Name: in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

E. T. كان مدعوما من قبل السحر الذي يهم وAHA. C. K. كان مدعوما من قبل المنح من NICHD/NIH (R01HD086026)، AHA، وMSCRF.

ملاحظة: في المختبر جيل من خلايا القلب القلب القلب حقل محدد (الشكل 1).
1- صيانة المعدات الاستراتيجية للفأرة
<ol><li>النمو في الشركات الصغيرة والمتوسطة (mESCsTbx1-Cre؛ روزا- طلب تقديم العروض؛ HCN4-GFP، mESCIsl1-RFP)25 على 0.1٪ (ث / الخامس) ا?...

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li><li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+cardiomyocyte.">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li><li>Birket, M. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+cardiovascular+progenitors--a+developmental+perspective.">Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective.</a> Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient.">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Atrial+and+Ventricular+Cardiomyocytes+Develop+from+Distinct+Mesoderm+Populations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Galdos, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Regeneration:+Lessons+From+Development.">Cardiac Regeneration: Lessons From Development.</a> Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).</li><li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lineage+restriction+in+temporally+distinct+populations+of+Mesp1+progenitors+during+mammalian+heart+development.">Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development.</a> Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+networks+in+heart+development+and+regeneration.">Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).</li><li>Bruneau, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber-specific+cardiac+expression+of+Tbx5+and+heart+defects+in+Holt-Oram+syndrome.">Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.</a> Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+gene+regulation+in+the+second+heart+field+by+Tbx1,+Nkx2-5,+and+Islet1+reveals+a+genetic+switch+for+down-regulation+in+the+myocardium.">Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).</li><li>Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fate+map+of+Tbx1+expressing+cells+reveals+heterogeneity+in+the+second+cardiac+field.">A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field.</a> Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+Distinct+Six2-Positive+Second+Heart+Field+Progenitors+Regulate+Mammalian+Heart+Development+and+Disease.">Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease.</a> Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+neonatal+rat+system+as+a+bioincubator+to+generate+adult-like+mature+cardiomyocytes+from+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells.">Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).</li><li>Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+heart+disease:+entering+a+new+era+of+human+genetics.">Congenital heart disease: entering a new era of human genetics.</a> Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome.">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAND1+loss-of-function+mutation+contributes+to+congenital+double+outlet+right+ventricle.">HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells.">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, 02164 (2014).</li><li>Morita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall1+transiently+marks+undifferentiated+heart+precursors+and+regulates+their+fate.">Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326 (5951), 426-429 (2009).</li></ol>

في بروتوكولنا، فإننا نوصف منهجية لتوليد كرويات القلب والقلب معزول حقل مراكز المعالجة بالقلب. ويمكن استخدام هذه الآليات لدراسة آليات مواصفات CPC وخصائصها، وكذلك لنمذجة الأمراض الخاصة بغرفة القلب. واحدة سابقا نشر عمل استعمل [مسك] خطّ مع اثنان [فلسنت] مراسلات ([مف2ك/نكإكس2.5]) أن يدرس [كرديوجنسس] ...

