Name: in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

E. T. blev støttet af The Magic that Matters og AHA. C. K. blev støttet af tilskud fra NICHD/NIH (R01HD086026), AHA og MSCRF.

Bemærk: In vitro-generering af hjerte feltspecifikke muse hjerte progenitorceller (figur 1).
1. vedligeholdelse af muse-Esc'er
<ol><li>Dyrke Mesc'er (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP, mescISL1-RFP)25 på 0,1% (w/v) gelatine belagte T25-kolber i 2i medium (870 ml af glaskoens mindste essentielle medium (gmem), 100 ml føtal bovint serum (FBS), 10 mL glutamax, 10 ml ikke-essentielle...

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li><li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+cardiomyocyte.">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li><li>Birket, M. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+cardiovascular+progenitors--a+developmental+perspective.">Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective.</a> Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient.">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Atrial+and+Ventricular+Cardiomyocytes+Develop+from+Distinct+Mesoderm+Populations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Galdos, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Regeneration:+Lessons+From+Development.">Cardiac Regeneration: Lessons From Development.</a> Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).</li><li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lineage+restriction+in+temporally+distinct+populations+of+Mesp1+progenitors+during+mammalian+heart+development.">Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development.</a> Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+networks+in+heart+development+and+regeneration.">Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).</li><li>Bruneau, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber-specific+cardiac+expression+of+Tbx5+and+heart+defects+in+Holt-Oram+syndrome.">Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.</a> Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+gene+regulation+in+the+second+heart+field+by+Tbx1,+Nkx2-5,+and+Islet1+reveals+a+genetic+switch+for+down-regulation+in+the+myocardium.">Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).</li><li>Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fate+map+of+Tbx1+expressing+cells+reveals+heterogeneity+in+the+second+cardiac+field.">A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field.</a> Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+Distinct+Six2-Positive+Second+Heart+Field+Progenitors+Regulate+Mammalian+Heart+Development+and+Disease.">Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease.</a> Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+neonatal+rat+system+as+a+bioincubator+to+generate+adult-like+mature+cardiomyocytes+from+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells.">Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).</li><li>Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+heart+disease:+entering+a+new+era+of+human+genetics.">Congenital heart disease: entering a new era of human genetics.</a> Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome.">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAND1+loss-of-function+mutation+contributes+to+congenital+double+outlet+right+ventricle.">HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells.">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, 02164 (2014).</li><li>Morita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall1+transiently+marks+undifferentiated+heart+precursors+and+regulates+their+fate.">Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326 (5951), 426-429 (2009).</li></ol>

I vores protokol beskriver vi en metode til generering af hjertesfæroider og isolerede hjerte-feltspecifikke CPC'er. Disse kan bruges til at studere mekanismer af CPC specifikation og deres egenskaber, samt for hjertekammer-specifikke sygdom modellering. Et tidligere publiceret arbejde brugte en mESC linje med to fluorescerende reportere (Mef2c/NKX 2.5) til at studere cardiogenesis in vitro, men begge disse markører udtrykkes på embryonale dag 9.5-10, når kardiomyocytter allerede er dannet26. ...

