Name: examination of mitotic and meiotic fission yeast nuclear dynamics by fluorescence live-cell microscopy
Uploaded: 2019-06-24T14:45:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Наталью Ла Фуркад и Мон ЛаФерте за то, что они сделали подготовку этой рукописи более приятной. Спасибо членам forsburg Lab, которые внесли свой вклад в завершение этой работы с их пониманием, идеями эксперимента и моральной поддержкой. Этот проект был поддержан NIGMS R35 GM118109 для SLF.

<ol>
	<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy&#8211;tips+and+tools.">Live-cell microscopy&#8211;tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+techniques+to+examine+DNA+replication+in+fission+yeast.">Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast.</a> DNA Replication. (13-41), (2015).</li><li>Lee, J. Y., Kitaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner&#8217;s+guide+to+rigor+and+reproducibility+in+fluorescence+imaging+experiments.">A beginner&#8217;s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).</li><li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis:+an+overview+of+key+differences+from+mitosis.">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859 (2015).</li><li>Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+stress+in+early+S+phase+generates+apparent+micronuclei+and+chromosome+rearrangement+in+fission+yeast.">Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).</li><li>Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+cohesin-based+chromosome+structure+is+essential+for+homologous+chromosome+pairing+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).</li><li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates.">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622 (2012).</li><li>Klutstein, M., Fennell, A., Fern&#225;ndez-&#193;lvarez, A., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+regulates+meiotic+centromere+assembly.">The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).</li><li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates.">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622 (2012).</li><li>Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+yeast+Taz1+protein+is+required+for+meiotic+telomere+clustering+and+recombination.">Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination.</a> Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).</li><li>Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B+prevents+chromosome+arm+separation+defects+by+promoting+telomere+dispersion+and+disjunction.">Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction.</a> Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).</li><li>Mastro, T. L., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+meiotic+crossovers+and+reduced+genome+stability+in+absence+of+Schizosaccharomyces+pombe+Rad16+(XPF).">Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF).</a> Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).</li><li>Escorcia, W., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilization+of+the+replication+fork+protection+complex+disrupts+meiotic+chromosome+segregation.">Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).</li><li>Fennell, A., Fern&#225;ndez-&#193;lvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+and+centromeres+have+interchangeable+roles+in+promoting+meiotic+spindle+formation.">Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).</li><li>Forsburg, S. L., Rhind, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+methods+for+fission+yeast.">Basic methods for fission yeast.</a> Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in enzymology. 470, 759-795 (2010).</li><li>. ImageJ User Guide &#8212; IJ&#8201;1.46 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html</a> (2019)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+DNA+replication+checkpoint+to+MBF+cell&#8208;cycle+transcription+reveals+a+distinct+class+of+G1/S+genes.">Linking DNA replication checkpoint to MBF cell&#8208;cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes.</a> The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).</li><li>Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+anaphase+promoting+complex+substrates+in+S.+cerevisiae.">Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (9), e45895 (2012).</li><li>Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+Rec8+is+required+for+reductional+chromosome+segregation+at+meiosis.">Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis.</a> Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).</li><li>Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+fission+yeast+UNC-13/Munc13+protein+Ync13+in+late+stages+of+cytokinesis.">Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).</li><li>Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+global+Cdc42+guanine+nucleotide+exchange+factors+for+fission+yeast+cell+polarity+are+coordinated+by+microtubules+and+the+Tea1&#8211;Tea4&#8211;Pom1+axis.">Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1&#8211;Tea4&#8211;Pom1 axis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580 (2018).</li><li>Dudin, O., Bendez&#250;, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast.">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+secretory+cargo+transport+within+the+Golgi+apparatus.">Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li><li>Kraft, L. M., Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+mechanism+for+mitochondria-dependent+dynein+anchoring.">A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2019).