وقد أحدث استخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs) ثورة في مجال تجديد القلب والطب الشخصي مع الخلايا النخاعية الخاصة بالمريض لنمذجة الأمراض والعلاجات الدوائية1،2،3، 4.في الآونة الأخيرة, في المختبر وقد وضعت بروتوكولات لتوليد الأذيني مقابل البطين وكذلك منظم ضربات القلب مثل PSC-مشتقات خلايا القلب 5,6. ومع ذلك، ما إذا كان يمكن إعادة تكوين القلب في المختبر لدراسة نمو القلب وتوليد خلايا القلب الخاصة بغرفة البطين لا يزال غير واضح.
خلال النمو الجنيني المبكر، الخلايا الجلدية تحت تأثير مورفيوجينات مفرزة مثل BMP4، Wnts وActivin A شكل سلسلة البدائية7. خلايا القلب الأدمة التي تميزت بالتعبير عن Mesp1، تهاجر بشكل أمامي وأخير لتشكيل الهلال القلبي ثم أنبوب القلب البدائية7،8. هذه المجموعة المهاجرة من الخلايا تشمل اثنين من السكان متميزة جدا من خلايا السلف القلبية (CPCs)، وهما حقل القلب الأول والثاني (FHF وSHF)9،10. الخلايا من SHF هي تكاثرية للغاية والهجرة وهي مسؤولة في المقام الأول عن اطالة وحلقة من أنبوب القلب. بالإضافة إلى ذلك، خلايا SHF تفرق لخلايا القلب والخلايا الليفية والعضلات الملساء والخلايا البطانية عند دخولها إلى أنبوب القلب لتشكيل البطين الأيمن، والقناة الهوائية اليمنى والجزء الأكبر من كلا الأذين7،10. وعلى النقيض من ذلك، خلايا FHF هي أقل تكاثرية والهجرة وتفرق أساسا لخلايا القلب كما أنها تؤدي إلى البطين الأيسر وجزء أصغر من الأذين11. وعلاوة على ذلك، تتميز السلف SHF من خلال التعبير عن Tbx1، FGF8، FGF10 و Six2 في حين أن الخلايا FHF التعبير عن HCN4 و Tbx511،12،13،14،15.
يمكن لـ PSCs التفريق بين الطبقات الجرثومية الثلاث وبالتالي إلى أي نوع من الخلايا في الجسم4و16 . ولذلك، فإنها توفر إمكانات هائلة لفهم نمو القلب ونمذجة عيوب نمو محددة تؤدي إلى أمراض القلب الخلقية، والسبب الأكثر شيوعا للعيوب الخلقية17. مجموعة كبيرة من أمراض القلب الخلقية تشمل تشوهات القلب الخاصة بغرفة18,19. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت هذه تنبع من تطور حقل القلب الشاذة. وبالإضافة إلى ذلك، نظرا لعدم قدرة خلايا القلب في الانتشار بعد الولادة، كانت هناك جهود واسعة النطاق لخلق أنسجة القلب لتجديد القلب1،7،20. وبالنظر إلى الاختلافات الفسيولوجية والمورفولوجية بين غرف القلب، فإن توليد أنسجة القلب الخاصة بالحجرات باستخدام مراكز الأمن العام أمر ذو أهمية كبيرة. في حين أن التقدم الأخير في أمراض القلب التنموية قد أدى إلى توليد قوي من خلايا القلب من مراكز الأمن العام، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كان يمكن أن يسبب هاتي في مجالي القلب في أنظمة PSC.
لتلخيص توليد القلب في المختبر ودراسة مواصفات وخصائص CPCs، استخدمنا سابقا نظام يستند إلى تمييز SPHeroids القلب المشتقة PSC21،22،23،24. في الآونة الأخيرة، قمنا بإنشاء الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (mESCs) مع GFP ومراسلي RFP تحت سيطرة الجين HCN4 FHF وجين SHF Tbx1، على التوالي (mESCsTbx1-Cre؛ روزا- طلب تقديم العروض؛ HCN4-GFP) 25. في المختبر mESCs متباينة شكلت كرويات القلب التي GFP + وخلايا RFP + ظهرت من منطقتين متميزتين من الخلايا الأدمية ومنقوشة بطريقة تكميلية. وأظهرت الخلايا الناتجة عن ذلك GFP+ وRFP+ خصائص FHF وSHF، على التوالي، التي تحددها التحليلات تسلسل الحمض النووي الريبي والتحليلات الكلونية. الأهم من ذلك، باستخدام mESCs تحمل مراسل Isl1-RFP (mESCIsl1-RFP)،اكتشفنا أن خلايا SHF تميزت بإخلاص من قبل بروتين سطح الخلية CXCR4، وهذا يمكن أن تمكن عزل خلايا القلب الميدانية الخاصة دون transgenes. وسيصف هذا البروتوكول توليد وعزل مراكز القلب الأساسية الخاصة بحقول القلب عن الشركات الصغيرة والمتوسطة الحجم، مما قد يكون بمثابة أداة قيمة لدراسة أمراض القلب الخاصة بالحجرات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1251px;" width="1250">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.1% (w/v) Gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100X Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1X PBS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40&#956;m cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td align="right">35223</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Activin A</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>338-AC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 minus vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BMP4</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:245px;">Sony</td>
			<td style="width:344px;">SH800</td>
			<td style="width:241px;">Sony or any other fluorescence-activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell strainer 70&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge Sorvall Legend XT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">75004508</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CHIR99021</td>
			<td>Selleck chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">51030285</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Corning Ultra Low Attachment T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Countless II FL automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571, Lot #1757130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium high glucose (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ESGRO (LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EVOS FL microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glasgow&#8217;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monothioglycero (MTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MS-295-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acid solution (NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suspension culture dish 150 mm x 25mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE (Trypsin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td align="right">72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells

الخلايا الجذعية متعددة القدرات توفر إمكانات كبيرة لفهم نمو القلب والمرض والطب التجديدي. في حين أن التقدم الأخير في أمراض القلب التنموية قد أدى إلى توليد خلايا القلب من الخلايا الجذعية متعددة القدرات، فإنه من غير الواضح ما إذا كان حقلي القلب - الأول والثاني من مجالي القلب (FHF وSHF) - مستحثة في أنظمة الخلايا الجذعية متعددة القدرات. لمعالجة هذا، وضعنا بروتوكولا للمواصفات في المختبر وعزل القلب حقل محدد خلايا القلب السلف. استخدمنا خطوط الخلايا الجذعية الجنينية تحمل HCN4-GFP وTbx1-Cre; [روسا-رفب] مراسلات من ال [فهف] وال [سهف], على التّوالي, وحيّة خلية [إيمّونّينغ] من الخلية غشاء بروتين [إكسككر4], [شف] علامة. مع هذا النهج، قمنا بإنشاء خلايا السلف التي تلخص الخصائص الوظيفية والنسخ من نظرائهم في الجسم الحي. يمكن استخدام بروتوكولنا لدراسة المواصفات المبكرة والفصل في مجالي القلب وتوليد خلايا القلب الخاصة بالحجرة لنمذجة أمراض القلب. وبما أن هذا النظام هو في المختبر، فإنه قد لا توفر معلومات تشريحية دقيقة. ومع ذلك، فإن هذا النظام يتغلب على ضعف إمكانية الوصول إلى الأجنة في مرحلة التقطير ويمكن رفعها للشاشات عالية الإنتاجية.

وبعد ما يقرب من 132 ساعة من التمايز، يمكن الكشف عن Tbx1-RFP وHcn4-GFP CPCs باستخدام المجهر الفلورسنت (الشكل2). بشكل عام، GFP وRFP تظهر الخلايا تقريبا في نفس الوقت. ولا يزال السكان في مراكز اللاجئين يتوسعون على مقربة من بعضهم البعض ونمطا تكميليا. إن ضبط تركيزات أكتيفين أ وBMP4 سيغير النسب الم?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

الغرض من هذه الطريقة هو توليد القلب حقل محدد خلايا القلب السلف في المختبر من أجل دراسة مواصفات الخلية السلف والخصائص الوظيفية، وتوليد خلايا القلب غرفة محددة لنمذجة أمراض القلب.

