Name: in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

E. T. a été soutenu par The Magic That Matters et AHA. C. K. a reçu l'appui de subventions du NICHD/NIH (R01HD086026), de l'AHA et du MSCRF.

REMARQUE: Génération in vitro de cellules progénitrices cardiaques spécifiques au champ cardiaque (Figure 1).
1. Entretien des ESC de souris
<ol><li>Cultivez des MESC (mESCtbtb-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP, mESCIsl1-RFP)25 sur 0,1% (w/v) flasque t25 enrobée de 2i medium (870 mL de milieu essentiel minimum de glascow (GMEM), 100 mL de sérum bovin fœtal (FBS), 10 mL de GlutaMAX, 10 ...

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li><li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+cardiomyocyte.">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li><li>Birket, M. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+cardiovascular+progenitors--a+developmental+perspective.">Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective.</a> Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient.">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Atrial+and+Ventricular+Cardiomyocytes+Develop+from+Distinct+Mesoderm+Populations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Galdos, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Regeneration:+Lessons+From+Development.">Cardiac Regeneration: Lessons From Development.</a> Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).</li><li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lineage+restriction+in+temporally+distinct+populations+of+Mesp1+progenitors+during+mammalian+heart+development.">Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development.</a> Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+networks+in+heart+development+and+regeneration.">Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).</li><li>Bruneau, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber-specific+cardiac+expression+of+Tbx5+and+heart+defects+in+Holt-Oram+syndrome.">Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.</a> Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+gene+regulation+in+the+second+heart+field+by+Tbx1,+Nkx2-5,+and+Islet1+reveals+a+genetic+switch+for+down-regulation+in+the+myocardium.">Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).</li><li>Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fate+map+of+Tbx1+expressing+cells+reveals+heterogeneity+in+the+second+cardiac+field.">A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field.</a> Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+Distinct+Six2-Positive+Second+Heart+Field+Progenitors+Regulate+Mammalian+Heart+Development+and+Disease.">Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease.</a> Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+neonatal+rat+system+as+a+bioincubator+to+generate+adult-like+mature+cardiomyocytes+from+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells.">Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).</li><li>Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+heart+disease:+entering+a+new+era+of+human+genetics.">Congenital heart disease: entering a new era of human genetics.</a> Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome.">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAND1+loss-of-function+mutation+contributes+to+congenital+double+outlet+right+ventricle.">HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells.">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, 02164 (2014).</li><li>Morita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall1+transiently+marks+undifferentiated+heart+precursors+and+regulates+their+fate.">Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326 (5951), 426-429 (2009).</li></ol>

Dans notre protocole, nous décrivons une méthodologie pour produire des sphéroïdes cardiaques et des CPC isolés spécifiques au champ cardiaque. Ceux-ci peuvent être utilisés pour étudier les mécanismes de spécification scPC et leurs propriétés, ainsi que pour la modélisation des maladies spécifiques à la chambre cardiaque. Un travail précédemment édité a employé une ligne de MESC avec deux journalistes fluorescents (Mef2c/Nkx2.5) pour étudier la cardiogenèse in vitro, cependant, ces deux marqueurs ...