Brugen af pluripotente stamceller (PSCs) har revolutioneret området for hjerte regenerering og personlig medicin med patientspecifikke myocytter til sygdoms modellering og lægemiddel terapier1,2,3, 4. for nylig er der udviklet in vitro-protokoller for generering af atrieflimren vs ventrikulær såvel som pacemaker-lignende PSC-afledte kardiomyocytter:5,6. Men, om cardiogenesis kan genoprettes in vitro til at studere hjertets udvikling og efterfølgende generere ventrikulære kammer-specifikke hjerte celler er stadig uklart.
Under tidlig fosterudvikling, mesodermal celler under indflydelse af udskilte morfogener såsom BMP4, Wnts og Activin en form primitive stribe7. Hjertemesodermal celler præget af Mesp1, migrere Anteriort og i det seneste til at danne hjerte Halvmåne og derefter den primitive hjerte tube7,8. Denne migrerende gruppe af celler omfatter to meget forskellige populationer af hjerte progenitorceller (CPCS), nemlig den første og den anden hjerte felt (FHF og SHF)9,10. Celler fra SHF er meget proliferativ og migrerende og er primært ansvarlige for forlængelse og loop af hjerte røret. Desuden, SHF celler differentiere til cardiomyocytes, fibroblaster, glatte muskler og endotel celler, som de kommer ind i hjerte røret til at danne den højre ventrikel, højre ventrikel udstrømning tarmkanalen og stor del af både Atria7,10. I modsætning hertil er FHF-celler mindre proliferativ og migrerende og differentiere hovedsageligt til kardiomyocytter, da de giver anledning til venstre ventrikel og en mindre del af Atria11. Desuden er SHF-progenitorer præget af Tbx1, FGF8, FGF10 og Six2, mens FHF-cellerne udtrykker Hcn4 og Tbx511,12,13,14,15.
Kvikskrankerne kan skelne til alle tre kimlag og efterfølgende til enhver celletype i kroppen4,16. Derfor tilbyder de et enormt potentiale for at forstå hjertets udvikling og for modellering af specifikke udviklingsmæssige defekter, der resulterer i medfødt hjertesygdom, den hyppigste årsag til fødselsdefekter17. En stor under gruppe af medfødte hjertesygdomme omfatter kammer-specifikke kardielle abnormiteter18,19. Men, det stadig uklart, om disse stammer fra unormal hjerte felt udvikling. Desuden, i betragtning af den manglende evne til kardiomyocytes at formere sig efter fødslen, har der været omfattende bestræbelser på at skabe hjerte-væv til hjerte Regeneration1,7,20. I betragtning af de fysiologiske og morfologiske forskelle mellem hjertekamrene er dannelsen af kammer specifikt hjerte vævet ved hjælp af kvikskrankerne af væsentlig betydning. Mens de seneste fremskridt inden for udviklings kardiologi har ført til robust generering af hjerte celler fra kvikskrankerne, er det stadig uklart, om de to hjerte felter kan induceres i PSC-systemer.
For at rekapitulere cardiogenesis in vitro og studere specifikationerne og egenskaberne for CPC'er, brugte vi tidligere et system baseret på differentiering af PSC-afledte hjerte sfæroider21,22,23,24. For nylig genererede vi muse embryonale stamceller (Mesc'er) med GFP og RFP-reportere under kontrol af henholdsvis FHF-genet Hcn4 og SHF-genet Tbx1 (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. In vitro-opdelte Mesc'er dannede hjertesfæroider, hvor GFP + og RFP +-celler optrådte fra to forskellige områder af mesodermal celler og mønstret på en komplementær måde. De resulterende GFP +-og RFP +-celler udviste henholdsvis FHF-og SHF-karakteristika, bestemt af RNA-sekvensering og klon analyser. Det er vigtigt, at vi ved hjælp af Mesc'er med Isl1-RFP-reporter (mESCIsl1-RFP) opdagede, at SHF-cellerne var trofast mærket af celleoverflade protein CXCR4, og dette kan muliggøre isolering af hjerte feltspecifikke celler uden transgener. Nærværende protokol vil beskrive dannelsen og isoleringen af hjerte feltspecifikke CPC'er fra Mesc'er, som kan tjene som et værdifuldt værktøj til at studerekammer specifik hjertesygdom.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1251px;" width="1250">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.1% (w/v) Gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100X Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1X PBS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40&#956;m cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td align="right">35223</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Activin A</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>338-AC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 minus vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BMP4</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:245px;">Sony</td>
			<td style="width:344px;">SH800</td>
			<td style="width:241px;">Sony or any other fluorescence-activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell strainer 70&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge Sorvall Legend XT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">75004508</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CHIR99021</td>
			<td>Selleck chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">51030285</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Corning Ultra Low Attachment T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Countless II FL automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571, Lot #1757130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium high glucose (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ESGRO (LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EVOS FL microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glasgow&#8217;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monothioglycero (MTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MS-295-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acid solution (NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suspension culture dish 150 mm x 25mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE (Trypsin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td align="right">72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells

Pluripotente stamceller giver et stort potentiale for at forstå hjerte udvikling og sygdom og for regenerativ medicin. Mens de seneste fremskridt inden for udviklings kardiologi har ført til generering af hjerte celler fra pluripotente stamceller, er det uklart, om de to hjerte felter-det første og andet hjerte felt (FHF og SHF)-er induceret i pluripotente stamceller systemer. For at løse dette, vi genereret en protokol til in vitro specifikation og isolering af hjerte felt-specifikke hjerte progenitorceller. Vi brugte embryonale stamceller linjer transporterer Hcn4-GFP og Tbx1-CRE; Rosa-RFP reportere af henholdsvis FHF og SHF, og levende celle immunofarvning af cellemembranen protein Cxcr4, en SHF markør. Med denne tilgang genererede vi stamceller, som generovere de funktionelle egenskaber og transkriptomer af deres in vivo-modparter. Vores protokol kan udnyttes til at studere tidlig specifikation og adskillelse af de to hjerte felter og til at generere kammer-specifikke hjerte celler til hjertesygdomme modellering. Da dette er et in vitro organoid system, det kan ikke give præcise anatomiske oplysninger. Men dette system overvinder den ringe tilgængelighed af gastrulation-Stage embryoner og kan opskaleres til høj-gennemløb skærme.

