Name: in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

E. T. werd ondersteund door de magie die telt en AHA. C. K. werd gesteund door toelagen van NICHd/NIH (R01HD086026), AHA, en MSCRF.

Opmerking: In vitro generatie van hartgebied-specifieke muis hart voorlopercellen (Figuur 1).
1. onderhoud van de muis Ser's
<ol><li>Grow mESCs (mESCsTbx1-CRE; Rosa-offerte; HCN4-GFP, MESCISL1-offerte)25 op 0,1% (w/v) gelatine gecoate T25 kolven in 2i medium (870 ml van GLASCOW minimale essentiële medium (GMEM), 100 ml foetale boviene serum (FBS), 10 ml GlutaMAX, 10 ml niet-essenti...

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li><li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+cardiomyocyte.">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li><li>Birket, M. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+cardiovascular+progenitors--a+developmental+perspective.">Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective.</a> Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient.">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Atrial+and+Ventricular+Cardiomyocytes+Develop+from+Distinct+Mesoderm+Populations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Galdos, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Regeneration:+Lessons+From+Development.">Cardiac Regeneration: Lessons From Development.</a> Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).</li><li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lineage+restriction+in+temporally+distinct+populations+of+Mesp1+progenitors+during+mammalian+heart+development.">Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development.</a> Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+networks+in+heart+development+and+regeneration.">Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).</li><li>Bruneau, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber-specific+cardiac+expression+of+Tbx5+and+heart+defects+in+Holt-Oram+syndrome.">Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.</a> Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+gene+regulation+in+the+second+heart+field+by+Tbx1,+Nkx2-5,+and+Islet1+reveals+a+genetic+switch+for+down-regulation+in+the+myocardium.">Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).</li><li>Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fate+map+of+Tbx1+expressing+cells+reveals+heterogeneity+in+the+second+cardiac+field.">A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field.</a> Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+Distinct+Six2-Positive+Second+Heart+Field+Progenitors+Regulate+Mammalian+Heart+Development+and+Disease.">Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease.</a> Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+neonatal+rat+system+as+a+bioincubator+to+generate+adult-like+mature+cardiomyocytes+from+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells.">Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).</li><li>Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+heart+disease:+entering+a+new+era+of+human+genetics.">Congenital heart disease: entering a new era of human genetics.</a> Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome.">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAND1+loss-of-function+mutation+contributes+to+congenital+double+outlet+right+ventricle.">HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells.">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, 02164 (2014).</li><li>Morita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall1+transiently+marks+undifferentiated+heart+precursors+and+regulates+their+fate.">Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326 (5951), 426-429 (2009).</li></ol>

In ons protocol beschrijven we een methodologie om cardiale sferoïden en geïsoleerde hartveld-specifieke Cpc's te genereren. Die kunnen worden gebruikt om mechanismen van CPC-specificatie en hun eigenschappen te bestuderen, evenals voor cardiale kamer-specifieke ziektemodel lering. Één eerder gepubliceerd werk gebruikte een mESC lijn met twee fluorescente verslaggevers (Mef2c/Nkx 2.5) om cardiogenesis in vitro te bestuderen, echter, worden beide markeringen uitgedrukt bij embryonale dag 9.5-10 wanneer cardiomyocytes ...

