Name: in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

א. ט. נתמך על ידי הקסם החשוב ו-AHA. ג. ק. הייתה נתמכת על ידי מענקים מ-R01HD086026/NIH, AHA ו-MSCRF.

הערה: בדור מחוץ לתחום של לב שדות העכבר הספציפיים לשדה הלב (איור 1).
1. תחזוקה של ESCs העכבר
<ol><li>לגדול mESCs (mESCsTbx1-יצור; . רוזה-ראFP HCN4-GFP, mescISL1-rfp)25 על 0.1% (w/v) ג'לטין מצופה T25 מבחנות ב 2i בינונית (870 ml של מדיום חיוני מינימלי של הפרה...

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li><li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+cardiomyocyte.">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li><li>Birket, M. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+cardiovascular+progenitors--a+developmental+perspective.">Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective.</a> Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient.">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Atrial+and+Ventricular+Cardiomyocytes+Develop+from+Distinct+Mesoderm+Populations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Galdos, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Regeneration:+Lessons+From+Development.">Cardiac Regeneration: Lessons From Development.</a> Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).</li><li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lineage+restriction+in+temporally+distinct+populations+of+Mesp1+progenitors+during+mammalian+heart+development.">Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development.</a> Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+networks+in+heart+development+and+regeneration.">Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).</li><li>Bruneau, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber-specific+cardiac+expression+of+Tbx5+and+heart+defects+in+Holt-Oram+syndrome.">Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.</a> Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+gene+regulation+in+the+second+heart+field+by+Tbx1,+Nkx2-5,+and+Islet1+reveals+a+genetic+switch+for+down-regulation+in+the+myocardium.">Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).</li><li>Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fate+map+of+Tbx1+expressing+cells+reveals+heterogeneity+in+the+second+cardiac+field.">A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field.</a> Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+Distinct+Six2-Positive+Second+Heart+Field+Progenitors+Regulate+Mammalian+Heart+Development+and+Disease.">Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease.</a> Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+neonatal+rat+system+as+a+bioincubator+to+generate+adult-like+mature+cardiomyocytes+from+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells.">Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).</li><li>Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+heart+disease:+entering+a+new+era+of+human+genetics.">Congenital heart disease: entering a new era of human genetics.</a> Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome.">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAND1+loss-of-function+mutation+contributes+to+congenital+double+outlet+right+ventricle.">HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells.">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, 02164 (2014).</li><li>Morita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall1+transiently+marks+undifferentiated+heart+precursors+and+regulates+their+fate.">Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326 (5951), 426-429 (2009).</li></ol>

בפרוטוקול שלנו, אנו מתארים מתודולוגיה ליצירת מידרואידים קרדיולוגית ומבודדים בשדה הלב הייחודיים של ה-CPCs. ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד מנגנונים של מפרט CPC ותכונותיהם, כמו גם לדגמי מחלות ספציפיות לתאי לב. אחת העבודות שפורסמו בעבר השתמשו בשורה mESC עם שני כתבים פלורסנט (Mef2c/Nkx 2.5) כדי ללמוד cardiogenesis בת...

