Name: in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

E. T. è stato supportato da The Magic That Matters e AHA. C. K. è stato supportato da sovvenzioni da NICHD/NIH (R01HD086026), AHA e MSCRF.

NOT:</</c0> Nella generazione in vitro di cellule progenitrici cardiache del campo cardiaco specifiche del campo cardiaco (Figura 1).
1. Manutenzione degli ESC del mouse
<ol><li>Coltivare mESC (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP, mESCIsl1-RFP)25 su 0,1% (w/v) gelatina rivestita t25 flaconi in 2i media (870 mL di glascow minimo mezzo essenziale (GMEM), 100 mL di siero bovino fetale (...

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li><li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+cardiomyocyte.">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li><li>Birket, M. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+cardiovascular+progenitors--a+developmental+perspective.">Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective.</a> Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient.">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Atrial+and+Ventricular+Cardiomyocytes+Develop+from+Distinct+Mesoderm+Populations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Galdos, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Regeneration:+Lessons+From+Development.">Cardiac Regeneration: Lessons From Development.</a> Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).</li><li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lineage+restriction+in+temporally+distinct+populations+of+Mesp1+progenitors+during+mammalian+heart+development.">Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development.</a> Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+networks+in+heart+development+and+regeneration.">Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).</li><li>Bruneau, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber-specific+cardiac+expression+of+Tbx5+and+heart+defects+in+Holt-Oram+syndrome.">Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.</a> Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+gene+regulation+in+the+second+heart+field+by+Tbx1,+Nkx2-5,+and+Islet1+reveals+a+genetic+switch+for+down-regulation+in+the+myocardium.">Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).</li><li>Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fate+map+of+Tbx1+expressing+cells+reveals+heterogeneity+in+the+second+cardiac+field.">A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field.</a> Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+Distinct+Six2-Positive+Second+Heart+Field+Progenitors+Regulate+Mammalian+Heart+Development+and+Disease.">Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease.</a> Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+neonatal+rat+system+as+a+bioincubator+to+generate+adult-like+mature+cardiomyocytes+from+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells.">Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).</li><li>Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+heart+disease:+entering+a+new+era+of+human+genetics.">Congenital heart disease: entering a new era of human genetics.</a> Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome.">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAND1+loss-of-function+mutation+contributes+to+congenital+double+outlet+right+ventricle.">HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells.">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, 02164 (2014).</li><li>Morita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall1+transiently+marks+undifferentiated+heart+precursors+and+regulates+their+fate.">Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326 (5951), 426-429 (2009).</li></ol>

Nel nostro protocollo, descriviamo una metodologia per generare sferoidi cardiaci e CPC isolati specifici sul campo del cuore. Questi possono essere utilizzati per studiare i meccanismi di specifica CPC e le loro proprietà, così come per la modellazione della malattia della camera cardiaca specifica. Un lavoro pubblicato in precedenza ha utilizzato una linea mESC con due reporter fluorescenti (Mef2c/Nkx2.5) per studiare cardiogenesi in vitro, tuttavia, entrambi questi marcatori sono espressi al giorno embrionale 9,5-10...