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Визуализация в живых клетках во время митоза и мейоза дает возможность изучить ядерную динамику без существенного нарушения физиологии деление дрожжей при получении данных. Однако необходимо проявлять осторожность, с тем чтобы клетки росли до желаемой плотности, свободной от экологических стрессов; и для мейоза, что клетки изображены во время терминальной дифференциации и не слишком рано или поздно. Избыток клеточной скученности, голод и ненадлежащие температуры роста являются общими факторами, которые способствуют невоспроизводимым наблюдениям. Кроме того, во время конструкции деформации, важно проверить, что флуоресцентные метки не мешают функциям генов-мишеней и не влияют на общую пригодность клеток. Неспособность тщательно проверить фенотипы штаммов, несущих флуоресцентные маркеры, может привести к непоследовательным и несравненным результатам по аналогичным генотипам.
Хотя микроскоп агарозные колодки просты в сборке, они также могут создавать препятствия в получении ценных данных изображений. Создание агарозных колодок так же просто, как размещение трех слайдов микроскопа параллельно друг другу, распределение расплавленной агарозы на среднем слайде, и положить слайд, который поперек верхней части других слайдов. Полезно, однако, собрать слайд-мейкера аппарат, который позволяет для модификации ширины для производства устойчивых, конкретных ситуационных агарозных колодок. Простой слайд-мейкер, который дает гибкость ширины колодки состоит из платформы (pipette советы держатель или скамейке), два слайда микроскопа, и лабораторная лента, действуя в качестве колодки ширины регулирующий механизм(Рисунок 1A). Точная толщина площадки будет зависеть от требований времени изображения, марки агарозы, температуры, герметика, скорости испарения и т.д. Таким образом, важно откалибровать систему визуализации до получения данных для повышения технической воспроизводимости и повышения качества изображения живых клеток1,2,3. Поверхность пада, жесткость и состав необходимы при длительном приобретении изображения. Агароз имеет низкую фоновом унитеску, может быть легко формована, и при соответствующей концентрации, выдерживает структурную деформацию из-за испарения. Кроме того, сочетание расщепления дрожжевых носителей с агарозой не ставит под угрозу качество изображения и позволяет проводить расширенное наблюдение за несколькими циклами митоза и мейоза. Кроме того, важно, чтобы избежать каких-либо пузырьков воздуха для замедленной микроскопии. Внутри агарозных прокладок и в образце, воздушные карманы расширяются с течением времени, вызывая смещение клеток и нарушение фокусных плоскостей. При условии, что клетки эффективно рассредоточены путем вращения coverslip, исследователи могут следить за митотические процессы через несколько поколений и меотических событий от ядерного синтеза к споруляции. Изготовление и выбор правильной площадки для визуализации экспериментов требует времени, чтобы освоить, но как только достигнуто, может способствовать высокоинформативным микроскопом наблюдений.
Как и в случае с другими методами, живая клеточная микроскопия не свободна от технических ограничений. Использование флуоресцентно помеченных белков вводит границы экспериментов, которые ограничивают сферу того, что может быть изучено. Фото-отбеливание и фото-токсичность являются проблемами, типичными для длительного приобретения изображения. Они могут быть противодействовать, не подвергая клетки короткие длины волн слишком долго или слишком часто. Для экспериментов с участием GFP, CFP, YFP, mRFP и DsRed, типичные флуоресцентные белки, используемые в расщеплении дрожжей живой клетки изображения, он является общим для использования 5-15% возбуждения света и 100-500 мс время воздействия для рутинных экспериментов. Однако эти параметры меняются в соответствии с конкретными требованиями исследователя к эксперименту. Кроме того, z-stacks, состоящий из 9-13 секций с интервалом 0,5 мкм с использованием 60-кратный цели достаточно, чтобы решить толщину деление дрожжевой клетки. Кроме того, важно подтвердить, что флуоресцентные маркеры не нарушают надлежащей регуляции или функции целевых белков или генерировать ложные фенотипы. Таким образом, желательно построить штаммы, содержащие различные флуоресцентные и сродни теги для одного и того же гена цели, чтобы подтвердить наблюдения различными средствами. Кроме того, на этом исследователи несут ответственность за то, чтобы экспериментальные параметры могли воспроизводиться в ходе экспериментов и чтобы собранные данные подходят для анализа ниже по течению1,3. Никакая технология не может заменить проверенную временем практику тщательной проверки экспериментальных систем путем тщательного наблюдения и тщательного изучения линейности при обнаружении флуоресцентных сигналов.
Наконец, крайне важно анализировать данные микроскопии в форматах, которые не изменяют необработанные изображения. Фиджи предоставляет отличные инструменты документации для отслеживания необработанных измерений данных и позволяет исследователям изучить различные параметры клеток в течение одного сеанса. Эти особенности, а также его богатство онлайн-учебников и обширного охвата литературы, делают Фиджи важным инструментом для измерения, анализа и представления данных изображения живых клеток, которые описывают ядерную динамику расщепления дрожжей при митозах и мейозе.