השימוש בתאי גזע פלאוריטי (PSCs) יש מהפכה בתחום התחדשות הלב ורפואה אישית עם מיציטים ספציפיים לחולה עבור מידול מחלות וטיפולים בסמים1,2,3, 4. לאחרונה, בפרוטוקולי חוץ גופית עבור דור של פרפור לעומת המוח, כמו גם קוצב לב PSC-הקרדיוציטים הנגזר פותחו5,6. עם זאת, אם cardiogenesis ניתן ליצור מחדש בתחום החוץ כדי ללמוד את התפתחות הלב ולאחר מכן ליצור החדרית תאי הלב ספציפיים לחדר עדיין לא ברור.
במהלך ההתפתחות העובריים המוקדמת, התאים המזושים תחת השפעת מורגנים מופרשים כגון BMP4, Wnts ופעילות בצורה פרימיטיבית7. תאים מזופנים לב מסומנים על-ידי הביטוי של Mesp1, להעביר למטה ולמטה ליצור את הסהר הקרדיולוגית ולאחר מכן את צינור הלב הפרימיטיבי7,8. זו קבוצת הנדידה של תאים כולל שתי אוכלוסיות נפרדות מאוד של תאים מחולל לב (cpcs), כלומר הראשון ואת שדה הלב השני (fhf ו shf)9,10. תאים מן SHF הם מתרבים מאוד נדידה והם אחראים בעיקר התארכות ולולאה של צינור הלב. בנוסף, תאים shf להבדיל הקרדיוציטים, פיברותקיעות, שריר החלקה ותאים אנדותל כפי שהם נכנסים לצינור הלב כדי ליצור את החדר הימני, מערכת הכניסה הבין-חדרית הימנית ואת החלק הגדול של שתי האטריה7,10. לעומת זאת, תאים fhf הם מתרבים פחות הנדידה ולהבדיל בעיקר הקרדיוציטים כפי שהם מעניקים לחדר שמאל וחלק קטן יותר של אטריה11. יתר על כן, shf ושלתי מסומנים על ידי הביטוי של Tbx1, FGF8, FGF10 וSix2 בעוד fhf תאים express Hcn4 ו Tbx511,12,13,14,15.
PSCs יכול להבדיל לכל שלוש שכבות הנבט ולאחר מכן כל סוג תא בגוף4,16. לכן, הם מציעים פוטנציאל עצום להבנת התפתחות הלב ולמידול פגמים התפתחותיים ספציפיים כתוצאה ממחלת לב מולדים, הגורם השכיח ביותר למומים מולדים17. תת קבוצה גדולה של מחלת לב מולדים כולל ליקויים בתאי הלב הספציפיים18,19. עם זאת, עדיין לא ברור אם אלה מקורם בפיתוח שדה לב חריג. בנוסף, בהינתן חוסר היכולת של הקרדיוציטים להתרבות לאחר הלידה, היו מאמצים נרחבים ליצור רקמת לב להתחדשות הלב1,7,20. בהתחשב ההבדלים הפיסיולוגיים ומורפולוגיים בין תאי לב, הדור של רקמת הלב ספציפי לחדר באמצעות PSCs הוא בעל חשיבות משמעותית. בעוד ההתקדמות האחרונה בקרדיולוגיה התפתחותית הובילו לדור חזק של תאי לב מ PSCs, זה עדיין ברור אם שני שדות הלב יכול להיות המושרה במערכות PSC.
כדי לcardiogenesis את המפרט והמאפיינים של cpcs, השתמשנו בעבר מערכת מבוססת על ההבחנה PSC-נגזרות לב הנגזרים21,22,23,24. לאחרונה, שיצרנו תאים גזע מעובריים של העכבר (mESCs) עם כתבים GFP ו-RFP תחת שליטה של FHF gene Hcn4 ואת הגן SHF Tbx1, בהתאמה (mESCsTbx1-יצור; . רוזה-ראFP HCN4-GFP) 25. ב מתורבת הבדיל mESCs יצר spheroids לב שבו GFP + ו RFP התאים הופיעו משני אזורים ברורים של תאים מזועורי ומתבנית באופן משלים. התאים המתקבלים GFP + ו RFP + הציגו FHF ו SHF מאפיינים, בהתאמה, נקבע על-ידי רצפי RNA וניתוחים שבטיים. חשוב מכך, באמצעות mESCs נושאים את הכתב Isl1-RFP (mESCIsl1-RFP), גילינו כי תאים shf היו מסומנים בנאמנות על ידי חלבון פני השטח התאים CXCR4, וזה יכול לאפשר בידוד של תאים ספציפיים לשדה הלב ללא טרנסגנים. הפרוטוקול הנוכחי יתאר את הדור והבידוד של CPCs לשדה הלב ספציפיים מ mESCs, אשר עשוי לשמש כלי רב ערך ללימוד מחלת לב מסוימת לחדר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1251px;" width="1250">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.1% (w/v) Gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100X Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1X PBS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40&#956;m cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td align="right">35223</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Activin A</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>338-AC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 minus vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BMP4</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:245px;">Sony</td>
			<td style="width:344px;">SH800</td>
			<td style="width:241px;">Sony or any other fluorescence-activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell strainer 70&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge Sorvall Legend XT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">75004508</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CHIR99021</td>
			<td>Selleck chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">51030285</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Corning Ultra Low Attachment T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Countless II FL automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571, Lot #1757130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium high glucose (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ESGRO (LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EVOS FL microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glasgow&#8217;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monothioglycero (MTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MS-295-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acid solution (NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suspension culture dish 150 mm x 25mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE (Trypsin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td align="right">72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells

תאי גזע פלאוריטי מציעים פוטנציאל רב להבנת התפתחות לב ומחלות ולרפואה רגנרטיבית. בעוד ההתקדמות האחרונה בקרדיולוגיה התפתחותית הובילו לייצר תאים לב מתאי גזע פלאוריטי, זה לא ברור אם שני שדות הלב-הראשון והשני שדות הלב (FHF ו SHF)-הם המושרה במערכות מערכות גזע רב עוצמה pluripotent ובידוד של תאים. ספציפיים לשדה-הלב השתמשנו בתאי גזע עובריים הנושאים Hcn4-GFP ו Tbx1-היצורים; רוזה-RFP כתבים של FHF ואת SHF, בהתאמה, ואת החיסוני לחיות התאים של הקרום התא חלבון Cxcr4, סימן SHF. עם גישה זו, יצרנו תאים מחולל קדמון אשר לכידה של המאפיינים הפונקציונליים ואת ההמרה של שלהם vivo עמיתיהם. הפרוטוקול שלנו יכול להיות מנוצל כדי ללמוד מוקדם מפרט והפרדה של שני שדות הלב וליצור תאי לב ספציפיים לחדר לדגמי מחלות לב. מאחר שזוהי מערכת ארגונית מחוץ למערכת, ייתכן שהיא אינה מספקת מידע אנטומי מדויק. עם זאת, מערכת זו גוברת על הנגישות הירודה של עוברי הבמה והוא יכול להיות מוקטן עבור מסכי תפוקה גבוהה.

לאחר כ 132 h של בידול, Tbx1-RFP ו-Hcn4-GFP מחשבים ניתן להבחין באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט (איור 2). באופן כללי, תאים GFP ו-RFP מופיעים בערך באותו זמן. שתי האוכלוסיות של CPCs ממשיכות להתרחב בסמיכות ובדרך כלל בתבנית משלימה. התאמת ריכוזי הפעילות הBMP4 תשנה את האחוזים של FHF לעומת SHF CPCs (איו...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

מטרת שיטה זו היא לייצר תאים ספציפיים לשדה הלב בחלל החוץ בתוך מבחנה כדי ללמוד את המפרט תא מחולל ותכונות פונקציונלי, וליצור תאי לב מסוימים בחדר לדגמי מחלות לב.

