Name: in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

E. T. wurde von The Magic That Matters und AHA unterstützt. C. K. wurde durch Zuschüsse von NICHD/NIH (R01HD086026), AHA und MSCRF unterstützt.

HINWEIS: In-vitro-Generierung herzfeldspezifischer Herzvorläuferzellen (Abbildung 1).
1. Wartung von Maus-ESCs
<ol><li>Grow mESCs (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP, mESCIsl1-RFP)25 auf 0,1% (w/v) gelatinebeschichtete T25-Kolben in 2i mittel (870 ml Glaskuh Minimum Essential Medium (GMEM), 100 ml fetales Rinderserum (FBS), 10 ml GlutaMAX, 10 ml nicht essentielle Aminosäuren, 10 ml...

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li><li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+cardiomyocyte.">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li><li>Birket, M. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+cardiovascular+progenitors--a+developmental+perspective.">Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective.</a> Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber-specific+cardiac+expression+of+Tbx5+and+heart+defects+in+Holt-Oram+syndrome.">Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.</a> Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+gene+regulation+in+the+second+heart+field+by+Tbx1,+Nkx2-5,+and+Islet1+reveals+a+genetic+switch+for+down-regulation+in+the+myocardium.">Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).</li><li>Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fate+map+of+Tbx1+expressing+cells+reveals+heterogeneity+in+the+second+cardiac+field.">A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field.</a> Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+Distinct+Six2-Positive+Second+Heart+Field+Progenitors+Regulate+Mammalian+Heart+Development+and+Disease.">Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease.</a> Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Cho, G. 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C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells.">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, 02164 (2014).</li><li>Morita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall1+transiently+marks+undifferentiated+heart+precursors+and+regulates+their+fate.">Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326 (5951), 426-429 (2009).</li></ol>

In unserem Protokoll beschreiben wir eine Methodik zur Erzeugung von Herzsphäroiden und isolierten herzfeldspezifischen CPCs. Diese können verwendet werden, um Mechanismen der CPC-Spezifikation und ihre Eigenschaften zu untersuchen, sowie für die herzkammerspezifische Krankheitsmodellierung. Eine zuvor veröffentlichte Arbeit verwendete eine mESC-Linie mit zwei fluoreszierenden Reportern (Mef2c/Nkx2.5), um die Kardiogenese in vitro zu untersuchen, jedoch werden beide Marker am embryonalen Tag 9.5-10 exprimiert, wenn K...

