Name: in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

ई. टी जादू कि मामलों और AHA द्वारा समर्थित था. C. K. NICHD/NIH (R01HD086026), AHA, और एमएससीआरएफ से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

नोट: हृदय क्षेत्र-विशिष्ट माउस हृदय जनक कोशिकाओं की विट्रो पीढ़ी में (चित्र 1)।
1. माउस ESCs का रखरखाव
<ol><li>एसएमईएससी (एमईएससीTbx1-Cre; रोजा-आरएफपी; HCN4-GFP, एमईएससीIsl1-RFP)<sup class="xref"...

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li><li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+cardiomyocyte.">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li><li>Birket, M. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+cardiovascular+progenitors--a+developmental+perspective.">Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective.</a> Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient.">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Atrial+and+Ventricular+Cardiomyocytes+Develop+from+Distinct+Mesoderm+Populations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Galdos, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Regeneration:+Lessons+From+Development.">Cardiac Regeneration: Lessons From Development.</a> Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).</li><li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lineage+restriction+in+temporally+distinct+populations+of+Mesp1+progenitors+during+mammalian+heart+development.">Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development.</a> Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+networks+in+heart+development+and+regeneration.">Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).</li><li>Bruneau, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber-specific+cardiac+expression+of+Tbx5+and+heart+defects+in+Holt-Oram+syndrome.">Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.</a> Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+gene+regulation+in+the+second+heart+field+by+Tbx1,+Nkx2-5,+and+Islet1+reveals+a+genetic+switch+for+down-regulation+in+the+myocardium.">Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).</li><li>Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fate+map+of+Tbx1+expressing+cells+reveals+heterogeneity+in+the+second+cardiac+field.">A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field.</a> Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+Distinct+Six2-Positive+Second+Heart+Field+Progenitors+Regulate+Mammalian+Heart+Development+and+Disease.">Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease.</a> Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+neonatal+rat+system+as+a+bioincubator+to+generate+adult-like+mature+cardiomyocytes+from+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells.">Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).</li><li>Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+heart+disease:+entering+a+new+era+of+human+genetics.">Congenital heart disease: entering a new era of human genetics.</a> Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome.">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAND1+loss-of-function+mutation+contributes+to+congenital+double+outlet+right+ventricle.">HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells.">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, 02164 (2014).</li><li>Morita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall1+transiently+marks+undifferentiated+heart+precursors+and+regulates+their+fate.">Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326 (5951), 426-429 (2009).</li></ol>

हमारे प्रोटोकॉल में, हम कार्डियक अफ़ीरॉइड और अलग दिल क्षेत्र-विशिष्ट सीपीसी उत्पन्न करने के लिए एक पद्धति का वर्णन करते हैं। उन सीपीसी विनिर्देश और उनके गुणों के तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल क...