בדור מחוץ לתחום של לב העכבר שדה מסוים בתאי לב

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

השיטה שלנו שואפת ליצור תאי לב ספציפיים ללב תאי לב מתאים גזע עובריים של עכבר. קו תאי גזע זה של כתב שדה הלב מאפשר מחקר תפוקה גבוהה של המנגנונים שבבסיס מחלת לב מולדת, ומספק מערכת נוחה למניפולציה גנטית ופרמקולוגית. ישנן מספר מחלות לב מולדות ספציפיות לתא.על ידי recapitulating cardiogenesis במבחנה, פרוטוקול זה מאפשר את המחקר של מנגנון המחלה ופיתוח של טיפולים רגנרטיביים בעתיד. פרוטוקול זה יכול לספק תובנה כיצד תאי לב של תאים שונים מוגדרים במהלך התפתחות הלב. התחילו בגידול תאי גזע עובריים מהודרים ב-0.1% צלוחיות T25 מצופות ג'לטין במדיום 2i.כאשר התאים מגיעים 70 עד 80%confluence, לשטוף את התרבויות עם PBS ולהוסיף מיליליטר אחד של טריפסין לכל בקבוק כדי לנתק את התרבות לתאים בודדים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. כאשר התאים התנתקו, לנטרל את התגובה עם ארבעה מיליליטר 10 FBS ב DMEM ולספירת התאים בשיטה מתאימה. מדללים את התאים לפי שלושה בערך עד חמשת התאים לריכוז בינוני טרי, ואוסף את התאים באמצעות צנטריפוגה.לאחר מכן תוכלו למחזר את גלולת הכדור בחמישה מיליליטר של מדיום 2i טרי לחזרה על בקבוקונים חדשים מצופים 0.1% ג'לטין T25. עבור דור CPC מ spheroids לב, לאסוף 2.5 פעמים 10 לשישה של עכבר מנותק מדגם תא גזע עוברי על ידי צנטריפוגה, ו resuspend התאים ב 25 מיליליטר של מדיום SFD. צלחת ההשעיה התא לתוך אחד 150 על ידי 25 מילימטר צלחת סטרילית עבור דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 48 שעות.בסוף הדגירה, לאסוף את כדורי הלב לתוך צינור חרוט. מעים את הכדורים על ידי צנטריפוגה כדי להקל על בידוד סלקטיבי של כדוריות כדי למנוע תאים בודדים. תן את הכדורידים ב 25 מיליליטר של בינוני SFD טרי בתוספת ננוגרם אחד למיליליטר של activin A ו 1.5 ננוגרם למיליליטר של חלבון מורפוגנטי עצם ארבע.להחזיר את הכדורידים בחזרה לאותה צלחת תרבות עבור דגירה 24 שעות ביממה באינקובטור תרבות התא. למחרת, זכרו את כל כדורי הלב על ידי צנטריפוגה. תן מחדש את הגופים העובריים המובחנים ב-25 מיליליטר של מדיום SFD טרי עבור ציפוי בבקבוקון בריבוע באורך 75 ס"מ באינקובטור של תרבות התאים למשך 48 שעות.לבידוד של CPC ספציפי לשדה הלב באמצעות כתבים פלואורסצנטיים, לאסוף את הגופות העובריות על ידי צנטריפוגה לנתק את תרבויות 3D עם מיליליטר אחד של טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. בסוף הדגירה, מערבבים היטב על ידי צינור כדי לנטרל את התאים ולנטרל את התגובה עם ארבעה מיליליטר של 10%FBS ב DMEM. מעבירים את התערובת מעל מסננת של 70 מיקרומטר כדי להסיר גופים עובריים שאינם ניתוקים, ומנחים את התאים המסוננים על ידי צנטריפוגה.כדי למיין את ה- CPCs לפי ביטוי הכתב הפלואורסצנטי שלהם, השתמש מחדש את גלולה ב 500 מיקרוליטרים FACS פתרון ולסנן את התאים דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך צינור פוליסטירן 5 מיליליטר עגול התחתון על קרח. לאחר מכן מיין את התאים כדי לבודד את התאים המבטאים את RFP ו- GFP לפי FACS, ואוסף את התאים במיליליטר אחד של FBS. כדי לבודד CPCs שדה הלב הראשון לעומת השני מבוסס על ביטוי Cxcr4 חלבון פני השטח שלהם, resuspend תא גזע עוברי עכבר יחיד RFP ביטוי תאי אב לב ב 300 microliters של 10%FBS ב PBS בתוספת נוגדן אנטי Cxcr4 מצומד פלואורסצנטי.לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את התאים שלוש פעמים אחד עד שני מיליליטר של PBS טרי, קר לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, תן שימוש חוזר בתאים ב-500 מיקרוליטרים של פתרון FACS וסנן את התאים דרך מסננת של 40 מיקרומטר לצינור של חמישה מיליליטר ועגול. לאחר מכן מיין את התאים לפי ביטוי Cxcr4 שלהם, איסוף הן Cxcr4 חיובי ואוכלוסיות שליליות לתוך צינורות בודדים המכילים מיליליטר אחד של FPS לכל צינור על קרח.