L'uso di cellule staminali pluripotenti (PSC) ha rivoluzionato il campo della rigenerazione cardiaca e della medicina personalizzata con miociti specifici per il paziente per la modellazione della malattia e le terapie farmacologiche1,2,3, 4.Più recentemente, sono stati sviluppati i protocolli in vitro per la generazione di cardiomiociti atriale vs ventricolare e di un pacemaker derivato da PSC5,6. Tuttavia, se la cardiogenesi può essere ricreata in vitro per studiare lo sviluppo cardiaco e successivamente generare cellule cardiache ventricolare specifiche della camera non è ancora chiaro.
Durante lo sviluppo embrionale precoce, le cellule mesodermiche sotto l'influenza di morfogeni secreti come BMP4, Wnts e Activin A formano la striscia primitiva7. Le cellule mesodermiche cardiache segnate dall'espressione di Mesp1 migrano anteriormente e ultimamente per formare la mezzaluna cardiaca e poi il tubo cardiaco primitivo7,8. Questo gruppo migratorio di cellule comprende due distinte popolazioni di cellule progenitrici cardiache (CPC), vale a dire il primo e il secondo campo cardiaco (FHF e SHF)9,10. Le cellule del SHF sono altamente proliferanti e migratorie e sono principalmente responsabili dell'allungamento e del looping del tubo cardiaco. Inoltre, le cellule SHF si differenziano per cardiomiociti, fibroblasti, muscoli lisci e cellule endoteliali mentre entrano nel tubo cardiaco performare il ventricolo destro, il tratto di deflusso ventricolare destro e gran parte di entrambi atri atri,10. Al contrario, le cellule FHF sono meno proliferanti e migratorie e si differenziano principalmente per i cardiomiociti in quanto danno origine al ventricolo sinistro e una parte più piccola degli atri11. Inoltre, i progenitori SHF sono contrassegnati dall'espressione di Tbx1, FGF8, FGF10 e Six2 mentre le cellule FHF esprimono Hcn4 e Tbx511,12,13,14,15.
I PSC possono differenziarsi a tutti e tre glistrati germinali e successivamente a qualsiasi tipo di cellula nel corpo 4,16. Pertanto, offrono un enorme potenziale per comprendere lo sviluppo del cuore e per modellare difetti specifici dello sviluppo con conseguente malattia cardiaca congenita, la causa più frequente di difetti alla nascita17. Un grande sottogruppo di malattie cardiache congenite include anomalie cardiache specifiche della camera18,19. Tuttavia, non è ancora chiaro se questi provengano dallo sviluppo anomalo del campo cardiaco. Inoltre, data l'incapacità dei cardiomiociti di proliferare dopo la nascita, ci sono stati ampi sforzi per creare tessuto cardiaco per la rigenerazione cardiaca1,7,20. Considerando le differenze fisiologiche e morfologiche tra le camere cardiache, la generazione di tessuto cardiaco specifico della camera utilizzando i PSC è di notevole importanza. Mentre i recenti progressi nella cardiologia dello sviluppo hanno portato a una solida generazione di cellule cardiache da PSC, non è ancora chiaro se i due campi cardiaci possano essere indotti nei sistemi PSC.
Per ricapitolare cardiogenesi in vitro e studiare le specifiche e le proprietà dei CPC, in precedenza abbiamo usato un sistema basato sulla differenziazione degli sferoidi cardiaci derivati da PSC21,22,23,24. Recentemente, abbiamo generato cellule staminali embrionali di topo (mESC) con gFP e reporter RFP sotto il controllo del gene FHF Hcn4 e del gene SHF Tbx1, rispettivamente (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. Gli mESC differenziati in vitro formavano sferoidi cardiaci in cui le cellule GFP e RFP sono apparse da due aree distinte di cellule mesodermiche e modellate in modo complementare. Le cellule di GFP e RFP e RFP risultanti hanno mostrato caratteristiche FHF e SHF, determinate rispettivamente dalle analisi di sequenziamento dell'RNA e clonali. È importante sottolineare che, utilizzando mESC che trasportano il reporter Isl1-RFP (mESCIsl1-RFP), abbiamo scoperto che le cellule SHF sono state contrassegnate fedelmente dalla proteina della superficie cellulare CXCR4, e questo può consentire l'isolamento delle cellule specifiche del campo cardiaco senza transgeni. Il presente protocollo descriverà la generazione e l'isolamento di CPC specifici sul campo cardiaco da mESC, che possono fungere da valido strumento per studiare le malattie cardiache specifiche della camera.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1251px;" width="1250">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.1% (w/v) Gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100X Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1X PBS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40&#956;m cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td align="right">35223</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Activin A</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>338-AC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 minus vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BMP4</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:245px;">Sony</td>
			<td style="width:344px;">SH800</td>
			<td style="width:241px;">Sony or any other fluorescence-activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell strainer 70&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge Sorvall Legend XT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">75004508</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CHIR99021</td>
			<td>Selleck chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">51030285</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Corning Ultra Low Attachment T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Countless II FL automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571, Lot #1757130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium high glucose (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ESGRO (LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EVOS FL microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glasgow&#8217;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monothioglycero (MTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MS-295-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acid solution (NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suspension culture dish 150 mm x 25mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE (Trypsin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td align="right">72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells

Le cellule staminali pluripotenti offrono un grande potenziale per comprendere lo sviluppo e la malattia del cuore e per la medicina rigenerativa. Sebbene i recenti progressi nella cardiologia dello sviluppo abbiano portato a generare cellule cardiache da cellule staminali pluripotenti, non è chiaro se i due campi cardiaci - il primo e il secondo campo cardiaco (FHF e SHF) - siano indotti nei sistemi di cellule staminali pluripotenti. Per risolvere questo problema, abbiamo generato un protocollo per la specifica in vitro e l'isolamento delle cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco. Abbiamo usato linee di cellule staminali embrionali che trasportano Hcn4-GFP e Tbx1-Cre; I giornalisti Rosa-RFP del FHF e dello SHF, rispettivamente, e l'immunostaining delle cellule vive della proteina della membrana cellulare Cxcr4, un marcatore SHF. Con questo approccio, abbiamo generato cellule progenitrici che ricapitolano le proprietà funzionali e il trascrittoma delle loro controparti in vivo. Il nostro protocollo può essere utilizzato per studiare le specifiche iniziali e la segregazione dei due campi cardiaci e per generare cellule cardiache specifiche della camera per la modellazione delle malattie cardiache. Poiché si tratta di un sistema organoide in vitro, potrebbe non fornire informazioni anatomiche precise. Tuttavia, questo sistema supera la scarsa accessibilità degli embrioni dello stadio di gasastrulation e può essere scalato per schermi ad alta velocità.