Efter ca. 132 h differentiering kan Tbx1-RFP og Hcn4-GFP-CPC'er detekteres ved hjælp af et fluorescerende mikroskop (figur 2). Generelt forekommer GFP-og RFP-celler omtrent omkring samme tid. De to populationer af CPC'er fortsætter med at ekspandere i umiddelbar nærhed og almindeligvis i et komplementært mønster. Justering af koncentrationen af Activin A og BMP4 vil ændre procenterne for FHF vs SHF CPC'er (figur 3). CPC-specifikationen in vitro blev primæ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Formålet med denne metode er at generere hjerte felt-specifikke hjerte progenitorceller in vitro for at studere stamcelle specifikation og funktionelle egenskaber, og at generere kammer specifikke hjerte celler til hjertesygdomme modellering.

In vitro-generering af muse hjerte felt-specifikke kardiale progenitorceller

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Vores metode har til formål at generere hjertefeltspecifikke hjertefogenitorceller fra museembrynale stamceller. Dette hjerte felt reporter stamcellelinje giver mulighed for high-throughput undersøgelse af de mekanismer, der ligger til grund for medfødt hjertesygdom, giver et system, der er modtagelig for genetisk og farmakologisk manipulation. Der er flere kammerspecifikke medfødte hjertesygdomme.Ved at opsummere kardiogenese in vitro, denne protokol tillader undersøgelse af sygdom mekanisme og udvikling af fremtidige regenerative behandlinger. Denne protokol kan give indsigt i, hvordan hjertekomgenitorceller i forskellige kamre er specificeret under hjerteudvikling. Begynd med at dyrke transgene museembrynale stamceller i 0,1% gelatinebelagte T25 kolber i 2i medium.Når cellerne når op på 70 til 80 %, skylles kulturerne med PBS, og der tilsættes en milliliter trypsin pr. kolbe for at adskille kulturen i enkelte celler ved 37 grader Celsius i tre minutter. Når cellerne er taget af, neutraliseres reaktionen med 4 milliliter 10 FBS i DMEM, og cellerne tælles efter en passende metode. Cellerne fortyndes til ca. tre gange 10 til de fem celler pr. frisk middelkoncentration, og cellerne indsamles ved centrifugering.Derefter opspjænnes pellet i fem milliliter frisk 2i medium til relating på nye 0,1% gelatine-belagt T25 kolber. For CPC-generering fra hjerte-sfæroider indsamles 2,5 gange 10 til seks af den fritliggende transgene museembrynal stamcelleprøve ved centrifugering og resuspendrer cellerne i 25 milliliter SFD-medium. Plade celle suspension i en 150-by-25-millimeter steril plade til inkubation ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 48 timer.Ved slutningen af inkubationen, indsamle hjerte sfæroider i et konisk rør. Sedimenter sfæroiderne ved centrifugering for at lette den selektive isolering af sfæroiderne og for at undgå enkelte celler. Resuspend spheroids i 25 milliliter frisk SFD medium suppleret med et nanogram per milliliter activin A og 1,5 nanogram pr milliliter af knogle morfoogenetiske protein fire.Replate sfæroiderne tilbage på den samme kulturplade for en 24-timers inkubation i cellekulturinkubatoren. Den næste dag, huske alle de hjerte sfæroider ved centrifugering. Opslæm de differentierede embryoidkroppe i 25 milliliter frisk SFD-medium til plettering i en ultralav fastgørelse, 75 centimeter kvadratisk kolbe i cellekulturkubatoren i 48 timer.For isolering af hjertefelt-specifikke CPC ved hjælp af fluorescerende journalister, indsamle embryoid organer ved centrifugering og adskille 3D-kulturer med en milliliter trypsin ved 37 grader Celsius i tre minutter. Ved slutningen af inkubationen blandes godt ved pipettering for at adskille cellerne og neutralisere reaktionen med fire milliliter 10% FBS i DMEM. Blandingen overføres over en 70-mikrometers si for at fjerne eventuelle ikke-dissocierede embryoidstoffer, og de filtrerede celler skal sedimenteres ved centrifugering.For at sortere CPC'erne efter deres fluorescerende reporter udtryk, resuspend pellet i 500 mikroliters FACS løsning og filtrere cellerne gennem en 40-mikrometer celle si i en fem-milliliter polystyren rund-bund rør på is. Sorter derefter cellerne for at isolere RFP- og GFP-ekspresserende celler ved hjælp af FACS, der samler cellerne i en milliliter FBS. At isolere første versus andet hjertefelt CPC baseret på deres overflade protein Cxcr4 udtryk, resuspenderet enkelt mus embryonale stamceller RFP-udtryk hjerte progenitor celler i 300 mikroliter af 10% FBS i PBS suppleret med fluorescens-konjugeret anti-Cxcr4 antistof.Efter fem minutter ved stuetemperatur vaskes cellerne tre gange i en til to milliliter frisk, kold