L'utilisation de cellules souches pluripotentes (CSP) a révolutionné le domaine de la régénération cardiaque et de la médecine personnalisée avec des myocytes spécifiques aux patients pour la modélisation des maladies et les pharmacothérapies1,2,3, 4. Plus récemment, des protocoles in vitro pour la génération de cardiomyocytes auriculaires vs ventriculaires ainsi que des stimulateurs cardiaques dérivés de PSC ont été développés5,6. Cependant, si la cardiogenèse peut être recréée in vitro pour étudier le développement cardiaque et par la suite produire des cellules cardiaques ventriculaires spécifiques à la chambre est encore peu claire.
Au début du développement embryonnaire, les cellules mésodermales sous l'influence de morphogènes sécrétés tels que BMP4, Wnts et Activin A forment la strie primitive7. Les cellules mésodermales cardiaques marquées par l'expression de Mesp1, migrent antérieurement et dernièrement pour former le croissant cardiaque, puis le tube cardiaque primitif7,8. Ce groupe migratoire de cellules comprend deux populations très distinctes de cellules progénitrices cardiaques (CPC), à savoir le premier et le deuxième champ cardiaque (FHF et SHF)9,10. Les cellules de la SHF sont hautement proliférantes et migratrices et sont principalement responsables de l'allongement et de la boucle du tube cardiaque. En outre, les cellules SHF se différencient en cardiomyocytes, fibroblastes, muscles lisses et cellules endothéliales comme ils entrent dans le tube cardiaque pour former le ventricule droit, le tractus ventriculaire droit et une grande partie des deuxoreillettes 7,10. En revanche, les cellules FHF sont moins proliférantes et migratrices et se différencient principalement aux cardiomyocytes car elles donnent lieu au ventricule gauche et à une plus petite partie des oreillettes11. En outre, les progéniteurs SHF sont marqués par l'expression de Tbx1, FGF8, FGF10 et Six2 tandis que les cellules FHF expriment Hcn4 et Tbx511,12,13,14,15.
Les CSP peuvent se différencier des trois couches germinales et, par la suite, de n'importe quel type de cellule dans le corps4,16. Par conséquent, ils offrent un potentiel énorme pour comprendre le développement cardiaque et pour modéliser des défauts développementaux spécifiques ayant pour résultat la maladie cardiaque congénitale, la cause la plus fréquente des défauts de naissance17. Un grand sous-groupe de maladie cardiaque congénitale inclut des anomalies cardiaques de chambre-spécifiques18,19. Cependant, il ne sait toujours pas si ceux-ci proviennent du développement anormal du champ cardiaque. En outre, étant donné l'incapacité des cardiomyocytes à proliférer après la naissance, il ya eu des efforts considérables pour créer des tissus cardiaques pour la régénération cardiaque1,7,20. Compte tenu des différences physiologiques et morphologiques entre les chambres cardiaques, la génération de tissu cardiaque spécifique à la chambre à l'aide de CSP est d'une importance significative. Bien que les progrès récents en cardiologie développementale aient mené à la génération robuste de cellules cardiaques des PSC, il est toujours peu clair si les deux champs de coeur peuvent être induits dans des systèmes de PSC.
Pour récapituler la cardiogenèse in vitro et étudier les spécifications et les propriétés des CPC, nous avons déjà utilisé un système basé sur la différenciation des sphéroïdes cardiaques dérivés de la CFP21,22,23,24. Récemment, nous avons produit des cellules souches embryonnaires de souris (MESC) avec des reporters de GFP et de DP sous le contrôle du gène Hcn4 de FHF et du gène Tbx1 de SHF, respectivement (mESCtbtb1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. Les MESC différenciés in vitro ont formé des sphéroïdes cardiaques dans lesquels les cellules GFPet et RFPsont apparues de deux zones distinctes de cellules mésodermales et modelées d'une manière complémentaire. Les cellules GFPMD et RFPMD qui en ont résulté présentaient respectivement des caractéristiques FHF et SHF, déterminées par des analyses de séquençage de l'ARN et de clonal. Fait important, en utilisant des MESC transportant le journaliste Isl1-RFP (mESCIsl1-RFP), nous avons découvert que les cellules SHF étaient fidèlement marquées par la protéine de surface cellulaire CXCR4, ce qui peut permettre l'isolement des cellules spécifiques au champ cardiaque sans transgènes. Le protocole actuel décrira la génération et l'isolement des CPC spécifiques au champ cardiaque à partir des CSE, qui peuvent servir d'outil précieux pour l'étude des maladies cardiaques propres à la chambre.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1251px;" width="1250">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.1% (w/v) Gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100X Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1X PBS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40&#956;m cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td align="right">35223</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Activin A</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>338-AC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 minus vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BMP4</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:245px;">Sony</td>
			<td style="width:344px;">SH800</td>
			<td style="width:241px;">Sony or any other fluorescence-activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell strainer 70&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge Sorvall Legend XT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">75004508</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CHIR99021</td>
			<td>Selleck chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">51030285</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Corning Ultra Low Attachment T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Countless II FL automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571, Lot #1757130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium high glucose (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ESGRO (LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EVOS FL microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glasgow&#8217;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monothioglycero (MTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MS-295-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acid solution (NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suspension culture dish 150 mm x 25mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE (Trypsin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td align="right">72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells

Les cellules souches pluripotentes offrent un grand potentiel pour comprendre le développement cardiaque et la maladie et pour la médecine régénérative. Bien que les progrès récents de la cardiologie développementale aient conduit à la production de cellules cardiaques à partir de cellules souches pluripotentes, on ne sait pas si les deux champs cardiaques - les premier et deuxième champs cardiaques (FHF et SHF) - sont induits dans les systèmes de cellules souches pluripotentes. Pour remédier à cette situation, nous avons généré un protocole de spécification in vitro et d'isolement des cellules progénitrices cardiaques spécifiques au champ cardiaque. Nous avons utilisé des lignées de cellules souches embryonnaires transportant Hcn4-GFP et Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters de la FHF et le SHF, respectivement, et immunostaining cellulaire séminueux vivant de la protéine de membrane cellulaire Cxcr4, un marqueur SHF. Avec cette approche, nous avons généré des cellules progénitrices qui récapitulent les propriétés fonctionnelles et le transcriptome de leurs homologues in vivo. Notre protocole peut être utilisé pour étudier la spécification précoce et la ségrégation des deux champs cardiaques et pour générer des cellules cardiaques spécifiques à la chambre pour la modélisation des maladies cardiaques. Puisqu'il s'agit d'un système organoïde in vitro, il peut ne pas fournir d'informations anatomiques précises. Cependant, ce système surmonte la faible accessibilité des embryons au stade de la gaztrulation et peut être mis à niveau pour les écrans à haut débit.

Après environ 132 h de différenciation, les CCP Tbx1-RFP et Hcn4-GFP peuvent être détectés à l'aide d'un microscope fluorescent (figure2). En général, les cellules GFP et DFP apparaissent à peu près à la même époque. Les deux populations de CPC continuent de croître à proximité et généralement dans un schéma complémentaire. L'ajustement des concentrations d'Activin A et de BMP4 modifiera les pourcentages de CPC FHF vs SHF (figure 3). La spéc...

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In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Le but de cette méthode est de générer des cellules progénitrices cardiaques spécifiques au champ cardiaque in vitro afin d'étudier la spécification des cellules progénitrices et les propriétés fonctionnelles, et de générer des cellules cardiaques spécifiques à la chambre pour la modélisation des maladies cardiaques.