כדי לתרבת מחדש את תאי הלב המבודדים, הספציפיים לשדה הלב, לאסוף את התאים ממוינים לפי צנטריפוגה ולתלות מחדש את כדורי במדיום SFD. לאחר מכן זרע כשלוש פעמים 10 לארבעת התאים ל באר בצלחת מצופה 0.1% ג'לטין, 384 היטב. אם מוות מוגבר של תאים מצוין לאחר המיון, הוסף מעכב רוק 10 מיקרומולרי לכל באר.לאחר יומיים של תרבות, יש לצפות במכות ספונטניות. כדי לנתח את היכולת של CPCs מצופים להבדיל קרדיומיוציטים, לאסוף את התאים ביום 12 של הבחנה עם טריפסין, כפי שהוכח, כדי לבודד את cardiomyocytes יחיד ו resuspend התאים ב 4% paraformaldehyde. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, לאסוף את התאים הקבועים על ידי צנטריפוגה ולשטוף את גלולה PBS כדי להסיר את התיקון עודף.לאחר מכן, השתמשו מחדש בתאים ב-10%FBS ב-PBS, והדגירה חצי מדגם התא עם נוגדן T נגד טרופונין עכבר ולהשתמש בחצי השני של המדגם כפקד שלילי. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את התאים פעמיים PBS טרי resuspend את הדגימות ב 10%FBS בתוספת PBS בתוספת נוגדן משני מתאים. לאחר דגירה נוספת של 30 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את התאים פעמיים PBS טרי לכל לשטוף מחדש את התאים ב 200 microliters של PBS לצינור לניתוח על ציטומטר זרימה.לאחר כ 132 שעות של בידול, Tbx1-RFP ו Hcn4-GFP תאי אב לב ניתן לזהות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. בדרך כלל, הן תאי GFP והן תאי RFP מופיעים בערך באותו הזמן, ושתי האוכלוסיות של תאי האדון ממשיכות להתרחב בסמיכות ובדרך כלל בתבנית משלימה. התאמת הריכוזים של activin A וחלבון מורפגנטי עצם ארבע ישנה את האחוזים של תאים ראשונים לעומת שדה לב שני אבי הלב.באופן דומה, באמצעות RFP כתב עכבר קו תאי גזע עובריים, לאחר 132 שעות של בידול, RFP חיובי תאי לב. לאחר כשל חיסוני עבור Cxcr4, תאים חיוביים ל- RFP, Cxcr4 חיוביים וחיוביים ל- RFP, ניתן לבודד תאים שליליים Cxcr4. Immunostaining עבור טרופונין לב T ביום 12 של הבחנה מאשר כי תאי שדה הלב הראשון להבדיל בעיקר לתוך מיוציטים.באופן דומה, תאים הנגזרים RFP חיובי, Cxcr4 שלילי תאי הצאצא הלב ללדת cardiomyocytes באחוזים גבוהים בהרבה בהשוואה לתאי Cxcr4 אחד חיובי לב. מדי פעם, תאי גזע עובריים של העכבר אינם מצליחים להבדיל ביעילות ויוצרים מספרים נמוכים מאוד של תאי לב ספציפיים ללב. התזמון, הריכוז והעקביות של תוספת הציטוקיני ומספר התאים הם קריטיים עבור דור מוצלח של תאי לב ספציפיים לתאים.בעקבות הליך זה, החוקרים יכולים לנתח את המאפיינים הפיזיולוגיים של האוכלוסיות השונות של תאי אביה לב כדי לקבל תובנה נוספת על המפרט והתפקוד שלהם.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

גזירה של תאי לב ותאים מתאי גזע עובריים

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

דור של אגרגטים תא Murine לב קוצב לב בהתבסס על ES-Cell-תכנות בשילוב עם Myh6-יזם-בחירה

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

ייזום בידול בתאי multipotent otic אב הונצחו

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Hypoxic Preonditioning של תאים יליד מארו נגזר כמקור לדור של תאים שוואן בוגרת

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

התפתחות במבחנה הנועד Quantitate גזע Hematopoietic, קדמון תאים (HSPCs) בפיתוח עוברי דג זברה

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

הדור של אבות לב שדה דמויי הלב הראשון, דמוי-חדרית Cardiomyocytes מתאי גזע Pluripotent אנושי

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

אינדוקציה של אנדותל התמיינות בתאים לב בתנאים בסרום נמוך

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...