Микроскопия живых клеток позволяет исследователям исследовать ядерную динамику, не убивая деление дрожжевых клеток и устраняет необходимость в смертельных фиксаторах и пятнах. Можно наблюдать стабильность, движение, локализацию и время флуоресцентно помеченных белков, которые участвуют в важных событиях, таких как репликация хромосомы, рекомбинация и сегрегация, в дополнение к мембране и цитоскелету Движения. Поддерживая жизнеспособность клеток и нетоксичный сигнал обнаружения, есть минимальное физиологическое вторжение. При правильном выполнении этот метод микроскопии может уменьшить смешанные эффекты, возникающие в результате расширенной технической обработки или от ложной химической реактивности. Кроме того, в ходе эксперимента, исследователи могут сделать соответствующие наблюдения деления дрожжей питания и стрессовых состояний, пролиферативной эффективности и апоптотический статус, которые указывают на неуместные параметры изображения или ненормальной физиологии клеток1 ,2,3.
Митоз и мейоз характеризуются ядерным и клеточным делением. При мейозе, в отличие от митоза, генетическое содержание вдвое, как родительские клетки приводят к дочерним клеткам4. Поскольку живая клеточная визуализация обеспечивает временное измерение в дополнение к пространственным отношениям, большое количество клеток может быть исследовано в режиме реального времени. Микроскопия живых клеток позволила исследователям изучить динамику ядерного деления с помощью флуоресцентных меток для гистонов5, сплоченных субъединиц6, микротрубочки7, центромеры8, кинетохоры9, компоненты вращанищее тело полюса (SPB)10, и те из хромосомного пассажирского комплекса (CPC)11. Вне аппарата сегрегации хромосом, живая контора изображения также захватили поведение белков, необходимых, но не непосредственно участвует в сегрегации хромосомы. Функция этих белков было показано, влияют на репликацию, хромосома рекомбинации, ядерное движение, и хромосома привязанности к микротрубочки12,13,14. Эти наблюдения способствовали лучшему пониманию клеточных явлений, функциональные компоненты которых не поддаются биохимической или генетической экспертизе. С новыми достижениями в области технологии микроскопии, ограничения, такие как плохое разрешение, фотоотража, фототоксичность, и стабильность фокуса уменьшится, тем самым способствуя улучшению в режиме реального времени наблюдения митотической и мейотической ядерной динамики1, 2,3. Meiosis является особенно сложной задачей, поскольку это терминальный путь дифференциации, который требует пристального внимания к времени.
Цель юга в этом протоколе состоит в том, чтобы представить относительно простой метод изучения в реальном времени динамики ядерного деления дрожжей при митозах и мейозе. Для этого необходимо использовать клетки, которые не подвергались воздействию экологического стресса, подготовить агарозные прокладки, которые могут выдержать длительную визуализацию, и смонтировать клетки в плотности, которые облегчают визуализацию одноклеточной динамики. Кроме того, в этом протоколе используются клетки, несущие флуоресцентно помеченные белки, которые служат полезными маркерами для ядерной кинетики (Hht1-mRFP или Hht1-GFP), хромосомной сегрегации (Sad1-DsRed), динамики цитоскелетов (Atb2-mRFP), транскрипционной активации в G1/S (Tos4-GFP) и стабильности сплоченности в мейозе (Rec8-GFP). Этот метод также вводит дополнительные ядерные и цитозолические маркеры(таблица I), которые могут быть использованы в различных комбинациях для решения вопросов о конкретных клеточных процессов. Кроме того, основные инструменты Фиджи представлены, чтобы помочь исследователям обрабатывать изображения живых клеток и анализировать различные типы данных. Сила этого подхода проистекает из использования в режиме реального времени наблюдений белковой динамики, времени и стабильности для описания процессов, которые являются неотъемлемой частью для правильного исполнения митоза и мейоза.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60x Plan Apochromat objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>AMEP4694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>7558B</td>
			<td>IB4917-10 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer rotator</td>
			<td>Stovall</td>
			<td>US Patent #4.702.610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-6768-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H20,</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3306-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-0759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Convolve 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSnap HQ CCD camera</td>
			<td>Roper</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H20,</td>
			<td>END</td>
			<td>CX-2185-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaVision deconvolution fluorescence microscope</td>
			<td>GE Healthcare/Applied Precision</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffraction PSF 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2023;1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl2&#183;6H2O</td>
			<td>END</td>
			<td>FX9259-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat plate</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>Thermo Lyne</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris deconvolution software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Shell lab</td>
			<td>#3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iterative Deconvolve 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>6858-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7387-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5626-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract (ME)</td>
			<td>MP</td>
			<td>4103-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H20</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0288-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4,</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>6192-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-0878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2S04</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>8024-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid,</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pantothenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>s80119WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pombe glutamate medium (PMG)</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2060-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>softWorx v3.3 image processing software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sporulation Medium powder</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>1821-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allwgra 6KR xentrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0847-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Equaline</td>
			<td>F79658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.03753.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract plus supplements (YES)</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2011-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4382-04</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of mitotic and meiotic fission yeast nuclear dynamics by fluorescence live-cell microscopy

