kraftig i fem sekunder for å forstyrre klumpene. Dispenser 20 mikroliter av enten en mitotisk eller meiotisk cellesuspensjon på en 2% agarose pad. Fjern overflødig medium ved å snu lysbildet og sette det på toppen av det lofrie papirhåndkleet i to til tre sekunder.Snu lysbildet og legg forsiktig en glassdeksleglass på toppen av puten, og sørg for ikke å generere luftbobler. For å lage en celle monolayer rotere coverslip med klokken med pekefingeren for en full sving for mitose celler eller to fulle svinger for meiose celler. Sørg for at cellesaken sprer seg over agarose pad slik at for bedre separasjon av enkeltceller eller asci.Ved hjelp av en liten trepinne dispensere smeltet hydrokarbon tetningsmasse langs kantene av dekkslips for å forsegle hver agarose pad. Når agarose pad er forseglet plassere den på mikroskopet scenen. Slå på temperaturkammeret og sett det til ønsket temperatur.Plasser en plate med et vått papirhåndkle inn i kammeret for å kontrollere fuktigheten i mikroskopsystemet. La det likevekt i 10 til 15 minutter ved passende bildeforhold. Dette gjør at eventuelle gjenværende luftbobler kan forsvinne og eventuelle agarose-skift i siste liten kan oppstå.Bruk 40X-målet til å finne passende synsfelt til bilde. Bytt til 60X-målet for å starte datainnhenting. I programvaren som styrer mikroskopfunksjonen, velg mikroskopfiltersettene som passer best til fluoroforene under observasjon.Juster eksitasjonsbølgelengdene slik at de samsvarer med fluoroforene som brukes, bruker den laveste eksitasjonskraften som gir et konsekvent signal, og bruk eksponeringstider på fire til åtte timer for å generere akseptable, men kvantifiserbare og reproduserbare bildedata. Samle minst seks oppkjøpstidspoeng hver time. I bildeinnsamlingsprogramvaren velger du minst én fluorescenskanal for å skaffe data og ansette en Z-lager bestående av 13 seksjoner med 0,5 mikrometeravstand.I Fiji-programvaren laster du opp et dekonvolvert bilde ved å velge Bio-Formats Importer-funksjonen under plug-ins-menyen. I popup-vinduet Importalternativer velger du Hyperstack, Standard fargemodus, kontrollerer Autoskalering og trykker på OK-knappen. Kontroller at det viste vinduet har riktig antall fluorescenskanaler og tidsrammer ved å rulle sidelengs på de respektive stolpene nederst.Lagre som en Tiff-fil som ikke komprimerer data. Deretter bruker du alternativet Angi målinger under Analyser-menyen til å velge forskjellige parametere. For eksempel:Område, Min maks grå verdi, Integrert tetthet, Gjennomsnittlig grå verdi, Median, Stack-posisjon, Perimeter og Skjermetikett.Velg Farge og klikk på kanalverktøyet. I popup-vinduet Kanaler kontrollerer du fargekanalen som intensiteten eller området skal måles for. Velg Bilde, skriv deretter inn og klikk på 32-biters.Velg juster- og terskelfunksjonene under Bilde-menyen. Merk av for Mørk bakgrunn, velg Standard-metoden, og velg Rød for å legge over signalene av interesse. Bruk tryllestavverktøyet til å utheve hver interessestruktur og trykk bokstaven T på tastaturet for å legge til den valgte avkastningen i popup-vinduet roi manager.Deretter åpner du den zippede ROI-mappen for å laste inn ROI-lederen og klikker på hver ROI-identifikator i venstre sidepanel. Velg Mål fra Analyser-menyen, og gjenta denne kommandoen på hver ROI-identifikator for å kvantifisere objektene av interesse i alle deler av bildestakken. Lagre resultatene som en CSV-fil for statistisk analyse.I denne studien hvis cellene sulter på grunn av næringsbegrensning eller overvekst, vil de vise overflødige vakuoler og redusert cellestørrelse. Logaritmiske celler viser aktiv DNA-replikering og celledeling, samt pan-kjernefysisk Tos4-GFP-uttrykk og Sad1-DsRed foci separasjon. Unnlatelse av å mate, som det er tilfelle når celler ikke er tilstrekkelig sultet av nitrogen, vil hindre dem i å komme inn meiose.Et par fisjonsceller som gjennomgår karyogami vises. Robust flocculation av parring celle suspensjon øker celle-til-celle interaksjon og dermed indikerer vellykket parring og effektiv meiotisk induksjon. Zygotisk asci tar flere former, inkludert sikk-sakk og banan celle former.I mitose som celler overgang fra metafase til telophase, innebærer den første endringen en sammentrekning av kjernefysisk størrelse i metafase, mens den andre viser kjernesplitting under anafase. I tillegg til å dele noen segregeringsdynamikk med mititotiske celler, viser meiotiske celler kjernefysisk oscillasjon under homolog rekombinasjon og ytterligere reduksjon av nukleosider på slutten av anafase II.It er forskernes ansvar for å sikre at eksperimentparametere kan reproduseres på tvers av eksperimenter, og at de innsamlede dataene er egnet for nedstrøms analyse. Levende celleavbildning har tillatt etterforskere å undersøke nærmere mekanikken i kjernefysisk deling i mitose og meiose.Som fluorescerende koder og mikroskop evner forbedre antall og type prosesser vi kan observere vil øke.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitative Live-Cell fluorescens-mikroskopi Analyse av Fission gjær

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Anskaffelse Fluorescens Time-lapse filmer av Spirende gjær og analysere encellede Dynamics bruke grafts

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Undersøkelse av<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Tracheal Terminal Cells ved lysmikroskopi

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Mikroskopi av Fisjon gjær Seksuell Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporal Analyse av Cytokinetic Hendelser i Fisjon Gjær

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Live celle fluorescens mikroskopi å observere viktige prosesser under mikrobiell cellevekst

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live Cell Imaging å vurdere dynamikken i Metafase timing og Cell Fate etter mitotisk spindel forstyrrelser

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...