pluripotent स्टेम सेल (पीएससी) के उपयोग रोग मॉडलिंग और दवा उपचार1,2,3, के लिए रोगी विशेष मायोसाइट्स के साथ हृदय पुनर्जनन और व्यक्तिगत चिकित्सा के क्षेत्र में क्रांति ला दी है 4. हाल ही में, एट्रियल बनाम वेंट्रिकुलर के साथ-साथ पेसमेकर जैसे पीएससी व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के उत्पादन के लिए इन विट्रो प्रोटोकॉल में5,6 विकसित किए गएहैं. हालांकि, हृदय विकास का अध्ययन करने और बाद में वेंट्रिकुलर चैम्बर-विशिष्ट हृदय कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए कार्डियोजेनेसिस को इन विट्रो में फिर से बनाया जा सकता है या नहीं, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है।
प्रारंभिक भ्रूण ीय विकास के दौरान, बीएमपी 4, Wnts और Activin एक रूप आदिम लकीर7के रूप में स्रावित morphogens के प्रभाव में मध्यचर्मी कोशिकाओं . कार्डिएक मध्यचर्म कोशिकाओं Mesp1 की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित, पूर्वकाल और बाद में स्थानांतरित करने के लिए हृदय वर्धमान और फिर आदिम हृदय ट्यूब7,8. कोशिकाओं के इस प्रवासी समूह में हृदय जनक कोशिकाओं (सीपीसी) की दो बहुत अलग जनसंख्या एंकुलेशन शामिल हैं , अर्थात् पहला और दूसरा हृदय क्षेत्र (एफएचएफ और एसएचएफ )9,10. SHF से कोशिकाओं अत्यधिक proliferative और प्रवासी हैं और मुख्य रूप से दिल ट्यूब के दीर्घीकरण और पाशन के लिए जिम्मेदार हैं. इसके अतिरिक्त, SHF कोशिकाओं कार्डियोमायोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट्स, चिकनी मांसपेशियों और endothelial कोशिकाओं के लिए अंतर के रूप में वे दिल की ट्यूब में प्रवेश करने के लिए सही वेंट्रिकल, सही वेंट्रिकुलर बहिर्वाह पथ और दोनों atria के बड़े हिस्से के फार्म7,10. इसके विपरीत, एफएचएफ कोशिकाएं कम प्रोलफेटिव और प्रवासी होती हैं और मुख्य रूप से कार्डियोमायोसाइट्स में अंतर करते हैं क्योंकि वे बाएं वेंट्रिकल और एट्रिया11के एक छोटे भाग को जन्म देती हैं। इसके अलावा, SHF संतति Tbx1, FGF8, FGF10 और Six2 की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित कर रहे हैं, जबकि FHF कोशिकाओं Hcn4 और Tbx511व्यक्त ,12,13,14,15.
पीएससी सभी तीन रोगाणु परतों में अंतर कर सकता है और बाद में शरीर4,16में किसी भी कोशिका प्रकार में अंतर कर सकता है . इसलिए, वे हृदय के विकास को समझने और जन्मजात हृदय रोग के परिणामस्वरूप विशिष्ट विकासात्मकदोषों को मॉडलिंग करने के लिए जबरदस्त क्षमता प्रदान करते हैं, जो जन्म दोष 17 का सबसे अधिक कारण है। जन्मजात हृदय रोग के एक बड़े उपसमूह कक्ष-विशिष्ट हृदय असामान्यताओं18,19शामिल हैं. हालांकि, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि क्या ये असंगत हृदय क्षेत्र विकास से उत्पन्न होते हैं। इसके अलावा, जन्म के बाद कार्डियोमायोसाइट्स की गति बढ़ने में असमर्थता को देखते हुए हृदय पुनर्जनन1,7,20के लिए हृदय ऊतक बनाने के व्यापक प्रयास किए गए हैं. हृदय कक्षों के बीच शारीरिक और रूपात्मक मतभेदों को ध्यान में रखते हुए, पीएससी का उपयोग कर के कक्ष-विशिष्ट हृदय ऊतक की पीढ़ी महत्वपूर्ण महत्व की है। हालांकि विकास कार्डियोलॉजी में हाल ही में प्रगति पीएससी से हृदय कोशिकाओं की मजबूत पीढ़ी के लिए नेतृत्व किया है, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है अगर दो हृदय क्षेत्रों पीएससी प्रणालियों में प्रेरित किया जा सकता है.
विट्रो में कार्डियोजेनेसिस को पुन: प्राप्त करने और सीपीसी के विनिर्देश और गुणों का अध्ययन करने के लिए, हमने पहले पीएससी व्युत्पन्न कार्डियक स्फीरोइड21,22,23,24के आधार पर एक प्रणाली का उपयोग किया। हाल ही में, हम उत्पन्न माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (MESCs) GFP और RFP पत्रकारों के साथ FHF जीन Hcn4 और SHF जीन Tbx1 के नियंत्रण में, क्रमशः (mESCsTbx1-Cre; रोजा-आरएफपी; HCN4-GFP) 25| इन विट्रो विभेदित एमईएससी में कार्डियक गोलोइड ्स्ड होते हैं, जिनमें जीएफपी+ और आरएफपी+ कोशिकाएं मेसोडरमल कोशिकाओं के दो अलग-अलग क्षेत्रों से प्रकट होती हैं और पूरक तरीके से पैटर्न होती हैं। परिणामस्वरूप GFP + और आरएफपी + कोशिकाओं FHF और SHF विशेषताओं का प्रदर्शन किया, क्रमशः, आरएनए अनुक्रमण और क्लोनल विश्लेषण द्वारा निर्धारित. महत्वपूर्ण बात, Isl1-RFP रिपोर्टर (mESCIsl1-RFP)ले जाने mESCs का उपयोग कर, हमने पाया कि SHF कोशिकाओं ईमानदारी से सेल सतह प्रोटीन CXCR4 द्वारा चिह्नित किया गया, और यह transgenes के बिना दिल क्षेत्र-विशिष्ट कोशिकाओं के अलगाव सक्षम कर सकते हैं. वर्तमान प्रोटोकॉल एमईएससी से दिल क्षेत्र-विशिष्ट सीपीसी की पीढ़ी और अलगाव का वर्णन करेगा, जो चैम्बर-विशिष्ट हृदय रोग के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में काम कर सकता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1251px;" width="1250">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.1% (w/v) Gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100X Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1X PBS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40&#956;m cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td align="right">35223</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Activin A</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>338-AC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 minus vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BMP4</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:245px;">Sony</td>
			<td style="width:344px;">SH800</td>
			<td style="width:241px;">Sony or any other fluorescence-activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell strainer 70&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge Sorvall Legend XT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">75004508</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CHIR99021</td>
			<td>Selleck chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">51030285</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Corning Ultra Low Attachment T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Countless II FL automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571, Lot #1757130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium high glucose (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ESGRO (LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EVOS FL microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glasgow&#8217;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monothioglycero (MTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MS-295-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acid solution (NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suspension culture dish 150 mm x 25mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE (Trypsin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td align="right">72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells

Pluripotent स्टेम सेल दिल के विकास और रोग को समझने के लिए और पुनर्योजी दवा के लिए महान क्षमता प्रदान करते हैं. जबकि विकास कार्डियोलॉजी में हाल ही में प्रगति pluripotent स्टेम कोशिकाओं से हृदय कोशिकाओं को पैदा करने के लिए नेतृत्व किया है, यह स्पष्ट नहीं है अगर दो हृदय क्षेत्रों - पहले और दूसरे हृदय क्षेत्रों (FHF और SHF) - pluripotent स्टेम सेल सिस्टम में प्रेरित कर रहे हैं. इस पर ध्यान देने के लिए, हमने इन विट्रो विनिर्देश और हृदय क्षेत्र-विशिष्ट हृदय जनक कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल उत्पन्न किया। हम भ्रूण स्टेम कोशिकाओं Hcn4-GFP और Tbx1-Cre ले जाने लाइनों का इस्तेमाल किया; रोजा-आरएफपी एफएचएफ और एसएचएफ के पत्रकारों, क्रमशः, और कोशिका झिल्ली प्रोटीन Cxcr4, एक SHF मार्कर के लाइव सेल इम्यूनोस्टेनिंग। इस दृष्टिकोण के साथ, हम जनक कोशिकाओं जो कार्यात्मक गुण और उनके vivo समकक्षों में की transcriptome recapitulate उत्पन्न. हमारे प्रोटोकॉल जल्दी विनिर्देश और दो हृदय क्षेत्रों के अलगाव का अध्ययन करने के लिए और हृदय रोग मॉडलिंग के लिए कक्ष विशेष हृदय कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. चूंकि यह एक इन विट्रो organoid प्रणाली है, यह सटीक शारीरिक जानकारी प्रदान नहीं कर सकते हैं. हालांकि, इस प्रणाली gastrulation चरण भ्रूण की गरीब पहुंच पर काबू पाने और उच्च throughput स्क्रीन के लिए upscaleकिया जा सकता है.

लगभग 132 एच के विभेदन के बाद, Tbx1-RFP और Hcn4-GFP CPCs एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है (चित्र 2). सामान्यतया, GFP और RFP कक्ष लगभग एक ही समय के आसपास दिखाई देते हैं। सीपीसी की दो आबादी नि?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

इस विधि का उद्देश्य संतान कोशिका विनिर्देश और कार्यात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए, और हृदय रोग मॉडलिंग के लिए कक्ष विशिष्ट हृदय कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इन विट्रो में हृदय क्षेत्र-विशिष्ट हृदय जनक कोशिकाओं को उत्पन्न करना है।