Визуализация в живых клетках — это метод микроскопии, используемый для изучения динамики клеток и белков в живых клетках. Этот метод визуализации не является токсичным, как правило, не вмешивается в физиологию клеток, и требует минимальной экспериментальной обработки. Низкий уровень технических помех позволяет исследователям изучать клетки в нескольких циклах митоза и наблюдать мейоз от начала до конца. Используя флуоресцентные метки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и красный флуоресцентный белок (RFP), исследователи могут анализировать различные факторы, функции которых важны для таких процессов, как транскрипция, репликация ДНК, сплоченность и сегрегация. В сочетании с анализом данных с использованием Фиджи (бесплатная, оптимизированная версия ImageJ) изображения в живых клетках предлагают различные способы оценки движения белка, локализации, стабильности и времени, а также ядерной динамики и сегрегации хромосом. Однако, как и в случае с другими методами микроскопии, живо-клеточная визуализация ограничена внутренней свойствами света, которые ограничивают способность разрешения при высоких увеличениях, а также чувствительны к фотоотбелечению или фототоксичности при высокой длине волны Частоты. Однако, с некоторой осторожностью, исследователи могут обойти эти физические ограничения, тщательно выбирая правильные условия, штаммы и флуоресцентные маркеры, чтобы обеспечить соответствующую визуализацию митотических и мейотических событий.

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy at JoVE.com

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Здесь мы представляем живую клетку изображения, которая является нетоксичным методом микроскопии, который позволяет исследователям изучать поведение белка и ядерной динамики в живых клеток дрожжей деления во время митоза и мейоза.

Изучение митотической и меиотической разложения дрожжей ядерной динамики флуоресценции Live-клеток Микроскопии

