Name: examination of mitotic and meiotic fission yeast nuclear dynamics by fluorescence live-cell microscopy
Uploaded: 2019-06-24T14:45:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy at JoVE.com

Författarna vill tacka Natalia La Fourcade och Mon LaFerte för att göra utarbetandet av detta manuskript en roligare strävan. Tack till medlemmar i Forsburg Lab som bidragit till slutförandet av detta arbete med sin insikt, experiment idéer och moraliskt stöd. Detta projekt stöddes av NIGMS R35 GM118109 till SLF.

<ol>
	<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy&#8211;tips+and+tools.">Live-cell microscopy&#8211;tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+techniques+to+examine+DNA+replication+in+fission+yeast.">Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast.</a> DNA Replication. (13-41), (2015).</li><li>Lee, J. Y., Kitaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner&#8217;s+guide+to+rigor+and+reproducibility+in+fluorescence+imaging+experiments.">A beginner&#8217;s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).</li><li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis:+an+overview+of+key+differences+from+mitosis.">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859 (2015).</li><li>Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+stress+in+early+S+phase+generates+apparent+micronuclei+and+chromosome+rearrangement+in+fission+yeast.">Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).</li><li>Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+cohesin-based+chromosome+structure+is+essential+for+homologous+chromosome+pairing+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).</li><li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates.">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622 (2012).</li><li>Klutstein, M., Fennell, A., Fern&#225;ndez-&#193;lvarez, A., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+bouquet+regulates+meiotic+centromere+assembly.">The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).</li><li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates.">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622 (2012).</li><li>Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+yeast+Taz1+protein+is+required+for+meiotic+telomere+clustering+and+recombination.">Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination.</a> Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).</li><li>Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B+prevents+chromosome+arm+separation+defects+by+promoting+telomere+dispersion+and+disjunction.">Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction.</a> Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).</li><li>Mastro, T. L., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+meiotic+crossovers+and+reduced+genome+stability+in+absence+of+Schizosaccharomyces+pombe+Rad16+(XPF).">Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF).</a> Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).</li><li>Escorcia, W., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilization+of+the+replication+fork+protection+complex+disrupts+meiotic+chromosome+segregation.">Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).</li><li>Fennell, A., Fern&#225;ndez-&#193;lvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+and+centromeres+have+interchangeable+roles+in+promoting+meiotic+spindle+formation.">Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).</li><li>Forsburg, S. L., Rhind, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+methods+for+fission+yeast.">Basic methods for fission yeast.</a> Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).</li><li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in enzymology. 470, 759-795 (2010).</li><li>. ImageJ User Guide &#8212; IJ&#8201;1.46 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html</a> (2019)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+DNA+replication+checkpoint+to+MBF+cell&#8208;cycle+transcription+reveals+a+distinct+class+of+G1/S+genes.">Linking DNA replication checkpoint to MBF cell&#8208;cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes.</a> The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).</li><li>Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+anaphase+promoting+complex+substrates+in+S.+cerevisiae.">Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (9), e45895 (2012).</li><li>Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+Rec8+is+required+for+reductional+chromosome+segregation+at+meiosis.">Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis.</a> Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).</li><li>Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+fission+yeast+UNC-13/Munc13+protein+Ync13+in+late+stages+of+cytokinesis.">Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).</li><li>Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+global+Cdc42+guanine+nucleotide+exchange+factors+for+fission+yeast+cell+polarity+are+coordinated+by+microtubules+and+the+Tea1&#8211;Tea4&#8211;Pom1+axis.">Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1&#8211;Tea4&#8211;Pom1 axis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580 (2018).