Die Verwendung von pluripotenten Stammzellen (PSCs) hat den Bereich der Herzregeneration und personalisiertemedizin mit patientenspezifischen Myozyten für die Krankheitsmodellierung und Medikamentierungen1,2,3 , 4. In jüngerer Zeit wurden In-vitro-Protokolle zur Erzeugung von Atrial vs ventrikulären sowie herzschrittmacherartigen PSC-abgeleiteten Kardiomyozyten entwickelt5,6. Ob die Kardiogenese jedoch in vitro neu angelegt werden kann, um die Herzentwicklung zu untersuchen und anschließend ventrikuläre kammerspezifische Herzzellen zu erzeugen, ist noch unklar.
Während der frühen embryonalen Entwicklung bilden mesodermale Zellen unter dem Einfluss von sezernierten Morphogenen wie BMP4, Wnts und Activin A den Primitivstreifen7. Herzmesodermale Zellen, die durch die Expression von Mesp1 gekennzeichnet sind, wandern anterior und später zum Herzhalbmond und dann zum primitiven Herzrohr7,8. Diese Migrationsgruppe umfasst zwei sehr unterschiedliche Populationen von Kardialvorläuferzellen (CPCs), nämlich das erste und das zweite Herzfeld (FHF und SHF)9,10. Zellen aus der SHF sind hoch proliferativ und wandernd und sind in erster Linie für die Dehnung und Schleife des Herzschlauchs verantwortlich. Darüber hinaus unterscheiden sich SHF-Zellen zu Kardiomyozyten, Fibroblasten, glatten Muskel- und Endothelzellen, wenn sie in das Herzrohr eindringen, um den rechten Ventrikel, den rechten ventrikulären Abflusstrakt und einen großen Teil der beiden Atria7,10zu bilden. Im Gegensatz dazu sind FHF-Zellen weniger proliferativ und wandernd und unterscheiden sich hauptsächlich von Kardiomyozyten, da sie den linken Ventrikel und einen kleineren Teil der Vorhöfe11hervorrufen. Darüber hinaus sind SHF-Vorläufer durch die Expression von Tbx1, FGF8, FGF10 und Six2 gekennzeichnet, während FHF-Zellen Hcn4 und Tbx511,12,13,14,15ausdrücken.
PSCs können sich auf alle drei Keimschichten undanschließend auf jeden Zelltyp im Körper 4,16differenzieren. Daher bieten sie ein enormes Potenzial für das Verständnis der Herzentwicklung und für die Modellierung spezifischer Entwicklungsdefekte, die zu angeborenen Herzerkrankungen führen, die häufigste Ursache von Geburtsfehlern17. Eine große Untergruppe der angeborenen Herzerkrankungen umfasst kammerspezifische Herzanomalien18,19. Es ist jedoch noch unklar, ob diese aus der anomalen Herzfeldentwicklung stammen. Darüber hinaus gab es angesichts der Unfähigkeit von Kardiomyozyten, sich nach der Geburt zu vermehren, umfangreiche Bemühungen, Herzgewebe für die Herzregeneration1,7,20zu schaffen. Unter Berücksichtigung der physiologischen und morphologischen Unterschiede zwischen Herzkammern ist die Erzeugung von kammerspezifischem Herzgewebe mit PSCs von erheblicher Bedeutung. Während die jüngsten Fortschritte in der Entwicklungskardiologie zu einer robusten Generierung von Herzzellen aus PSCs geführt haben, ist es immer noch unklar, ob die beiden Herzfelder in PSC-Systemen induziert werden können.
Um die Kardiogenese in vitro zu rekapitulieren und die Spezifikation und die Eigenschaften von CPCs zu untersuchen, haben wir zuvor ein System verwendet, das auf der Differenzierung von PSC-abgeleiteten Herzsphäroiden21,22,23,24basiert. Kürzlich haben wir embryonale Mausstammzellen (mESCs) mit GFP- und RFP-Reportern unter der Kontrolle des FHF-Gens Hcn4 bzw. des SHF-Gens Tbx1 (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. In vitro differenzierte mESCs bildeten Herzsphäroide, in denen GFP+- und RFP+-Zellen aus zwei unterschiedlichen Bereichen mesodermaler Zellen auftraten und komplementär gemustert wurden. Die resultierenden GFP+- und RFP+-Zellen wiesen FHF- bzw. SHF-Eigenschaften auf, die durch RNA-Sequenzierung und klonale Analysen bestimmt wurden. Wichtig ist, dass wir mit hilfe von mESCs, die den Isl1-RFP-Reporter (mESCIsl1-RFP)tragen, entdeckt enden, dass SHF-Zellen durch das Zelloberflächenprotein CXCR4 originalgetreu gekennzeichnet sind, was die Isolierung von herzfeldspezifischen Zellen ohne Transgene ermöglichen kann. Das vorliegende Protokoll wird die Erzeugung und Isolierung herzfeldspezifischer CPCs von mESCs beschreiben, die als wertvolles Instrument zur Untersuchung kammerspezifischer Herzkrankheiten dienen können.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1251px;" width="1250">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.1% (w/v) Gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100X Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1X PBS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40&#956;m cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td align="right">35223</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Activin A</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>338-AC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 minus vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BMP4</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:245px;">Sony</td>
			<td style="width:344px;">SH800</td>
			<td style="width:241px;">Sony or any other fluorescence-activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell strainer 70&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge Sorvall Legend XT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">75004508</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CHIR99021</td>
			<td>Selleck chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">51030285</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Corning Ultra Low Attachment T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Countless II FL automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571, Lot #1757130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium high glucose (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ESGRO (LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EVOS FL microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glasgow&#8217;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monothioglycero (MTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MS-295-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acid solution (NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suspension culture dish 150 mm x 25mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE (Trypsin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td align="right">72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells

Pluripotente Stammzellen bieten ein großes Potenzial für das Verständnis von Herzentwicklung und -erkrankungen sowie für die regenerative Medizin. Während die jüngsten Fortschritte in der Entwicklungskardiologie zur Erzeugung von Herzzellen aus pluripotenten Stammzellen geführt haben, ist unklar, ob die beiden Herzfelder - das erste und das zweite Herzfeld (FHF und SHF) - in pluripotenten Stammzellensystemen induziert werden. Um diesem Problem zu begegnen, haben wir ein Protokoll zur In-vitro-Spezifikation und Isolierung herzfeldspezifischer Herzvorläuferzellen erstellt. Wir verwendeten embryonale Stammzellenlinien, die Hcn4-GFP und Tbx1-Cre trugen; Rosa-RFP-Reporter der FHF bzw. der SHF und Live-Zell-Immunostainierung des Zellmembranproteins Cxcr4, einem SHF-Marker. Mit diesem Ansatz erzeugten wir Vorläuferzellen, die die funktionellen Eigenschaften und Transkriptome ihrer In-vivo-Gegenstücke rekapitulieren. Unser Protokoll kann genutzt werden, um die frühe Spezifikation und Segregation der beiden Herzfelder zu untersuchen und kammerspezifische Herzzellen für die Herzkrankheitsmodellierung zu generieren. Da es sich um ein In-vitro-Organoidsystem handelt, liefert es möglicherweise keine genauen anatomischen Informationen. Dieses System überwindet jedoch die schlechte Zugänglichkeit von Embryon im Gastrulationsstadium und kann für Bildschirme mit hohem Durchsatz hochskaliert werden.

Nach ca. 132 h Differenzierung können Tbx1-RFP und Hcn4-GFP CPCs mit einem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden (Abbildung 2). Im Allgemeinen erscheinen GFP- und RFP-Zellen ungefähr zur gleichen Zeit. Die beiden Populationen der CPCs dehnen sich weiterhin in unmittelbarer Nähe und häufig in einem komplementären Muster aus. Die Anpassung der Konzentrationen von Activin A und BMP4 wird die Prozentsätze von FHF vs SHF-CPCs ändern (Abbildung 3). Die CPC-S...

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In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Der Zweck dieser Methode ist es, herzfeldspezifische Herzvorläuferzellen in vitro zu erzeugen, um die Vorläuferzellspezifikation und funktionelle Eigenschaften zu untersuchen und kammerspezifische Herzzellen für die Herzkrankheitsmodellierung zu generieren.