माउस हार्ट फील्ड-विशिष्ट कार्डिएक संतति कोशिकाओं की विट्रो जनरेशन में

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

हमारी विधि का उद्देश्य माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं से हृदय क्षेत्र-विशिष्ट कार्डियक प्रोजेनिटर कोशिकाओं को उत्पन्न करना है। यह हार्ट फील्ड रिपोर्टर स्टेम सेल लाइन जन्मजात हृदय रोग अंतर्निहित तंत्र के उच्च थ्रूपुट अध्ययन के लिए अनुमति देता है, एक ऐसी प्रणाली प्रदान करता है जो आनुवंशिक और औषधीय हेरफेर के लिए उत्तरदायी है। कई चैंबर विशिष्ट जन्मजात हृदय रोग हैं।विट्रो में कार्डियोजेनेसिस को पुनः प्राप्त करके, यह प्रोटोकॉल रोग तंत्र के अध्ययन और भविष्य के पुनर्योजी उपचारों के विकास की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल हृदय विकास के दौरान विभिन्न कक्षों की कार्डियक प्रोजेनिटर कोशिकाओं को कैसे निर्दिष्ट किया जाता है, इस बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है। 2i माध्यम में 0.1% जिलेटिन-लेपित टी-25 फ्लास्क में ट्रांसजेनिक माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं को बढ़ने से शुरू करें।जब कोशिकाएं 70 से 80% संगम तक पहुंचती हैं, तो पीबीएस के साथ संस्कृतियों को कुल्लाएं और तीन मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को एकल कोशिकाओं में अलग करने के लिए प्रति फ्लास्क ट्राइप्सिन का एक मिलीलीटर जोड़ें। जब कोशिकाओं को अलग कर दिया है, DMEM में चार मिलीलीटर 10 FBS के साथ प्रतिक्रिया बेअसर और एक उपयुक्त विधि से कोशिकाओं की गिनती । कोशिकाओं को ताजा मध्यम एकाग्रता के अनुसार पांच कोशिकाओं के लिए लगभग तीन गुना 10 तक पतला करें, और अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को एकत्र करें।फिर नए 0.1% जिलेटिन-लेपित टी-25 फ्लास्क पर रिप्लेटिंग के लिए ताजा 2i माध्यम के पांच मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। कार्डियक स्फेरॉइड से सीपीसी पीढ़ी के लिए, अपकेंद्रित्र द्वारा अलग ट्रांसजेनिक माउस भ्रूणस्टेम सेल नमूने के छह करने के लिए २.५ गुना 10 इकट्ठा, और एसएफडी माध्यम के 25 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च । 37 डिग्री सेल्सियस और 48 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेशन के लिए एक 150-बाय-25 मिलीमीटर बाँझ प्लेट में सेल निलंबन प्लेट।इनक्यूबेशन के अंत में, कार्डियक स्फेरोइड को शंकु नली में इकट्ठा करें। स्पेरोइड के चयनात्मक अलगाव को सुविधाजनक बनाने और एकल कोशिकाओं से बचने के लिए अपकेंद्री द्वारा स्पेरोइड्स को तलछट। ताजा एसएफडी माध्यम के 25 मिलीलीटर में गोलाकारों को फिर से खर्च करें, जिसमें एक नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर एक्टिविन ए और 1.5 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन चार के साथ पूरक है।सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 24 घंटे की इनक्यूबेशन के लिए एक ही संस्कृति प्लेट पर गोलाकार वापस लें। अगले दिन, अपकेंद्रित्र द्वारा कार्डियक स्फेरॉइड के सभी याद करें। अल्ट्रा-लो अटैचमेंट में चढ़ाना के लिए ताजा एसएफडी माध्यम के 25 मिलीलीटर में विभेदित भ्रूण निकायों को फिर से खर्च करें, 48 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 75 सेंटीमीटर चुकता फ्लास्क।फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स का उपयोग करके हृदय क्षेत्र-विशिष्ट सीपीसी के अलगाव के लिए, अपकेंद्रित्र द्वारा भ्रूणीय निकायों को इकट्ठा करें और तीन मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्राइपसिन के एक मिलीलीटर के साथ 3 डी संस्कृतियों को अलग करें। इनक्यूबेशन के अंत में, कोशिकाओं को अलग करने और डीएमईएम में 10% एफबीएस के चार मिलीलीटर के साथ प्रतिक्रिया को बेअसर करने के लिए पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। किसी भी गैर-वियोजन भ्रूणीय शरीर को हटाने के लिए 70-माइक्रोमीटर छलनी पर मिश्रण पास करें, और अपकेंद्री द्वारा फ़िल्टर की गई कोशिकाओं को तलछट दें।अपने फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अभिव्यक्ति द्वारा CPCs सॉर्ट करने के लिए, ५०० माइक्रोलीटर FACS समाधान में गोली को फिर से खर्च करें और बर्फ पर पांच मिलीलीटर पॉलीस्टीरिन राउंड-बॉटम ट्यूब में ४०-माइक्रोमीटर सेल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर करें । फिर एफएफएस द्वारा आरएफपी-और जीएफपी-व्यक्त कोशिकाओं को अलग करने के लिए कोशिकाओं को सॉर्ट करें, एफबीएस के एक मिलीलीटर में कोशिकाओं को इकट्ठा करें। उनकी सतह प्रोटीन Cxcr4 अभिव्यक्ति के आधार पर पहले बनाम दूसरे दिल क्षेत्र CPCs को अलग करने के लिए, पीबीएस में 10% एफबीएस के 300 माइक्रोलीटर में एकल माउस भ्रूणस्टेम सेल आरएफपी-व्यक्त कार्डियक प्रोजेनिटर कोशिकाओं को फ्लोरेसेंस-कंजूस एंटी-सीक्सीआर4 एंटीबॉडी के साथ पूरक किया गया।