في المختبر جيل من خلايا القلب القلب حقل محدد

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

تهدف طريقتنا إلى توليد خلايا سلف القلب الخاصة بمجال القلب من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس. يسمح خط الخلايا الجذعية هذا المراسل الميداني للقلب بإجراء دراسة عالية الإنتاجية للآليات الكامنة تحت أمراض القلب الخلقية ، مما يوفر نظامًا قابلًا للتلاعب الجيني والصيدلانية. هناك العديد من أمراض القلب الخلقية الخاصة بغرفة معينة.من خلال تلخيص تكوين القلب في المختبر ، يسمح هذا البروتوكول بدراسة آلية المرض وتطوير العلاجات التجديدية المستقبلية. يمكن أن يوفر هذا البروتوكول نظرة ثاقبة حول كيفية تحديد الخلايا السلف القلبي من غرف مختلفة أثناء نمو القلب. تبدأ من خلال نمو الخلايا الجذعية الجنينية الماوس المعدلة وراثيا في 0.1٪ قارورة T25 المغلفة الجيلاتين في 2i المتوسطة.عندما تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ التقاء، وشطف الثقافات مع برنامج تلفزيوني وإضافة ملليلتر واحد من التربسين لكل قارورة لفك الثقافة في خلايا واحدة في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. عندما تكون الخلايا منفصلة، تحييد التفاعل مع أربعة ملليلتر 10 FBS في DMEM وفرز الخلايا بواسطة طريقة مناسبة. تمييع الخلايا إلى ما يقرب من ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الخمس لكل تركيز متوسط جديد، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.ثم إعادة تثبيت بيليه في خمسة ملليلترات من 2I المتوسطة الطازجة لإعادة الطلاء على 0.1٪ جديد قوارير T25 المغلفة الجيلاتين. بالنسبة إلى جيل CPC من الخلايا اللولبية القلبية، قم بجمع 2.5 مرة 10 إلى ستة عينة الخلايا الجذعية الجنينية الماوس المتحولة المنفصلة عن طريق الطرد المركزي، وإعادة تعليق الخلايا في 25 ملليلتر من SFD المتوسطة. لوحة تعليق الخلية في واحد 150 في 25 ملليمتر لوحة معقمة للحضانة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.في نهاية الحضانة، وجمع الزى القلب في أنبوب مخروطي. رواسب spheroids عن طريق الطرد المركزي لتسهيل العزلة الانتقائية من الروبويدات وتجنب الخلايا الفردية. Resuspend spheroids في 25 ملليلتر من SFD المتوسطة الطازجة تستكمل مع نانوغرام واحد لكل ملليلتر من أكتيفين A و 1.5 نانوغرام لكل ملليلتر من البروتين مورفوجيني العظام أربعة.إعادة النفخات مرة أخرى إلى لوحة الثقافة نفسها لاحتضان 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية. في اليوم التالي، تذكر كل من spheroids القلب عن طريق الطرد المركزي. Resuspend الهيئات الجنينية المتمايزة في 25 ملليلتر من SFD المتوسطة الطازجة للطلاء في مرفق منخفضة للغاية ، قارورة مربعة 75 سنتيمترا في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 48 ساعة.لعزل الحزب الشيوعى الصيني في مجال القلب باستخدام المراسلين الفلورسنت، وجمع الهيئات الجنينية عن طريق الطرد المركزي وفك الثقافات 3D مع ملليلتر واحد من التربسين في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. في نهاية الحضانة، اخلط جيدا عن طريق الأنابيب لفك الخلايا وتحييد التفاعل مع أربعة ملليلترات من 10٪ FBS في DMEM. تمرير الخليط على مصفاة 70 ميكرومتر لإزالة أي الهيئات الجنينية غير منفصلة، ورواسب الخلايا المصفاة عن طريق الطرد المركزي.لفرز CPCs من خلال التعبير مراسل الفلورسنت، resuspend بيليه في حل FACS 500 ميكرولترتر وتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب البوليسترين جولة أسفل خمسة ملليلتر على الجليد. ثم فرز الخلايا لعزل RFP-وGFP-التعبير عن الخلايا بواسطة FACS، وجمع الخلايا في ملليلتر واحد من FBS. لعزل أول مقابل ثاني القلب مجال CPCs على أساس التعبير عن بروتين السطح Cxcr4, resuspend واحد الماوس الجنينية خلية جذعية RFP التعبير عن خلايا السلف القلب في 300 ميكرولترات من 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني تستكمل مع الفلوريسكين-مترافق-مضادة Cxcr4.بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وغسل الخلايا ثلاث مرات في ملليلتر واحد إلى اثنين من الطازجة، وبرنامج تلفزيوني بارد في غسل. بعد الغسيل الأخير، إعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولترات من محلول FACS وتصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر في أنبوب خمسة ملليلتر، مستديرة القاع. ثم فرز الخلايا من خلال التعبير Cxcr4 بهم، وجمع كل من السكان Cxcr4 إيجابية وسلبية في أنابيب الفردية التي تحتوي على ملليلتر واحد من FPS لكل أنبوب على الجليد.