PBS pr. vask. Efter den sidste vask opslæmmes cellerne i 500 mikroliter af FACS-opløsning og filtreres cellerne gennem en 40-mikrometers si i et fem milliliter, rundbundet rør. Sorter derefter cellerne efter deres Cxcr4-udtryk, og opsaml både Cxcr4-positive og negative populationer i individuelle rør, der indeholder en milliliter FPS pr. rør på is.For at rekulturere de FACS-isolerede, hjertefeltspecifikke hjertekompensatorceller indsamles de sorterede celler ved centrifugering og genanvende pellets i SFD-mediet. Derefter frø cirka tre gange 10 til de fire celler pr brønd i en 0,1% gelatine-belagt, 384-godt plade. Hvis øget celledød er noteret efter sortering, tilsættes 10-micromolar ROCK-hæmmer til hver brønd.Efter to dages kultur skal spontan tæsk observeres. At analysere muligheden for belagte CPC'er til at differentiere til kardiomyocytter, indsamle cellerne på dag 12 af differentiering med trypsin, som påvist, at isolere de enkelte kardiomyocytter og resuspend cellerne i 4% paraformaldehyd. Efter 30 minutter ved stuetemperatur opsaml de faste celler ved centrifugering og pellet i PBS for at fjerne det overskydende fiksativ.Dernæst resuspenderede cellerne i 10% FBS i PBS, og inkuber halvdelen af celleprøven med mus anti-troponin T antistof og bruge den anden halvdel af prøven som en negativ kontrol. Efter 30 minutter ved stuetemperatur vaskes cellerne to gange i frisk PBS, og prøverne skal opslæeres i 10%FBS plus PBS suppleret med et passende sekundært antistof. Efter yderligere 30 minutters inkubation ved stuetemperatur vaskes cellerne to gange i frisk PBS pr. vask, og cellerne i 200 mikroliter PBS pr. rør til analyse af et flowcytometer opslæmes.Efter ca. 132 timers differentiering kan Tbx1-RFP og Hcn4-GFP hjertefogenitorceller påvises ved fluorescensmikroskopi. Generelt vises både GFP- og RFP-celler omtrent på samme tid, og de to populationer af stamceller vokser fortsat i umiddelbar nærhed og typisk i et supplerende mønster. Justering af koncentrationerne af activin A og knogle morfoogenetiske protein fire vil ændre procentdelen af første versus andet hjerte felt hjerte stamfader celler.Tilsvarende ved hjælp af en RFP reporter mus embryonale stamceller linje, efter 132 timers differentiering, RFP-positive hjerte stamcelle vises. Efter immunstaining for Cxcr4, RFP-positive, Cxcr4-positive og RFP-positive kan Cxcr4-negative celler isoleres. Immunstaining for hjertetroponin T på dag 12 i differentiering bekræfter, at første hjertefeltceller hovedsageligt differentierer sig i myocytter.Tilsvarende, celler stammer fra RFP-positive, Cxcr4-negative hjertefogenitor celler giver anledning til kardiomyocytter ved meget højere procenter sammenlignet med Cxcr4 enkelt positive hjertefogenitor celler. Lejlighedsvis, mus embryonale stamceller undlader at differentiere effektivt og danner meget lavt antal hjertefelt-specifikke hjerte progenitor celler. Timingen, koncentrationen og konsistensen af tilsætningen af cytokinerne og antallet af celler er afgørende for en vellykket generation af kammerspecifikke hjertekomgenitorceller.Efter denne procedure, efterforskere kan analysere de fysiologiske egenskaber af de forskellige populationer af hjerte progenitor celler for at få yderligere indsigt i deres specifikation og funktion.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Afledning af Cardiac progenitorceller af embryonale stamceller

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Generation af murine pacemaker celleaggregater Baseret på ES-celle-programmering i kombination med Myh6-Promotor-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Start af Differentiering i Immortaliserede multipotent Otic progenitorceller

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro Colony Analyser til karakterisering Tri-potente progenitorceller isoleret fra voksne murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Hypoksisk forbehandling af marv-afledte progenitorceller som en kilde til generering af modne Schwann-celler

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Udvikling af et In Vitro Assay at kvantificere hæmatopoietisk stilk og stamfader celler (HSPCs) i at udvikle zebrafisk embryoner

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generation af første hjertet felt-lignende hjerte ophav og ventrikel-lignende Cardiomyocytes fra humane pluripotente stamceller

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Induktion i Endothelial differentiering i hjertets stamceller lavt Serum betingelser

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...