कमरे के तापमान पर पांच मिनट के बाद, कोशिकाओं को प्रति वॉश ताजा, ठंडे पीबीएस के एक से दो मिलीलीटर में तीन बार धोएं। अंतिम धोने के बाद, FACS समाधान के 500 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और कोशिकाओं को पांच मिलीलीटर, गोल-नीचे ट्यूब में 40 माइक्रोमीटर छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें। फिर अपने Cxcr4 अभिव्यक्ति द्वारा कोशिकाओं को सॉर्ट करें, दोनों Cxcr4-सकारात्मक और नकारात्मक आबादी को व्यक्तिगत ट्यूबों में इकट्ठा करें जिसमें बर्फ पर प्रति ट्यूब एफपीएस का एक मिलीलीटर होता है।FACS-अलग, हृदय क्षेत्र विशिष्ट हृदय जनक कोशिकाओं को फिर से संस्कृति के लिए, अपकेंद्रित्र द्वारा हल कोशिकाओं को इकट्ठा करने और एसएफडी माध्यम में छर्रों को फिर से खर्च करें । फिर 0.1% जिलेटिन-लेपित, 384-अच्छी प्लेट में चार कोशिकाओं को लगभग तीन गुना 10 बीज। यदि छंटाई के बाद बढ़ी हुई कोशिका मृत्यु का उल्लेख किया जाता है, तो प्रत्येक कुएं में 10-माइक्रोमोलर रॉक अवरोधक जोड़ें।संस्कृति के दो दिनों के बाद, सहज पिटाई देखी जानी चाहिए। कार्डियोमायोसाइट्स में अंतर करने के लिए प्लेटेड सीपीसी की क्षमता का विश्लेषण करने के लिए, ट्राइप्सिन के साथ भेदभाव के दिन 12 पर कोशिकाओं को इकट्ठा करें, जैसा कि प्रदर्शन किया गया है, एकल कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने और कोशिकाओं को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में फिर से व्यापित करने के लिए। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के बाद, अपकेंद्रित्र द्वारा तय कोशिकाओं को इकट्ठा करें और अतिरिक्त सुधारक को हटाने के लिए पीबीएस में गोली धोएं।इसके बाद, पीबीएस में 10% एफबीएस में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, और माउस एंटी-ट्रोपोनिन टी एंटीबॉडी के साथ सेल नमूने के आधे हिस्से को कम करें और नमूने के अन्य आधे हिस्से को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के बाद, ताजा पीबीएस में कोशिकाओं को दो बार धोएं और 10% एफबीएस प्लस पीबीएस में नमूनों को एक उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ पूरक करें। कमरे के तापमान पर एक और 30 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को प्रति धोने ताजा PBS में दो बार धोने और एक प्रवाह साइटोमीटर पर विश्लेषण के लिए प्रति ट्यूब PBS के २०० माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च ।लगभग 132 घंटों के भेदभाव के बाद, टीबीएक्स1-आरएफपी और एचसीएन 4-जीएफपी कार्डियक प्रोजेनिटर कोशिकाओं का फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया जा सकता है। आम तौर पर, जीएफपी और आरएफपी कोशिकाएं दोनों लगभग एक ही समय के आसपास दिखाई देती हैं, और जनक कोशिकाओं की दो आबादी निकटता में और आमतौर पर पूरक पैटर्न में विस्तार करती रहती है। एक्टिविन ए और बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन फोर की सांद्रता को समायोजित करने से पहले बनाम दूसरे हृदय क्षेत्र कार्डियक प्रोजेनिटर कोशिकाओं के प्रतिशत में बदलाव आएगा।इसी तरह, एक आरएफपी रिपोर्टर माउस भ्रूणस्टेम सेल लाइन का उपयोग करना, भेदभाव के १३२ घंटे के बाद, RFP सकारात्मक हृदय जनक कोशिकाओं दिखाई देते हैं । Cxcr4, RFP-positive, Cxcr4-सकारात्मक, और RFP-सकारात्मक, Cxcr4-नकारात्मक कोशिकाओं के लिए इम्यूनोस्टेटिंग के बाद अलग किया जा सकता है। भेदभाव के दिन 12 में कार्डियक ट्रोपोनिन टी के लिए इम्यूनोस्टेटिंग इस बात की पुष्टि करता है कि पहले हृदय क्षेत्र की कोशिकाएं मुख्य रूप से मायोसाइट्स में अंतर करती हैं।इसी तरह आरएफपी-पॉजिटिव, सीएक्ससीआर4-निगेटिव कार्डियक प्रोजेनिटर सेल्स से प्राप्त कोशिकाएं सीएक्ससीआर4 सिंगल पॉजिटिव कार्डियक प्रोजेनिटर सेल्स की तुलना में काफी ज्यादा प्रतिशत पर कार्डियोमायोसाइट्स को जन्म देती हैं । कभी-कभी, माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाएं कुशलता से अंतर करने में विफल होती हैं और हृदय क्षेत्र-विशिष्ट हृदय जनक कोशिकाओं की बहुत कम संख्या बनाती हैं। साइटोकिन्स के अलावा और कोशिकाओं की संख्या का समय, एकाग्रता और स्थिरता कक्ष-विशिष्ट कार्डियक प्रोजेनिटर कोशिकाओं की एक सफल पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है।इस प्रक्रिया के बाद, जांचकर्ता अपने विनिर्देश और कार्य में आगे की जानकारी प्राप्त करने के लिए कार्डियक प्रोजेनिटर कोशिकाओं की विभिन्न आबादी के शारीरिक गुणों का विश्लेषण कर सकते हैं।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से कार्डिएक पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की व्युत्पत्ति