</li><li>Dudin, O., Bendez&#250;, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast.">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+secretory+cargo+transport+within+the+Golgi+apparatus.">Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li><li>Kraft, L. M., Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+mechanism+for+mitochondria-dependent+dynein+anchoring.">A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2019).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Live-cell Imaging under Mitos och meios ger möjlighet att undersöka kärnkrafts dynamik utan att väsentligen störa fission jäst fysiologi vid datainsamling. Försiktighet måste dock iakttas för att säkerställa att cellerna växer till de önskade tätheter som är fria från miljömässiga påfrestningar. och för meiosis, att cellerna är avbildade under tiden för Terminal differentiering och inte för tidigt eller sent. Överskott cellulära trängsel, svält, och olämpliga tillväxt temperaturer är vanliga faktorer som bidrar till irreproducerbara observationer. Dessutom, Understam konstruktion, är det viktigt att testa att fluorescerande Taggar inte stör funktionerna av målgener eller inverkan övergripande cell kondition. Underlåtenhet att noggrant inspektera fenotyperna av stammar som transporterar fluorescerande markörer kan resultera i inkonsekventa och ojämförliga resultat över liknande genotyper.
Även Mikroskop aguppstod kuddar är enkla att montera, kan de också utgöra ett hinder för att få värdefulla bild data. Skapa aguppstod kuddar är så enkelt som att placera tre mikroskopbilder parallellt med varandra, dispensering smält aguppstod på mitten bilden, och sätta en bild som transverses toppen av andra bilder. Det är dock användbart att sätta ihop en Slide-Maker apparat som möjliggör bredd ändringar för att tillverka resistenta, situations-specifika aguppstod kuddar. En enkel Slide-Maker som ger pad bredd flexibilitet består av en plattform (pipettspetsar innehavaren eller bänken), två Mikroskop diabilder och Lab tejp fungerar som pad-bredd justeringsmekanism (figur 1a). Exakt pad tjocklek kommer att bero på bildbehandling tid krav, aguppstod varumärke, temperatur, täckslip tätningsmedel, avdunstning hastighet, etc. Därför är det viktigt att kalibrera avbildnings systemet före datainsamling för att öka den tekniska reproducerbarheten och för att förbättra kvaliteten på Live-cell Imaging1,2,3. Pad yta, styvhet och sammansättning är väsentliga under långvarig bild förvärv. Aguppstod har låg bakgrund fluorescens, kan lätt formas, och vid lämplig koncentration, tål strukturell deformation på grund av avdunstning. Dessutom, att kombinera fission jästmedia med aguppstod inte äventyrar bildkvaliteten och möjliggör utökad observation av flera mitoser och meios cykler. Också, det är viktigt att undvika eventuella luftbubblor för Time-lapse mikroskopi. Inuti aguppstod kuddar och inom provet, luftfickor expandera över tiden, orsakar cell-Shifting och störa fokalplan. Förutsatt celler sprids effektivt isär av täckslip rotation, kan forskarna följa mitotiska processer över flera generationer och meiotiska händelser från kärnfusion till sporulation. Att göra och välja rätt pad för bild experiment tar tid att behärska, men en gång uppnåtts, kan bidra till mycket informativa Mikroskop observationer.
Som är fallet med andra metoder, är Live-cell mikroskopi inte fri från tekniska begränsningar. Användningen av Fluorescent-märkta proteiner introducerar gränser för experiment som begränsar omfattningen av vad som kan studeras. Foto-blekning och foto-toxicitet är problem som är typiska för långvarig bild förvärv. De kan motverkas genom att inte utsätta celler för korta våglängder för länge eller för ofta. För experiment med GFP, CFP, YFP, mRFP och DsRed, typiska fluorescerande proteiner som används i fission jäst Live-cell Imaging, är det vanligt att anställa 5-15% excitation ljus och 100-500 ms exponeringstid för rutinmässiga experiment. Dessa parametrar ändras dock enligt forskarens specifika experiment krav. Dessutom, z-stackar består av 9-13 sektioner med 0,5 μm mellanrum med hjälp av en 60x mål är tillräckligt för att lösa tjockleken på en fission jästcell. Dessutom är det viktigt att bekräfta att fluorescerande markörer inte stör korrekt reglering eller funktion av målproteiner eller genererar falska fenotyper. Det är därför tillrådligt att konstruera stammar som innehåller olika fluorescerande och affinitet taggar för samma målgen att bekräfta observationer på olika sätt. Dessutom är det forskarnas ansvar att se till att experimentella parametrar kan återges över experiment och att de insamlade uppgifterna är lämpade för efterföljande analys1,3. Ingen teknik kan ersätta den beprövade praxis att noggrant validera experimentella system genom noggrann observation och noggrann undersökning av linearitet för att upptäcka fluorescerande signaler.
Slutligen är det viktigt att analysera mikroskopi data i format som inte ändrar RAW-bilder. Fiji ger utmärkta dokumentationsverktyg för att hålla koll på rådata mätningar och gör det möjligt för forskare att undersöka olika cell parametrar i en enda session. Dessa funktioner, liksom dess rikedom av online-tutorials och omfattande litteratur täckning, göra Fiji ett viktigt verktyg för att mäta, analysera och presentera levande cell avbildning data som beskriver den nukleära dynamiken i fission jäst i Mitos och meiosis.