Het gebruik van pluripotente stamcellen (psc's) heeft een revolutie teweeggebracht in het gebied van cardiale regeneratie en gepersonaliseerde geneeskunde met patiënt-specifieke myocytes voor ziektemodel lering en drugs therapieën1,2,3, 4. meer recentelijk, in vitro protocollen voor de generatie van atriale VS ventriculaire evenals pacemaker-achtige PSC-afgeleide cardiomyocytes zijn ontwikkeld5,6. Echter, of cardiogenesis kan worden herschapen in vitro om cardiale ontwikkeling te bestuderen en vervolgens te genereren ventriculaire kamer-specifieke cardiale cellen is nog steeds onduidelijk.
Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling, mesodermaal cellen onder invloed van afgescheiden morphogens zoals BMP4, Wnts en Activin een vorm van de primitieve streak7. Cardiale mesodermaal cellen gekenmerkt door de expressie van Mesp1, migreren naar voren en de laatste tijd om de hart sikkel en vervolgens de primitieve hart buis7,8te vormen. Deze migrerende groep van cellen omvat twee zeer verschillende populaties van cardiale stamcellen (cpc's), namelijk de eerste en de tweede hartveld (fhf en SHF)9,10. Cellen uit de SHF zijn zeer proliferative en trekkende en zijn primair verantwoordelijk voor de rek-en lus van de hart buis. Bovendien, SHF cellen differentiëren tot cardiomyocytes, fibroblasten, gladde spieren en endothelial cellen als ze in het hart buis om de rechter ventrikel, rechter ventrikel uitstroom tractus en een groot deel van beide atria7,10te vormen. In tegenstelling, FHF cellen zijn minder proliferatie en trekkende en differentiëren vooral om cardiomyocytes als ze aanleiding geven tot de linker ventrikel en een kleiner deel van de atria11. Bovendien SHF progenitoren worden gekenmerkt door de expressie van Tbx1, FGF8, FGF10 en Six2, terwijl fhf cellen Express Hcn4 en Tbx511, 12,13,14,15.
Psc's kan aan alle drie kiem lagen en later aan om het even welk type van cel in lichaam4,16onderscheiden. Daarom bieden ze een enorm potentieel voor het begrijpen van Hartontwikkeling en voor het modelleren van specifieke ontwikkelingsstoornissen resulteert in aangeboren hart-en vaatziekten, de meest voorkomende oorzaak van aangeboren afwijkingen17. Een grote subgroep van aangeboren hartziekte omvat kamer-specifieke cardiale afwijkingen18,19. Nochtans, is het nog onduidelijk of deze uit abnormale hart gebiedsontwikkeling voortkomen. Bovendien, gezien het onvermogen van cardiomyocytes te vermenigvuldigen na de geboorte, zijn er uitgebreide inspanningen om cardiale weefsel te creëren voor hart regeneratie1,7,20. Gezien de fysiologische en morfologische verschillen tussen hartkamers, is het genereren van kamer-specifieke cardiale weefsels met behulp van Psc's van groot belang. Hoewel de recente ontwikkelingen in de ontwikkelingsstoornissen cardiologie hebben geleid tot een robuuste generatie van cardiale cellen van Psc's, is het nog onduidelijk of de twee hart velden kunnen worden geïnduceerd in PSC-systemen.
Om recapituleren cardiogenesis in vitro en de studie van de specificatie en de eigenschappen van cpc's, hebben we eerder gebruik gemaakt van een systeem op basis van differentiëren PSC-afgeleide cardiale sferoïden21,22,23,24. Onlangs hebben we gegenereerd muis embryonale stamcellen (mESCs) met GFP en offerte verslaggevers onder de controle van de FHF gen Hcn4 en de SHF gen Tbx1, respectievelijk (mESCsTbx1-CRE; Rosa-offerte; HCN4-GFP) 25. In vitro gedifferentieerde mESCs gevormd cardiale sferoïden waarin GFP + en offerte + cellen verschenen uit twee verschillende gebieden van mesodermaal cellen en patroon in een complementaire wijze. De resulterende GFP + en offerte + cellen tentoongesteld FHF en SHF kenmerken, respectievelijk, bepaald door RNA-sequencing en klonale analyses. Belangrijk is, met behulp van mESCs die de Isl1-offerte Reporter (mESCIsl1-offerte), ontdekten we dat SHF cellen getrouw werden gekenmerkt door de cel-oppervlakte-eiwit CXCR4, en dit kan de isolatie van hartgebied-specifieke cellen mogelijk te maken zonder transgenen. Het huidige protocol beschrijft de generatie en isolatie van hart-specifieke Cpc's van mESCs, die als waardevol instrument kunnen dienen voor het bestuderen van kamer-specifieke hartziekten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1251px;" width="1250">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.1% (w/v) Gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100X Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1X PBS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40&#956;m cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td align="right">35223</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Activin A</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>338-AC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 minus vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BMP4</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:245px;">Sony</td>
			<td style="width:344px;">SH800</td>
			<td style="width:241px;">Sony or any other fluorescence-activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell strainer 70&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge Sorvall Legend XT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">75004508</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CHIR99021</td>
			<td>Selleck chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">51030285</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Corning Ultra Low Attachment T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Countless II FL automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571, Lot #1757130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium high glucose (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ESGRO (LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EVOS FL microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glasgow&#8217;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monothioglycero (MTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MS-295-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acid solution (NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suspension culture dish 150 mm x 25mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE (Trypsin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td align="right">72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells

Pluripotente stamcellen bieden een groot potentieel voor het begrijpen van Hartontwikkeling en ziekte en voor regeneratieve geneeskunde. Hoewel de recente ontwikkelingen in de ontwikkelingsstoornissen cardiologie hebben geleid tot het genereren van hartcellen uit pluripotente stamcellen, is het onduidelijk of de twee cardiale velden-de eerste en tweede hart velden (FHF en SHF)-worden geïnduceerd in pluripotente stamcellen systemen. Om dit aan te pakken, genereerden we een protocol voor in vitro specificatie en isolatie van hartveld-specifieke cardiale stamcellen. We gebruikten embryonale stamcellen lijnen die Hcn4-GFP en Tbx1-CRE; Rosa-offerte reporters van de FHF en de SHF, respectievelijk, en levende cel immunokleuring van de celmembraan eiwit Cxcr4, een SHF marker. Met deze aanpak genereerden we voorlopercellen die de functionele eigenschappen en transcriptoom van hun in vivo recapituleren. Ons protocol kan worden gebruikt om vroege specificatie en scheiding van de twee hart gebieden te bestuderen en kamer-specifieke hartcellen voor de modellering van de hartkwaal te produceren. Aangezien dit een in vitro organite systeem is, kan het geen nauwkeurige anatomische informatie verstrekken. Echter, dit systeem overwint de slechte bereikbaarheid van gastrulation embryo's en kan worden opgeschaald voor high-throughput schermen.

Na ongeveer 132 h van differentiatie, Tbx1-offerte en Hcn4-GFP Cpc's kan worden gedetecteerd met behulp van een fluorescerende Microscoop (Figuur 2). Over het algemeen, GFP en offerte cellen verschijnen ongeveer rond dezelfde tijd. De twee populaties van Cpc's blijven groeien in de nabijheid en vaak in een complementair patroon. Aanpassing van de concentraties van Activin A en BMP4 zal veranderen de percentages van FHF VS SHF Cpc's (Figuur 3). De CPC-specificati...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Het doel van deze methode is het genereren van hartgebied-specifieke cardiale stamcellen in vitro om de stamvader cel specificatie en functionele eigenschappen te bestuderen, en het genereren van kamer specifieke cardiale cellen voor hart-en vaatziekten modellering.