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Myh6-प्रमोटर-चुनाव के साथ संयोजन में ते सेल प्रोग्रामिंग पर आधारित Murine कार्डियक पेसमेकर सेल समुच्चय का सृजन

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

अमर multipotent Otic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में भेदभाव की शुरुआत

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

इन विट्रो कॉलोनी assays में त्रिकोणीय शक्तिशाली पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं निस्र्पक के लिए एडल्ट Murine अग्न्याशय से पृथक

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

मैरो-व्युत्पन्न प्रोजेक्टर सेल का हाइपोसिक प्रीकंडिशनिंग परिपक्व श्वन कोशिकाओं की उत्पत्ति के लिए एक स्रोत के रूप में

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

मात्रात्मक पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस माउस भ्रूण में कार्डियक जनक आबादी का विश्लेषण

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

एक इन विट्रो परख के विकास के लिए Quantitate टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) Zebrafish भ्रूण के विकास में

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

हृदय Progenitors और वेंट्रिकुलर की तरह पहले दिल क्षेत्र की पीढ़ी-मानव Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से Cardiomyocytes की तरह

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

कम सीरम शर्तों के तहत कार्डियक जनक कोशिकाओं में Endothelial विभेद की प्रेरण

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल से Somite डेरिवेटिव के विट्रो पीढ़ी में

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...