Live-cell Mikroskop gör det möjligt för forskare att undersöka kärnkrafts dynamik utan att döda fission jästceller och eliminerar behovet av dödliga fixeringsmedel och fläckar. Det är möjligt att iaktta stabilitet, rörelse, lokalisering och timing av fluorescerande märkta proteiner som är involverade i viktiga händelser såsom kromosom replikation, rekombination och segregering, utöver membranet och cytoskeletala Rörelser. Genom att bibehålla cellernas genomförbarhet och giftfri signaldetektering finns minimalt fysiologiskt intrång. När den utförs på rätt sätt, kan denna mikroskopi metod minska störande effekter som uppstår från den utökade tekniska hanteringen eller från falsk kemisk reaktivitet. Dessutom, under ett experiment, forskare kan göra relevanta observationer av fission jäst näringsmässiga och stress stater, proliferativ effektivitet, och apoptotiska status som indikerar olämpliga Imaging parametrar eller onormal cellfysiologi1 ,2,3.
Mitos och meios kännetecknas av nukleär och cellulära division. I meiosis, i motsats till Mitos, är genetiskt innehåll halveras som föräldra celler ger upphov till dotterceller4. Eftersom levande cell avbildning ger en tidsmässig dimension utöver den rumsliga relationen, kan ett stort antal celler undersökas i realtid. Live-cell mikroskopi har gjort det möjligt för forskare att undersöka dynamiken i kärnkraft division med hjälp av fluorescerande taggar för histoner5, sammanhållande subenheter6, mikrotubuli7, centromerer8, kinetochores9, komponenter i spindeln Pole Body (SPB)10, och de av kromosom passagerar komplexet (CPC)11. Utanför kromosom segregering apparat, levande-cell Imaging har också fångat beteendet hos proteiner som behövs, men inte direkt inblandade i kromosom segregering. Funktionen av dessa proteiner har visat sig påverka replikering, kromosom rekombination, nukleär rörelse, och kromosom fastsättning till mikrotubuli12,13,14. Dessa observationer har bidragit till en bättre förståelse av cellulära händelser vars funktionella komponenter inte var mottagliga för biokemiska eller genetisk undersökning. Med nya framsteg inom mikroskopi teknik, begränsningar såsom dålig upplösning, Foto blekning, fototoxicitet och fokus stabilitet kommer att minska, vilket underlättar bättre realtid observationer av mitotiska och meiotiska nukleära dynamik1, 2,3. Meiosis är särskilt utmanande eftersom det är en Terminal differentiering väg som kräver noggrann uppmärksamhet på timing.
Målet med detta protokoll är att presentera en relativt enkel metod för att undersöka realtids-fission jäst nukleär dynamik i Mitos och meiosis. För att åstadkomma detta, är det nödvändigt att använda celler som inte har utsatts för miljö stress, förbereda aguppstod kuddar som tål långvarig avbildning, och montera celler på densiteter som underlättar visualisering av encellig dynamik. Dessutom utnyttjar detta protokoll celler som transporterar Fluorescent taggade proteiner som fungerar som användbara markörer för nukleär kinetik (Hht1-MRFP eller Hht1-GFP), kromosom segregering (Sad1-dsred), cytoskelettet Dynamics (Atb2-MRFP), transkriptionella aktivering i G1/S (Tos4-GFP) och sammanhållning stabilitet i meios (Rec8-GFP). Denna metod introducerar också ytterligare nukleära och cytosoliska markörer (tabell I) som kan användas i olika kombinationer för att hantera frågor om specifika cellulära processer. Dessutom, grundläggande Fiji verktyg är skisserat för att hjälpa forskare att bearbeta levande cell bilder och analysera olika typer av data. Styrkan i denna strategi härrör från användningen av realtid observationer av proteindynamik, timing, och stabilitet för att beskriva processer som är integrerad för korrekt genomförande av Mitos och meiosis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60x Plan Apochromat objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>AMEP4694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>7558B</td>
			<td>IB4917-10 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer rotator</td>
			<td>Stovall</td>
			<td>US Patent #4.702.610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-6768-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H20,</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3306-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-0759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Convolve 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSnap HQ CCD camera</td>
			<td>Roper</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#183;5H20,</td>
			<td>END</td>
			<td>CX-2185-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaVision deconvolution fluorescence microscope</td>
			<td>GE Healthcare/Applied Precision</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffraction PSF 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2023;1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl2&#183;6H2O</td>
			<td>END</td>
			<td>FX9259-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat plate</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>Thermo Lyne</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8125-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris deconvolution software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Shell lab</td>
			<td>#3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iterative Deconvolve 3D software plug-in</td>
			<td>OptiNav, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>6858-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7387-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8912-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5626-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract (ME)</td>
			<td>MP</td>
			<td>4103-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H20</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0288-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4,</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>6192-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-0878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2S04</td>
			<td>Mallinckvadt</td>
			<td>8024-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid,</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pantothenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>s80119WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pombe glutamate medium (PMG)</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2060-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>softWorx v3.3 image processing software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sporulation Medium powder</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>1821-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allwgra 6KR xentrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0847-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Equaline</td>
			<td>F79658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.03753.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract plus supplements (YES)</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>2011-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4382-04</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of mitotic and meiotic fission yeast nuclear dynamics by fluorescence live-cell microscopy