In vitro generatie van muis Hartveld-specifieke hart voorlopercellen

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Onze methode is gericht op het genereren van hartveld-specifieke cardiale voorloper cellen uit muis embryonale stamcellen. Deze hartveldverslaggever stamcellijn zorgt voor de hoge doorvoer studie van de mechanismen die ten grondslag liggen aan aangeboren hart-en vaatziekten, het verstrekken van een systeem dat vatbaar is voor genetische en farmacologische manipulatie. Er zijn verschillende kamerspecifieke aangeboren hartziekten.Door cardiogenese in vitro te recapituleren, maakt dit protocol de studie van het ziektemechanisme en de ontwikkeling van toekomstige regeneratieve therapieën mogelijk. Dit protocol kan inzicht geven in hoe hartvererver cellen van verschillende kamers worden gespecificeerd tijdens de ontwikkeling van het hart. Begin met het kweken van transgene muis embryonale stamcellen in 0,1%gelatine gecoate T25 kolven in 2i medium.Wanneer de cellen bereiken 70 tot 80%samenvloeiing, spoel de culturen met PBS en voeg een milliliter trypsine per fles om de cultuur te scheiden in enkele cellen op 37 graden Celsius gedurende drie minuten. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, neutraliseert u de reactie met vier milliliters 10 FBS in DMEM en tel de cellen met een geschikte methode. Verdun de cellen tot een ongeveer drie keer 10 tot de vijf cellen per verse medium concentratie, en het verzamelen van de cellen door centrifugatie.Dan resuspend de pellet in vijf milliliter verse 2i medium voor replating op nieuwe 0,1% gelatine gecoate T25 flessen. Voor CPC generatie van cardiale sferoïden, verzamelen 2,5 keer 10 tot de zes van de vrijstaande transgene muis embryonale stamcel monster door centrifugatie, en resuspend de cellen in 25 milliliter SFD medium. Plaat de cel suspensie in een 150-bij-25-millimeter steriele plaat voor incubatie bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 48 uur.Verzamel aan het einde van de incubatie de hartsferoïden in een conische buis. Sediment de sferoïden door centrifugatie om de selectieve isolatie van de sferoïden te vergemakkelijken en om enkele cellen te vermijden. Resuspend de sferoïden in 25 milliliter vers SFD medium aangevuld met een nanogram per milliliter activine A en 1,5 nanogram per milliliter bot morfogenetische eiwit vier.Replate de sferoïden terug op dezelfde cultuurplaat voor een 24-uurs incubatie in de celcultuur incubator. De volgende dag, herinner je alle hartsferoïden door centrifugatie. Resuspend de gedifferentieerde embryonale lichamen in 25 milliliter vers SFD medium voor beplating in een ultra-lage bevestiging, 75 centimeter kwadraat kolf in de celcultuur incubator voor 48 uur.Voor isolatie van hartveld-specifieke CPC met behulp van fluorescerende verslaggevers, verzamel de embryoloze lichamen door centrifugatie en dissociate de 3D-culturen met een milliliter trypsine op 37 graden Celsius gedurende drie minuten. Meng aan het einde van de incubatie goed door pipet om de cellen te scheiden en neutraliseer de reactie met vier milliliters van 10%FBS in DMEM. Geef het mengsel over een 70-micrometer zeef om niet-gescheiden embryonale lichamen te verwijderen, en sediment de gefilterde cellen door centrifugatie.Om de CPC's te sorteren op hun fluorescerende reporterexpressie, zet u de pellet opnieuw op in 500 microliters FACS-oplossing en filtert u de cellen door een 40-micrometercelzeef in een vijf-milliliter polystyreen ronde bodembuis op ijs. Sorteer vervolgens de cellen om de RFP- en GFP-uitdrukkende cellen te isoleren door FACS, waarbij de cellen in één milliliter FBS worden verzameld. Om eerste versus tweede hartveld-CPC's te isoleren op basis van hun oppervlakte-eiwit Cxcr4-expressie, wordt de embryonale stamcel RFP-uitdrukkende hartverervers van 300 microliter van 10%FBS in PBS opnieuw opsuspend, aangevuld met fluorescentie-geconjugeerde anti-Cxcr4-antilichaam.Na vijf minuten bij kamertemperatuur, was de cellen drie keer in een tot twee milliliter verse, koude PBS per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, resuspend de cellen in 500 microliter van FACS oplossing en filter de cellen door een 40-micrometer zeef in een vijf-milliliter, ronde bodem buis. Sorteer vervolgens de cellen op hun Cxcr4-expressie en verzamel zowel de Cxcr4-positieve als negatieve populaties in afzonderlijke buizen die één milliliter FPS per buis op ijs bevatten.Om de FACS-geïsoleerde, hartveldspecifieke hartvererverensatorcellen te herverkweeken, de gesorteerde cellen te verzamelen door centrifugatie en de pellets opnieuw op te stellen in SFD-medium. Dan zaad