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Микроскопия живых клеток позволяет исследователям изучать деления дрожжей ядерной динамики в митоз и мейоз в режиме реального времени. Сила этого метода происходит от изучения ядерных процессов в живых клетках в нормальных физиологических условиях, что устраняет необходимость токсичных фиксаторов и пятен. В этом методе рассматриваются вопросы, связанные со сроками использования белка, стабильностью и подвижностью, которые не могут быть подотменены генетическим или биомеханическим манипуляциям.Очень важно обратить пристальное внимание на здоровье и пригодность клеток деления дрожжей перед визуализацией. Всегда изучите морфологию и характеристики роста, чтобы обеспечить согласованность результатов в ходе экспериментов. Этот протокол показывает относительно простой способ подготовки слайдов микроскопа, которые при правильной освоении могут повысить консистенцию и воспроизводимость длительной визуализации живых клеток.Для того чтобы начать выбрать вверх вещество клетки от криогенной пластины пробуждения, Streak оно на плиты YES, и инкубировать их на 25 градусах Celsius или 32 градусах Celsius в зависимости от генотипа дрожжа для того чтобы wake up напряжения дрожжей расщепления от криогенного консервации. Затем используйте стерильную петлю, чтобы выбрать клетки из отдельных колоний в пробужденные штаммы дрожжей деления и привить их в пробирки, содержащие три миллилитров жидкой среды ДА. Поместите трубки в шейкер при 150 до 220 об/мин, чтобы расти при 25 или 32 градусах по Цельсию на ночь до позднего входа фазы с желаемой оптической плотности чтения от 0,7 до 1,0.Перенесите 10 микролитров культуры на слайд микроскопа. Положите крышку и поместите его под микроскопом, чтобы проверить на наличие надлежащей морфологии клеток и питательное состояние. Чтобы создать слайд микроскопа для анализа митоза или мейоза сначала добавить два грамма агарозы в 500-миллилитровой колбе, содержащей 100 миллилитров либо минимальной среды плюс добавки для митоза или жидкой sporulating среды для мейоза.Разогрейте раствор агарозы в микроволновой печи мощностью 60% в 10-секундных приращениях или поместите стакан в водяную баню 55 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Закружить решение для обеспечения эффективного плавления. Настройка двух слайдов микроскопа на держатель наконечник пипетки с верхней слайд опираясь на два стека лабораторной ленты на обоих концах в качестве поддержки решений крест формы.Отрегулируйте расстояние между двумя слайдами до более чем двух миллиметров, чтобы сформировать толстую площадку в следующих шагах для длительного изображения. После охлаждения расплавленной агарозы в течение одной минуты при комнатной температуре, удалите верхнюю горку и используйте широкий кончик пипетки, чтобы обойтись от 50 до 100 микролитров на нижней слайде, чтобы сделать пятно. Прежде чем агароза остынет место верхней слайд на вершине для создания распространения площадку около одного и 1 / 2 до двух сантиметров в диаметре.Оптимальная визуализация живых клеток имеет решающее значение для последующих этапов обработки данных. Убедитесь, что для устранения любых воздушных безделушек в расплавленной агарозы и создать тонкую площадку для изображений периодов более четырех часов. Для изучения митотических событий растут клетки из стартовых культур либо в жидкой EMM или PMG плюс добавки в одночасье.Перенесите один миллилитр культуры в кювет и измерьте на спектрофотометре на длине волны 595 нанометров. Рост клеток считается фазой среднего журнала, когда оптическая плотность достигает 0,4. Затем центрифуга один миллилитр клеточной суспензии при 1, 375 раз г в течение одной минуты.Удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы в минимальной среде плюс добавки к окончательному объему 100 микролитров. Для изображения мейотических событий растут клетки из стартовых культур в минимальной среде плюс добавки в одночасье. Рост клеток считается фазой позднего входа, когда оптическая плотность на 595 нанометров составляет от 0,7 до одного.Далее, из позднего журнала культур получить 500 микролитров каждого штамма типа мат, H отрицательный и H положительный, и объединить, чтобы сделать одну миллилитровую подвеску клеток. Центрифуга клетки на 1, 375 раз г в течение одной минуты. Удалите супернатант и повторно посовелите гранулы в один миллилитр жидкого экстракта мальтозы.Повторите экстракт мальтозы мыть еще три раза, чтобы обеспечить эффективное удаление питательных веществ. После последнего экстракта мальтозы промыть повторно в течение одного миллилитра экстракта мальтозы и перенести смесь в 50-миллилитровую колбу, содержащую девять миллилитров экстракта мальтозы. Инкубация в течение 12-16 часов при 22-25 градусах Цельсия при минимальной скорости вращения от 50 до 100 об/мин.Появление многих круглых сгустков дрожжей деления в результате обильной самофоккуляции указывает на эффективное спаривание. Затем возьмите одноми миллилитровый образец культуры спаривания и центрифуги в 1 375 раз г в течение одной минуты. Удалите 750 микролитров супернатанта и повторно посовелите клетки в оставшемся супернатанте.Vortex энергично в течение пяти секунд, чтобы нарушить сгустки. Выдайте 20 микролитров митотической или мейотической клеточной подвески на 2%агарозной прокладке. Удалите излишки среды, инвертирование слайда и положить его на верхней части без ворса бумажное полотенце в течение двух-трех секунд.Переверните слайд и аккуратно поместите стеклянную крышку на верхней части колодки, гарантируя, чтобы не генерировать пузырьки воздуха. Для создания ячейки монослой повернуть крышку по часовой стрелке с указательным пальцем для одного полного оборота для митозных клеток или два полных оборота для клеток мейоза. Убедитесь, что клеточное вещество рассеивается по всей агарозной площадке, позволяющей лучше разъенять одиночные клетки или asci.С помощью небольшой деревянной палки обойтись расплавленного углеводородного герметика по краям крышки для уплотнения каждой агарозы площадку. После того, как агарозная площадка запечатана место его на стадии микроскопа. Включите температурную камеру и установите ее до нужной температуры.