Live-cell Imaging är en mikroskopi teknik som används för att undersöka cell-och proteindynamik i levande celler. Denna avbildning metod är inte giftigt, i allmänhet inte stör cellfysiologi, och kräver minimal experimentell hantering. De låga nivåerna av tekniska störningar gör det möjligt för forskare att studera celler över flera cykler av Mitos och att iaktta meios från början till. Med hjälp av fluorescerande taggar som grönt fluorescerande protein (GFP) och rött fluorescerande protein (RFP), forskare kan analysera olika faktorer vars funktioner är viktiga för processer som transkription, DNA-replikering, sammanhållning, och segregation. Tillsammans med dataanalys med Fiji (en fri, optimerad ImageJ version), erbjuder live-cell Imaging olika sätt att bedöma protein rörelser, lokalisering, stabilitet och timing, samt nukleär dynamik och kromosom segregering. Men som är fallet med andra mikroskopi metoder, Live-cell Imaging begränsas av inneboende egenskaper av ljus, som sätter en gräns för upplösningen makt vid höga förstoringar, och är också känslig för foto blekning eller fototoxicitet vid hög våglängd Frekvenser. Men med viss omsorg, utredare kan kringgå dessa fysiska begränsningar genom att noggrant välja rätt villkor, stammar, och fluorescerande markörer för att möjliggöra en lämplig visualisering av mitotiska och meiotiska händelser.

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy at JoVE.com

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Här presenterar vi Live-cell Imaging som är en giftfri mikroskopi metod som gör det möjligt för forskare att studera protein beteende och nukleär dynamik i levande fission jästceller under Mitos och meiosis.