In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Notre méthode vise à générer des cellules progénitrices cardiaques spécifiques au champ cardiaque à partir de cellules souches embryonnaires de souris. Cette lignée de cellules souches de reporter de champ de coeur permet l’étude à haut débit des mécanismes sous-jacents à la maladie cardiaque congénitale, fournissant un système qui est aimable à la manipulation génétique et pharmacologique. Il y a plusieurs maladies cardiaques congénitales spécifiques à la chambre.En récapitulant la cardiogenèse in vitro, ce protocole permet l’étude du mécanisme de la maladie et le développement de futures thérapies régénératives. Ce protocole peut fournir un aperçu de la façon dont les cellules progénitrices cardiaques de différentes chambres sont spécifiées pendant le développement cardiaque. Commencez par cultiver des cellules souches embryonnaires transgéniques de souris dans des flacons T25 recouverts de gélatine à 0,1 % dans 2i medium.Lorsque les cellules atteignent 70 à 80% de confluence, rincer les cultures avec PBS et ajouter un millilitre de trypsine par flacon pour dissocier la culture en cellules individuelles à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Lorsque les cellules se sont détachées, neutraliser la réaction avec quatre millilitres 10 FBS dans DMEM et compter les cellules par une méthode appropriée. Diluer les cellules à environ trois fois 10 à cinq cellules par concentration moyenne fraîche, et de recueillir les cellules par centrifugation.Ensuite, resuspendez la pastille en cinq millilitres de milieu frais de 2i pour les replaquer sur de nouveaux flacons T25 recouverts de gélatine de 0,1 %. Pour la génération de CPC à partir de sphéroïdes cardiaques, recueillir 2,5 fois 10 à six de la souris transgénique détachée échantillon embryonnaire de cellules souches par centrifugation, et de réutiliser les cellules en 25 millilitres de SFD moyen. Plaquez la suspension cellulaire dans une plaque stérile de 150 x 25 millimètres pour incubation à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures.À la fin de l’incubation, recueillir les sphéroïdes cardiaques dans un tube conique. Sédimenter les sphéroïdes par centrifugation pour faciliter l’isolement sélectif des sphéroïdes et éviter les cellules individuelles. Resuspendez les sphéroïdes en 25 millilitres de milieu SFD frais complété par un nanogramme par millilitre d’activine A et 1,5 nanogramme par millilitre de protéine morphogenétique osseuse quatre.Replatez les sphéroïdes sur la même plaque de culture pour une incubation de 24 heures dans l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain, se souvenir de tous les sphéroïdes cardiaques par centrifugation. Resuspendez les corps embryoïdes différenciés en 25 millilitres de milieu SFD frais pour le placage dans un attachement ultra-bas, flacon carré de 75 centimètres dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 heures.Pour l’isolement du CPC spécifique au champ cardiaque à l’aide de reporters fluorescents, recueillir les corps embryoïdes par centrifugation et dissocier les cultures 3D avec un millilitre de trypsine à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. À la fin de l’incubation, bien mélanger par pipetting pour dissocier les cellules et neutraliser la réaction avec quatre millilitres de 10%FBS dans DMEM. Passer le mélange sur une passoire de 70 micromètres pour enlever tout corps embryoïde non dissocié, et sédimenter les cellules filtrées par centrifugation.Pour trier les CPC par leur expression de reporter fluorescent, réutilisez la pastille dans la solution FACS de 500 microlitres et filtrez les cellules à travers une passoire cellulaire de 40 micromètres dans un tube à fond rond de polystyrène de cinq millilitres sur la glace. Triez ensuite les cellules pour isoler les cellules exprimant la DP et le GFP par FACS, en recueillant les cellules en un millilitre de FBS. Pour isoler les CPC de premier par rapport au deuxième champ cardiaque en fonction de leur expression cxcr4 de protéine de surface, résuspendez les cellules progénitrices cardiaques embryonnaires de cellules souches de souris simples exprimant la DP dans 300 microlitres de 10 %FBS dans PBS complétés par des anticorps anti-Cxcr4 conjugués à la fluorescence.Après cinq minutes à température ambiante, laver les cellules trois fois en un à deux millilitres de PBS frais et froid par lavage. Après le dernier lavage, resuspendez les cellules dans 500 microlitres de solution FACS et filtrez les cellules à travers une passoire de 40 micromètres dans un tube à fond rond de cinq millilitres. Triez ensuite les cellules par leur expression Cxcr4, recueillant les populations cxcr4-positives et négatives dans des tubes individuels contenant un millilitre de FPS par tube sur la glace.Pour re-culturer les cellules progénitrices cardiaques isolées du FACS, spécifiques au champ cardiaque, recueillez les cellules triées par centrifugation et réutilisez les granulés dans le milieu SFD. Puis semer environ trois fois 10 à quatre cellules par puits dans une plaque de 0,1% gélatine-enrobée, 