Поместите тарелку с мокрым бумажным полотенцем в камеру для контроля влажности микроскопной системы. Пусть он equilibrate в течение 10 до 15 минут при соответствующих условиях изображения. Это позволяет любым оставшимся пузырькам воздуха рассеиваться и любые сдвиги агарозы в последнюю минуту происходят.Используйте цель 40X, чтобы найти соответствующие поля зрения для изображения. Переключитесь на цель 60X, чтобы начать сбор данных. В программном обеспечении, которое контролирует функцию микроскопа, выберите наборы фильтров микроскопа, которые лучше всего соответствуют флюорофорам под наблюдением.Отрегулируйте длины волн возбуждения, чтобы соответствовать используемым фторфорам, используйте самую низкую мощность возбуждения, которая производит последовательный сигнал, и используйте время экспозиции от четырех до восьми часов для генерации приемлемых, но поддающихся количественной оценке и воспроизводимых данных изображений. Соберите не менее шести очков времени приобретения каждый час. В программном обеспечении для сбора изображений выберите по крайней мере один канал флуоресценции, с которого можно получить данные и использовать запас, состоящий из 13 секций с интервалом 0,5 микрометра.В программном обеспечении Фиджи загрузить deconvolved изображение, выбрав Функцию импортера Bio-Formats под плагины меню. В всплывающем окне Import Options выберите Hyperstack, режим цвета по умолчанию, проверьте Autoscale и нажмите кнопку OK. Убедитесь, что отображаемое окно имеет правильное количество флуоресцентных каналов и временных рамок путем прокрутки боком на соответствующих барах внизу.Сохранить как файл Tiff, который не сжимает данные. Затем в меню Analyze используйте опцию Set Measurements для выбора различных параметров. Например: область, максимальное серое значение Min, интегрированная плотность, среднее серое значение, медиана, положение стека, периметр и метка дисплея.Выберите цвет и нажмите на инструмент каналов. В всплывающем окне каналов проверяют цветной канал, для которого будет измеряться интенсивность или область. Выберите изображение, затем ввените и нажмите на 32-битный.Выберите функции Регулировки и Порога в меню Изображения. Проверьте темную фоновую коробку, выберите метод по умолчанию и выберите Красный, чтобы наложить сигналы, представляющие интерес. Используйте инструмент палочки, чтобы выделить каждую структуру интереса и нажмите букву T на клавиатуре, чтобы добавить выбранную рентабельность инвестиций в всплывающее окно менеджера рентабельности инвестиций.Затем откройте папку ROI на молнии, чтобы загрузить менеджера рентабельности инвестиций и нажмите на каждый идентификатор рентабельности инвестиций в левой боковой панели. Выберите Меру из меню Анализ и повторите эту команду на каждом идентификаторе рентабельности инвестиций для количественной оценки объектов, представляющих интерес во всех срезах стека изображений. Сохраните результаты в качестве файла CSV для статистического анализа.В этом исследовании, если клетки голодают из-за ограничения питательных веществ или разрастание, они будут показывать избыток вакуолов и уменьшился размер клеток. Логаритмические клетки показывают активную репликацию ДНК и деление клеток, а также панъядерное выражение Tos4-GFP и разделение очагов Sad1-DsRed. Неспособность к спариванию, как в случае, когда клетки недостаточно голодают азота, будет препятствовать их ввода мейоза.Показана пара клеток деления, проходящих кариогамию. Надежная флоккуляция суспензии брачных клеток увеличивает взаимодействие между клетками и, таким образом, указывает на успешное спаривание и эффективную мейотическую индукцию. Зиготические asci принимают различные формы, в том числе зигзагообразные и банановые формы клеток.В митозе, как клетки переход от метафазы к телофазе, первое изменение включает в себя сокращение ядерного размера в метафазе, в то время как второй показывает расщепление ядра во время анафазы. Помимо совместного использования некоторой динамики сегрегации с митотических клеток, мейотические клетки обладают ядерными колебаниями во время гомологичной рекомбинации и дальнейшего сокращения нуклеозидов в конце анафазы II.It ответственность исследователей за обеспечение того, чтобы параметры эксперимента могут быть воспроизведены в ходе экспериментов, и что собранные данные подходят для анализа вниз по течению. Визуализация живых клеток позволила следователям детально изучить механику ядерного деления в митозе и мейозе.По мере того как флуоресцентные метки и возможности микроскопа улучшают число и тип процессов, которые мы можем наблюдать, будут увеличиваться.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Живая изображений Сотовые Ф-актина Динамика через Флуоресцентный Спекл микроскопия (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Покадровый Визуализация Митоз После трансфекции миРНК

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Количественные живой клетки флуоресцентной микроскопии Анализ деления дрожжевой

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Приобретение флуоресценции интервальной съемки бутонизации дрожжей и анализ Одноклеточный динамики с использованием ПРОТЕЗОВ

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Экспертиза<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинок трахеи Клетки терминала с помощью световой микроскопии

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Микроскопия делящихся дрожжей Жизненный цикл сексуальной

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Пространственно-временная Анализ Cytokinetic События в делящихся дрожжей

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Живой клетки микроскопии флуоресцирования соблюдать основные процессы во время роста микробных клеток

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live Cell Imaging для оценки динамики метафазных сроков и клеточной судьбы после Митотической Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...