Undersökning av mitotiska och Meiotic fission jäst nukleär dynamik genom fluorescens Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live cell mikroskopi gör det möjligt för forskare att studera fission jäst nukleärdynamik i mitos och meios i realtid. Styrkan i denna metod kommer från att studera nukleära processer i levande celler under normala fysiologiska förhållanden vilket eliminerar behovet av giftiga fixativ och fläckar. Denna teknik behandlar frågor relaterade till protein timing, stabilitet och rörlighet som kanske inte är mottagliga för genetisk eller biomekanisk manipulation.Det är viktigt att ägna stor uppmärksamhet åt hälsa och lämplighet fission jästceller innan imaging. Alltid undersöka morfologi och tillväxt egenskaper för att säkerställa konsekvens av resultaten över experiment. Detta protokoll visar det relativt enkla sättet att förbereda mikroskop diabilder som när behärskar korrekt kan förstärka konsistens och reproducerbarhet av långvarig levande cell avbildning.För att börja plocka upp cellsubstans från kryogen vakna platta, Streak det på JA plattor, och inkubera dem på 25 grader Celsius eller 32 grader Celsius beroende på jäst genotyp för att vakna upp fission jäst stammar från kryogena bevarande. Använd sedan en steril slinga för att plocka celler från enskilda kolonier i de uppvakna fissionsjäststammarna och inokulera dem i provrör som innehåller tre milliliter YES-flytande medium. Placera rören i en shaker på 150 till 220 rpm att växa vid 25 eller 32 grader Celsius över natten till sent log fas med en önskad optisk densitet läsning av 0,7 till 1,0.Överför 10 mikroliter av kulturen till ett mikroskop glida. Sätt ett täckkol på och placera den under ett mikroskop för att kontrollera om det finns rätt cellmorfologi och näringstillstånd. För att ställa in ett mikroskop bild för mitos eller meios analys först lägga till två gram av agaros i 500-milliliter kolven som innehåller 100 milliliter av antingen minimalt medium plus kosttillskott för mitos eller flytande sporulerande medium för meios.Värm agaroslösningen i en mikrovågsugn vid 60%effekt i steg om 10 sekunder eller placera bägaren i ett 55 grader Celsius vattenbad i 10 minuter. Snurra lösningen för att säkerställa effektiv smältning. Ställ in två mikroskop diabilder på en pipett spetshållare med den övre bilden vilar på två högar av lab tejp i båda ändar som stöd gör en kors form.Justera avståndet mellan de två objektglasen till större än två millimeter för att bilda en tjock dyna i följande steg för långvarig bildbehandling. Efter kylning av smält agaros i en minut vid rumstemperatur, ta bort den övre bilden och använda en bred bore pipett spets för att dispensera 50 till 100 mikroliter på botten slide för att göra en plats. Innan agaros kyls ner placera den övre bilden på toppen för att generera en spridning pad på cirka en och 1 /2 till två centimeter i diameter.Optimal livecellavbildning är avgörande för efterföljande databearbetningssteg. Se till att eliminera eventuella luftbaubles i smält agaros och skapa en tunn pad för bildbehandlingsperioder längre än fyra timmar. Att undersöka mitotiska händelser växa celler från starter kulturer i antingen flytande EMM eller PMG plus kosttillskott över natten.Överför en milliliter av kulturen till en cuvette, och mät på spektrofotometern vid en våglängd på 595 nanometer. Celltillväxten anses vara mitten av log-fasen när den optiska densiteten når 0,4. Därefter centrifugera en milliliter av cellupphängningen vid 1, 375 gånger g i en minut.Ta bort supernatant och resuspend cellen pelleten i minimalt medium plus kosttillskott till en slutlig volym av 100 mikroliter. Till bild meiotiska händelser växa celler från förrätt kulturer i minimalt medium plus kosttillskott över natten. Celltillväxt anses sent-log fas när den optiska densiteten vid 595 nanometer är mellan 0,7 och en.Därefter, från sent-log kulturer erhålla 500 mikroliter av varje mate typ stam, H negativa och H positiva, och kombineras för att göra en en milliliter cell suspension. Centrifugera cellerna vid 1, 375 gånger g i en minut. Ta bort supernatanten och resuspend pelleten i en milliliter av flytande maltosextrakt.Upprepa maltosextrakttvätten tre gånger till för att säkerställa effektiv borttagning av näringsämnen. Efter den sista maltose extrakt tvätta resuspend cellerna i en milliliter maltose extrakt och överföra blandningen till en 50-milliliter kolv som innehåller nio milliliter maltosextrakt. Inkubera i 12 till 16 timmar vid 22 till 25 grader Celsius på en minimal rotationshastighet mellan 50 och 100 rpm.Utseendet på många runda fission jäst klumpar följd av riklig själv-flocculation indikerar effektiv parning. Därefter tar du ett en milliliterprov av parningskulturen och centrifugen vid 1, 375 gånger g i en minut. Ta bort 750 mikroliter av supernatanten och resuspend cellerna i den återstående supernatanten.Vortex kraftigt i fem sekunder för att störa klumparna. Dispensera 20 mikroliter av antingen en mitotisk eller meiotisk cellupphängning på en 2%agarospad. Ta bort eventuellt överskottsmedium genom att vända in och sätt den på ovansidan av den luddfria pappershandduken i två till tre sekunder.Vänd bilden och försiktigt placera ett glas täcker på toppen av dynan, se till att inte generera luftbubblor. Att skapa en cell monolayer rotera coverslip medurs med pekfingret för ett helt varv för mitosceller eller två hela varv för meiosceller. Se till att cellsubstansen sprids över agarospaden möjliggör bättre