In Vitro-Generierung von Mausherzfeldspezifischen Herzvorläuferzellen

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Unsere Methode zielt darauf ab, herzfeldspezifische Herzvorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus zu erzeugen. Diese Herzfeld-Reporter-Stammzelllinie ermöglicht die Hochdurchsatz-Studie der Mechanismen, die angeborenen Herzerkrankungen zugrunde liegen, und bietet ein System, das für genetische und pharmakologische Manipulationen geeignet ist. Es gibt mehrere kammerspezifische angeborene Herzerkrankungen.Durch die Rekapitulation der Kardiogenese in vitro ermöglicht dieses Protokoll die Untersuchung des Krankheitsmechanismus und die Entwicklung zukünftiger regenerativer Therapien. Dieses Protokoll kann einen Einblick in die Art und Weise geben, wie Herzvorläuferzellen verschiedener Kammern während der Herzentwicklung spezifiziert werden. Beginnen Sie mit dem Anbau transgener Maus-Embryonalstammzellen in 0,1%gelatinebeschichteten T25-Flaschen in 2i Medium.Wenn die Zellen 70 bis 80 % Zusammenfluss erreichen, spülen Sie die Kulturen mit PBS ab und fügen Sie einen Milliliter Trypsin pro Kolben hinzu, um die Kultur drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einzelne Zellen zu dissoziieren. Wenn sich die Zellen gelöst haben, neutralisieren Sie die Reaktion mit vier Millilitern 10 FBS in DMEM und zählen Sie die Zellen nach einer geeigneten Methode. Verdünnen Sie die Zellen auf etwa dreimal 10 bis die fünf Zellen pro frischer mittlerer Konzentration und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.Dann das Pellet in fünf Milliliterfrischem 2i-Medium wieder aufsetzen, um es auf neue 0,1%gelatinebeschichtete T25-Flaschen zu replatieren. Für die CPC-Generation aus Herzsphäroiden, sammeln 2,5 mal 10 bis die sechs der abgetrennten transgenen Maus embryonale Stammzellprobe durch Zentrifugation, und resuspendieren die Zellen in 25 Milliliter SFD Medium. Die Zellsuspension für 48 Stunden in eine 150 mal 25 Millimeter sterile Platte für die Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid geben.Am Ende der Inkubation, sammeln Sie die Herzsphäride in einem konischen Rohr. Sedimentieren Sie die Sphäroide durch Zentrifugation, um die selektive Isolierung der Sphäroide zu erleichtern und einzelne Zellen zu vermeiden. Setzen Sie die Sphäroide in 25 Milliliter frisches SFD-Medium wieder auf, ergänzt durch ein Nanogramm pro Milliliter Aktivin A und 1,5 Nanogramm pro Milliliter Knochenmorphogenetisches Protein vier.Die Sphäroide für eine 24-Stunden-Inkubation im Zellkultur-Inkubator wieder auf dieselbe Kulturplatte zurücklegen. Am nächsten Tag, erinnern Sie sich an alle Herzsphäroide durch Zentrifugation. Setzen Sie die differenzierten embryoiden Körper in 25 Milliliter frischem SFD-Medium für die Beschichtung in einem ultra-niedrigen Anhang, 75-Zentimeter-Quadratkolben im Zellkultur-Inkubator für 48 Stunden aus.Zur Isolierung des herzfeldspezifischen CPC mit fluoreszierenden Reportern, sammeln Sie die embryoiden Körper durch Zentrifugation und dissoziieren Sie die 3D-Kulturen mit einem Milliliter Trypsin bei 37 Grad Celsius für drei Minuten. Am Ende der Inkubation gut durch Pipettieren mischen, um die Zellen zu dissoziieren und die Reaktion mit vier Millilitern von 10%FBS in DMEM zu neutralisieren. Übergeben Sie das Gemisch über ein 70-Mikrometer-Sieb, um alle nicht dissoziierten embryonalen Körper zu entfernen, und sedimentieren Sie die gefilterten Zellen durch Zentrifugation.Um die CPCs nach ihrem fluoreszierenden Reporterausdruck zu sortieren, setzen Sie das Pellet in 500 Mikroliter FACS-Lösung wieder auf und filtern Sie die Zellen durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb in ein Fünf-Milliliter-Polystyrol-Rundbodenrohr auf Eis. Sortieren Sie dann die Zellen, um die RFP- und GFP-exemitten Zellen durch FACS zu isolieren, und sammeln Sie die Zellen in einem Milliliter FBS. Um CPCs des ersten oder zweiten Herzensfeldes auf der Grundlage ihrer Oberflächenprotein-Cxcr4-Expression zu isolieren, setzen Sie die embryonale Stammzelle RFP-exezierende Herzvorläuferzellen in 300 Mikrolitern von 10%FBS in PBS, ergänzt mit fluoreszenzkonjugiertem Anti-Cxcr4-Antikörper, wieder auf.Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur die Zellen dreimal in ein bis zwei Millilitern frischer, kalter PBS pro Wäsche waschen. Nach der letzten Wäsche die Zellen in 500 Mikroliter FACS-Lösung wieder aussetzen und die Zellen durch ein 40-Mikrometer-Sieb in ein fünf Milliliter rundes Unterrohr filtern. Sortieren Sie dann die Zellen nach ihrem Cxcr4-Ausdruck und sammeln Sie sowohl die Cxcr4-positiven als auch die negativen Populationen in einzelne Röhren, die einen Milliliter FPS pro Röhre auf Eis enthalten.Um die FACS-isolierten, herzfeldspezifischen Herzvorläuferzellen neu zu kultitogen, sammeln Sie die sortierten Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie die Pellets im SFD-Medium wieder auf. Dann säen Sie etwa dreimal 10 zu den vier Zellen pro Brunnen in einer 0,1%gelatinebeschichteten, 384-Well-Platte. Wenn nach der Sortierung ein erhöhter Zelltod festgestellt wird, fügen Sie jedem Brunnen einen 10-Mikromolaren-ROCK-Inhibitor hinzu.Nach zwei Tagen Kultur sollte spontanes Schlagen beobachtet werden. Um die Fähigkeit der plattierten CPCs zu analysieren, sich zu Kardiomyozyten zu unterscheiden, sammeln Sie die Zellen an Tag 12 der Differenzierung mit Trypsin, wie gezeigt, um die einzelnen Kardiomyozyten zu isolieren und die Zellen in 4% Paraformaldehyd wieder auszusetzen. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur die festen Zellen durch Zentrifugieren sammeln und das Pellet in PBS waschen, um die überschüssige Fixierung zu entfernen.Als Nächstes setzen Sie die Zellen in 10%FBS in PBS wieder aus, und inkubieren Sie die Hälfte der Zellprobe mit dem Antitroponin-T-Antikörper der Maus, und verwenden Sie die andere Hälfte der Probe als negative Kontrolle. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur die Zellen zweimal in frischem PBS waschen und die Proben in 10% FBS plus PBS, ergänzt mit einem geeigneten Sekundärantikörper, wieder aufsetzen. Nach einer weiteren 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur die Zellen zweimal in frischem PBS pro Waschgang waschen und die Zellen in 200 Mikroliter PBS pro Tube zur Analyse auf einem Durchflusszytometer wieder aufsetzen.Nach ca. 132 Stunden Differenzierung können Tbx1-RFP und Hcn4-GFP Herzvorläuferzellen durch Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden. Im Allgemeinen erscheinen sowohl GFP- als auch RFP-Zellen ungefähr zur gleichen Zeit, und die beiden Populationen von Vorläuferzellen dehnen sich weiterhin in unmittelbarer Nähe und typischerweise in einem komplementären Muster aus. Die Anpassung der Konzentrationen von Aktivin A und Knochen morphogenetischem Protein vier wird die Prozentsätze der ersten versus zweiten Herzfeld-Herzvorläuferzellen verändern.In ähnlicher Weise erscheinen mit einer RFP-Reportermaus embryonale Stammzelllinie nach 132 Stunden Differenzierung RFP-positive Kardiasvorläuferzellen. Nach der Immunfärbung für Cxcr4, RFP-positiv, Cxcr4-positiv und RFP-positiv können Cxcr4-negative Zellen isoliert werden. Die Immunostainierung für Herztroponin T an Tag 12 der Differenzierung bestätigt, dass sich die ersten Herzfeldzellen hauptsächlich in Myozyten differenzieren.In ähnlicher Weise führen Zellen, die aus RFP-positiven, Cxcr4-negativen Kardinostvorläuferzellen gewonnen werden, zu Kardiomyozyten mit viel höheren Prozentsätzen als bei cxcr4-einzelpositiven Kardinostvorläuferzellen. Gelegentlich können sich embryonale Stammzellen der Maus nicht effizient differenzieren und bilden eine sehr geringe Anzahl herzfeldspezifischer Herzvorläuferzellen. Das Timing, die Konzentration und die Konsistenz der Zugabe der Zytokine und die Anzahl der Zellen sind entscheidend für eine erfolgreiche Erzeugung kammerspezifischer Herzvorläuferzellen.Nach diesem Verfahren können die Forscher die physiologischen Eigenschaften der verschiedenen Populationen von Herzvorläuferzellen analysieren, um weitere Einblicke in ihre Spezifikation und Funktion zu erhalten.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Ableitung von Herzvorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Generierung von murinen Herzschrittmacher Zellaggregate Basierend auf ES-Zell-Programmierung in Kombination mit Myh6-Promoter-Auswahl

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Initiieren Differenzierung in Immortalisierte multipotenten Vorläuferzellen Otic

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In - vitro - Assays für Colony Tri-potente Progenitorzellen Charakterisieren von den Adult Murine Pancreas Isoliert

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Hypoxische Vorkonditionierung von Marrow-abgeleiteten Progenitor-Zellen als Quelle für die Erzeugung von reifen Schwann-Zellen

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Entwicklung eines In-vitro- Assay, hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen Quantitate Zellen (HSPCs) bei der Entwicklung von Zebrafish Embryos

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generation der ersten Herz Bereich-wie kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Induktion der endothelialen Differenzierung in kardialen Vorläuferzellen unter niedrigen Serum-Bedingungen

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...