ongeveer drie keer 10 tot de vier cellen per put in een 0,1% gelatine-gecoate, 384-well plaat. Als verhoogde celdood wordt opgemerkt na het sorteren, voeg 10-micromolar ROCK remmer aan elke put.Na twee dagen van cultuur moet spontane mishandeling worden waargenomen. Om het vermogen van vergulde CPC's te analyseren om te differentiëren tot cardiomyocyten, verzamelt u de cellen op dag 12 van differentiatie met trypsine, zoals aangetoond, om de enkele cardiomyocyten te isoleren en de cellen opnieuw te kalieren in 4%paraformaldehyde. Na 30 minuten bij kamertemperatuur, verzamel de vaste cellen door centrifugatie en was de pellet in PBS om het overtollige fixatiemiddel te verwijderen.Vervolgens worden de cellen opnieuw opgetrokken in 10%FBS in PBS en de helft van het celmonster met muisanti-troponine T-antilichaam inplant en de andere helft van het monster als negatief besturingselement gebruikt. Na 30 minuten bij kamertemperatuur, was de cellen twee keer in verse PBS en resuspend de monsters in 10%FBS plus PBS aangevuld met een geschikte secundaire antilichaam. Na nog eens 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur, was de cellen twee keer in verse PBS per wasbeurt en resuspend de cellen in 200 microliters pbs per buis voor analyse op een flow cytometer.Na ongeveer 132 uur differentiatie kunnen Tbx1-RFP- en Hcn4-GFP-hartvererverensymeercellen worden gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie. Over het algemeen verschijnen zowel GFP- als RFP-cellen ongeveer rond dezelfde tijd en de twee populaties van voorlopercellen blijven zich uitbreiden in de nabijheid en meestal in een complementair patroon. Het aanpassen van de concentraties van activine A en bot morfogenetische eiwit vier zal veranderen de percentages van de eerste versus tweede hartveld hartvererver cellen.Op dezelfde manier, met behulp van een RFP reporter muis embryonale stamcellijn, na 132 uur van differentiatie, RFP-positieve hartvererverensteller cellen verschijnen. Na immunostaining voor Cxcr4, RFP-positief, Cxcr4-positief en RFP-positief kunnen Cxcr4-negatieve cellen worden geïsoleerd. Immunostaining voor harttroponine T op dag 12 van differentiatie bevestigt dat de eerste hartveldcellen zich voornamelijk onderscheiden in myocyten.Op dezelfde manier geven cellen afkomstig van RFP-positieve, Cxcr4-negatieve hartvererver cellen aanleiding tot cardiomyocyten bij veel hogere percentages in vergelijking met Cxcr4 enkele positieve hartvererverenspiercellen. Af en toe, muis embryonale stamcellen niet efficiënt te onderscheiden en vormen zeer lage aantallen hartveld-specifieke hart voorloper cellen. De timing, concentratie en consistentie van de toevoeging van de cytokinen en het aantal cellen zijn van cruciaal belang voor een succesvolle generatie kamerspecifieke hartvererverenspiercellen.Na deze procedure kunnen onderzoekers de fysiologische eigenschappen van de verschillende populaties van hartvererverens cellen analyseren om meer inzicht te krijgen in hun specificatie en functie.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Afleiding van Cardiac stamcellen uit embryonale stamcellen

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Generatie van muizen pacemaker celaggregaten Gebaseerd op ES-Cell-programmering in combinatie met Myh6-Promoter-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Initiëren Differentiatie in Onsterfelijk Multipotent Otic Progenitor Cellen

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Kolonie assays voor het karakteriseren van Tri-potente Progenitor Cellen Geïsoleerd van de volwassen muizen alvleesklier

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Hypoxische preconditioning van merg-afgeleide progenitorcellen als bron voor de generatie van volwassen Schwann-cellen

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kwantitatieve geheel-mount immunofluorescentie analyse van cardiale Progenitor populaties in muis embryo 's

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Ontwikkeling van een In Vitro Assay voor het kwantificeren van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) bij de ontwikkeling van de zebravis embryo 's

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generatie van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige Cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Inductie van Endothelial differentiatie in cardiale voorlopercellen onder lage Serum voorwaarden

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In Vitro generatie van Somiet derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen-cellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...