separation av enstaka celler eller asci.Med hjälp av en liten träpinne dispensera smält kolväte tätningsmedel längs kanterna på täckplattan för att täta varje agarose pad. När agarospaden är förseglad placera den på mikroskopet scenen. Koppla på temperaturkammaren och ställ in den på önskad temperatur.Placera en tallrik med en våt pappershandduk i kammaren för att kontrollera fuktigheten i mikroskopsystemet. Låt det jämvikt i 10 till 15 minuter vid lämpliga bildframställning villkor. Detta gör att eventuella återstående luftbubblor att försvinna och eventuella sista-minuten-agarosförskjutningar ska ske.Använd 40X-målsättningen för att hitta lämpliga synfält till bild. Byt till 60X-målet för att påbörja datainsamling. I den programvara som styr mikroskop funktion välja mikroskop filteruppsättningar som bäst matchar fluoroforer under observation.Justera excitation våglängder för att matcha fluoroforer som används, anställa den lägsta excitation makt som ger en konsekvent signal, och använda exponeringstider på fyra till åtta timmar för att generera acceptabla men kvantifierbara och reproducerbara bilddata. Samla minst sex anskaffnings tidspoäng varje timme. I bildsamlingen väljer du ut minst en fluorescenskanal för att förvärva data och använda ett Z-lager bestående av 13 sektioner med 0,5 mikrometeravstånd.I Fiji-programvaran ladda upp en deconvolved bild genom att välja Bio-Format Importer funktionen under plugin-program menyn. I popup-fönstret Importalternativ väljer du Hyperstack, Standardfärgläge, kontrollerar Autoskalning och trycker på knappen OK. Se till att det visade fönstret har rätt antal fluorescenskanaler och tidsramar genom att rulla i sidled på respektive staplar längst ner.Spara som en Tiff-fil som inte komprimerar data. Sedan under menyn Analysera använd alternativet Ange mått för att välja olika parametrar. Till exempel:Område, Min max gråvärde, Integrerad densitet, Medelvärdet av grått värde, Median, Stack-position, Perimeter och Display-etikett.Välj Färg och klicka på Channels Tool. I popup-fönstret Kanaler kontrollera Färgkanalen för vilken intensitet eller område kommer att mätas. Välj Bild, sedan Skriv och klicka på 32-bitars.Välj funktionerna Justera och Tröskelvärde under Menyn Bild. Markera rutan Mörk bakgrund, välj standardmetoden och plocka Röd för att överlagra signaler av intresse. Använd trollstavsverktyget för att markera varje struktur av intresse och tryck på bokstaven T på tangentbordet för att lägga till den valda avkastningen på investeringen i fönstret för popup-avkastningshanteraren.Därefter öppnar zippade ROI-mappen för att ladda ROI-hanteraren och klicka på varje ROI-identifierare i den vänstra sidopanelen. Välj Mät på menyn Analysera och upprepa det här kommandot på varje ROI-identifierare för att kvantifiera objekten av intresse i alla segment i bildstacken. Spara resultaten som en CSV-fil för statistisk analys.I denna studie om celler svälta på grund av näringsämne begränsning eller överväxt, de kommer att visa överskott vacuoles och minskad cellstorlek. Logaritmiska celler visar aktiv DNA-replikering och celldelning, samt pan-nuclear Tos4-GFP uttryck och Sad1-DsRed foci separation. Underlåtenhet att para sig, vilket är fallet när celler inte är tillräckligt utsvulten av kväve, kommer att hindra dem från att komma in meios.Ett par fissionsceller som genomgår karyogamy visas. Robust flocculation av parningscellupphängningen ökar cell-till-cell-interaktionen och indikerar därmed lyckad parning och effektiv meiotisk induktion. Zygotic asci ta flera former, inklusive zig-zag och banan cell former.I mitos som celler övergång från metafas till telophase, den första förändringen innebär en sammandragning av kärnstorlek i metafas, medan den andra visar kärnan uppdelning under anafas. Förutom att dela vissa segregering dynamik med mitotiska celler, meiotiska celler uppvisar nukleära svängning under homolog rekombination och ytterligare minskning av nukleosider i slutet av anafas II.It är forskarnas ansvar att se till att experimentparametrar kan reproduceras över experiment, och att insamlade data är lämpliga för nedströms analys. Live cell imaging har gjort det möjligt för utredare att undersöka i detalj mekaniken i kärnämne division i mitos och meios.Som fluorescerande taggar och mikroskop kapacitet förbättra antalet och typen av processer vi kan observera kommer att öka.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Levande cell imaging av F-aktin Dynamics via Fluorescent Speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitativa levande celler fluorescens-mikroskopi Analys av fissionsjäst

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Förvärva Fluorescens Time-lapse filmer av knoppande jäst och analysera Encelliga Dynamics med transplantat

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Undersökning av<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvernas Trakealtuber Terminal Celler med ljusmikroskop

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Mikroskopi av fissionsjäst Sexuell Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporal Analys av Cytokinetic händelser i fissionsjäst

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Levande cellen fluorescensmikroskopi för att iaktta nödvändiga processer under mikrobiell celltillväxt

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell Imaging att bedöma dynamiken i metafas timing och cell öde efter mitotiska spindel Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...