384-puits. Si l’augmentation de la mort cellulaire est notée après le tri, ajouter un inhibiteur rock de 10 micromifuges à chaque puits.Après deux jours de culture, des battements spontanés devraient être observés. Pour analyser la capacité des CPC plaqués à se différencier des cardiomyocytes, recueillir les cellules au jour 12 de différenciation avec la trypsine, comme démontré, pour isoler les cardiomyocytes simples et résuspendre les cellules dans 4% paraformaldéhyde. Après 30 minutes à température ambiante, recueillir les cellules fixes par centrifugation et laver la pastille dans PBS pour enlever l’excès fixatif.Ensuite, resuspendez les cellules dans 10%FBS dans PBS, et coïncubez la moitié de l’échantillon cellulaire avec l’anticorps t anti-troponine de souris et utilisez l’autre moitié de l’échantillon comme un contrôle négatif. Après 30 minutes à température ambiante, laver les cellules deux fois dans pbs frais et resuspendre les échantillons dans 10%FBS plus PBS complété par un anticorps secondaire approprié. Après une autre incubation de 30 minutes à température ambiante, lavez les cellules deux fois en PBS frais par lavage et réutilisez les cellules dans 200 microlitres de PBS par tube pour analyse sur un cytomètre d’écoulement.Après environ 132 heures de différenciation, les cellules progénitrices cardiaques Tbx1-RFP et Hcn4-GFP peuvent être détectées par microscopie par fluorescence. En général, les cellules GFP et RFP apparaissent approximativement à peu près au même moment, et les deux populations de cellules progénitrices continuent de se développer à proximité et généralement dans un modèle complémentaire. L’ajustement des concentrations d’activine A et de protéine morphogénétique osseuse quatre modifiera les pourcentages de cellules progénitrices cardiaques du premier au deuxième champ cardiaque.De même, à l’aide d’une lignée embryonnaire de cellules souches embryonnaires de souris de journaliste de DP, après 132 heures de différenciation, les cellules progénitrices cardiaques RFP-positives apparaissent. Après immunostaining pour Cxcr4, RFP-positif, Cxcr4-positif, et RFP-positif, les cellules Cxcr4-négatives peuvent être isolées. L’immunostaining pour la troponine cardiaque T au jour 12 de la différenciation confirme que les premières cellules de champ de coeur se différencient principalement en myocytes.De même, les cellules dérivées de cellules progénitrices cardiaques Cxcr4 positives à la DP donnent naissance à des cardiomyocytes à des pourcentages beaucoup plus élevés que les cellules progénitrices cardiaques positives simples Cxcr4. Parfois, les cellules souches embryonnaires de souris ne parviennent pas à se différencier efficacement et forment un très faible nombre de cellules progénitrices cardiaques spécifiques au champ cardiaque. Le moment, la concentration et la cohérence de l’ajout des cytokines et le nombre de cellules sont essentiels pour une génération réussie de cellules progénitrices cardiaques propres à la chambre.Après cette procédure, les chercheurs peuvent analyser les propriétés physiologiques des différentes populations de cellules progénitrices cardiaques afin d’obtenir un meilleur aperçu de leurs spécifications et de leur fonction.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Dérivation des cellules cardiaques progénitrices de cellules souches embryonnaires

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Recherche

Biologie du développement

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Génération de stimulateur cardiaque murin agrégats de cellules fondées sur la ES-Cell-programmation en combinaison avec MYH6-promoteur-sélection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Lancement de différenciation dans immortalisées cellules multipotentes progénitrices otique

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays pour Caractériser les cellules progénitrices Tri-puissants Isolée des adultes murins Pancréas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Le préconditionnement hypoxique des cellules progénitrices dérivées de la moelle en tant que source pour la génération de cellules Schwann mûres

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Analyse quantitative Immunofluorescence entier-montent des Populations de progéniteurs cardiaques chez des embryons de souris

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Développement d’un test In Vitro pour doser les progéniteurs et souches hématopoïétiques cellules (HSPCs) dans le développement des embryons de poisson-zèbre

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Génération du premier cœur comme champ progéniteurs cardiaques et Cardiomyocytes ventriculaires-comme des cellules souches pluripotentes humaines

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Induction de la différenciation endothéliale dans les cellules progénitrices cardiaque dans des Conditions de faible taux sérique

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dans Vitro génération du Somite dérivés de Human induit Pluripotent Stem cellules

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...