لإعادة زراعة الخلايا السلف القلبية المعزولة في مجال القلب المعزولة في القلب ، قم بجمع الخلايا المخزّنة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في وسط SFD. ثم بذور ما يقرب من ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الأربع في بئر في 0.1٪ الجيلاتين المغلفة، 384-جيدا لوحة. إذا لوحظ موت الخلايا المتزايد بعد الفرز، أضف مثبطات روك 10 ميكرومولار لكل بئر.وبعد يومين من الثقافة، ينبغي ملاحظة الضرب العفوي. لتحليل قدرة CPCs مطلي على التفريق إلى cardiomyocytes، وجمع الخلايا في اليوم 12 من التمايز مع التربسين، كما هو موضح، لعزل القلبية القلبية واحدة و resuspend الخلايا في 4٪ paraformaldehyde. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وجمع الخلايا الثابتة عن طريق الطرد المركزي وغسل بيليه في برنامج تلفزيوني لإزالة مثبت الزائدة.بعد ذلك، resuspend الخلايا في 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني، واحتضان نصف عينة الخلية مع الماوس المضادة لtroponin T الأجسام المضادة واستخدام النصف الآخر من العينة كتحكم سلبي. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وغسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني جديد وإعادة تعليق العينات في 10٪ FBS زائد برنامج تلفزيوني مكملة مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة. بعد حضانة أخرى لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وغسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني جديد في الغسيل و resuspend الخلايا في 200 ميكرولتردات من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب لتحليلها على تدفق سايت عداد الخلايا.بعد حوالي 132 ساعة من التمايز، يمكن الكشف عن tbx1-RFP وخلايا سلف القلب Hcn4-GFP عن طريق المجهر الفلوري. عموما، كل من GFP وRFP تظهر الخلايا تقريبا في نفس الوقت، واثنين من مجموعات الخلايا السلف تستمر في التوسع على مقربة وعادة في نمط تكميلي. ضبط تركيزات أكتيفين A والعظام البروتين مورفونيك أربعة سوف يغير النسب المئوية للخلايا السلف القلبية في مجال القلب الأول مقابل الثاني.وبالمثل، باستخدام خط الخلايا الجذعية الجنينية الماوس مراسل RFP، بعد 132 ساعة من التمايز، RFP-إيجابية خلايا السلف القلب تظهر. بعد المناعة لCxcr4، RFP إيجابية، Cxcr4 إيجابية، وRFP إيجابية، يمكن عزل الخلايا السلبية Cxcr4. يؤكد الكبت المناعي لـ troponin T القلبي في اليوم 12 من التمايز أن خلايا حقل القلب الأول تتمايز بشكل رئيسي إلى الخلايا الفطرية.وبالمثل، فإن الخلايا المشتقة من RFP-positive, Cxcr4-سالبة الخلايا السلف القلبية تؤدي إلى خلايا القلب في نسب أعلى بكثير مقارنة بالخلايا السلف القلبي الإيجابية واحدة Cxcr4. في بعض الأحيان، تفشل الخلايا الجذعية الجنينية الماوس للتمييز بكفاءة وتشكيل أعداد منخفضة جدا من خلايا سلف القلب حقل القلب محددة. توقيت, تركيز, واتساق إضافة السيتوكينات وعدد من الخلايا حاسمة لجيل ناجح من خلايا سلف القلب غرفة محددة.بعد هذا الإجراء، يمكن للمحققين تحليل الخصائص الفسيولوجية لمختلف مجموعات الخلايا السلف القلبية للحصول على مزيد من التبصر في مواصفاتها ووظيفتها.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

اشتقاق خلايا القلب السلف من الخلايا الجذعية الجنينية

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

جيل من الفئران القلب منظم ضربات القلب المجاميع خلية استنادا ES-الخلوي البرمجة في الجمع مع Myh6-المروج-اختيار

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

بدء التمايز في الخلايا متعددة القدرات مخلد أذني السلف

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

في المختبر مستعمرة فحوصات للتميز الخلايا السلف ثلاثي قوية المعزولة من الفئران البنكرياس الكبار

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

نقص الأكسجين المسبق للخلية السلف المستمدة من نخاع كمصدر لتوليد خلايا شوان الناضجة

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

تطوير التحليل في المختبر كوانتيتاتي الجذعية المكونة للدم والسلف الخلايا (هسبكس) في تطوير الأجنة الزرد

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

الجيل الأول قلب مثل حقل المتكفل القلب و Cardiomyocytes البطين مثل من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

تحريض غشائي التمايز في خلايا القلب السلف تحت ظروف المصل منخفضة

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...