Dopo circa 132 h di differenziazione, i CPC Tbx1-RFP e Hcn4-GFP possono essere rilevati utilizzando un microscopio fluorescente (Figura 2). Generalmente, le celle GFP e RFP appaiono approssimativamente intorno allo stesso tempo. Le due popolazioni di CPC continuano ad espandersi nelle immediate vicinanze e comunemente in un modello complementare. L'adeguamento delle concentrazioni di Activin A e BMP4 modificherà le percentuali di FHF vs CPC SHF (Figura 3). La s...

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In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Lo scopo di questo metodo è quello di generare cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco del campo cardiaco in vitro al fine di studiare le specifiche delle cellule progenitrici e le proprietà funzionali, e di generare cellule cardiache specifiche della camera per la modellazione delle malattie cardiache.

Generazione in vitro di cellule progenitrici cardiache specifiche del campo del cuore del mouse

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Il nostro metodo mira a generare cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco dalle cellule staminali embrionali del topo. Questa linea di cellule staminali reporter del campo cardiaco consente lo studio ad alta produttività dei meccanismi alla base delle malattie cardiache congenite, fornendo un sistema suscettibile di manipolazione genetica e farmacologica. Ci sono diverse malattie cardiache congenite specifiche della camera.Ricapitolando la cardiogenesi in vitro, questo protocollo consente lo studio del meccanismo della malattia e lo sviluppo di future terapie rigenerative. Questo protocollo può fornire informazioni su come vengono specificate cellule progenitrici cardiache di diverse camere durante lo sviluppo cardiaco. Inizia coltivando cellule staminali embrionali di topo transgeniche in matracci T25 rivestiti di gelatina dello 0,1% in mezzo 2i.Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, sciacquare le colture con PBS e aggiungere un millilitro di tripina per pallone per dissociare la coltura in singole cellule a 37 gradi Celsius per tre minuti. Quando le cellule si sono staccate, neutralizzare la reazione con quattro millilitri 10 FBS in DMEM e contare le cellule con un metodo appropriato. Diluire le cellule a circa tre volte 10 fino alle cinque cellule per concentrazione media fresca e raccogliere le cellule per centrifugazione.Quindi riutilizzarlo in cinque millilitri di mezzo 2i fresco per la piastra su nuovi contenitori T25 rivestiti in gelatina allo 0,1%. Per la generazione di CPC dagli sferoidi cardiaci, raccogliere 2,5 per 10 a sei del campione di cellule staminali embrionali di topo transgenico staccato per centrifugazione e rimorsinare le cellule in 25 millilitri di mezzo SFD. Placcare la sospensione cellulare in una piastra sterile da 150 per 25 millimetri per l'incubazione a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 48 ore.Alla fine dell'incubazione, raccogliere gli sferoidi cardiaci in un tubo conico. Sedimentare gli sferoidi mediante centrifugazione per facilitare l'isolamento selettivo degli sferoidi ed evitare singole cellule. Resopend gli sferoidi in 25 millilitri di mezzo SFD fresco integrato con un nanogrammo per millilitro di attivina A e 1,5 nanogrammi per millilitro di proteina morfogenetica ossea quattro.Riprotere gli sferoidi sulla stessa piastra di coltura per un'incubazione 24 ore su 24 nell'incubatore di coltura cellulare. Il giorno dopo, ricorda tutti gli sferoidi cardiaci per centrifugazione. Rimospendare i corpi embrionale differenziati in 25 millilitri di mezzo SFD fresco per la placcatura in un attacco ultra-basso, pallone quadrato di 75 centimetri nell'incubatore di coltura cellulare per 48 ore.Per l'isolamento del CPC specifico del campo cardiaco utilizzando reporter fluorescenti, raccogliere i corpi embriopi per centrifugazione e dissociare le colture 3D con un millilitro di tripside a 37 gradi Celsius per tre minuti. Al termine dell'incubazione, mescolare bene con pipettazione per dissociare le cellule e neutralizzare la reazione con quattro millilitri del 10%FBS in DMEM. Passare la miscela su un colino di 70 micrometri per rimuovere eventuali corpi embrionali non dissociati e sedimentare le cellule filtrate mediante centrifugazione.Per ordinare i CPC in base alla loro espressione di reporter fluorescente, risosospendare il pellet in soluzione FACS da 500 microlitri e filtrare le celle attraverso un colino cellulare di 40 micrometri in un tubo a fondo rotondo in polistirolo da cinque millilitri sul ghiaccio. Quindi ordinare le celle per isolare le cellule che esprimono RFP e GFP tramite FACS, raccogliendo le cellule in un millilitro di FBS. Per isolare i CPC del primo rispetto al secondo campo cardiaco in base alla loro espressione Cxcr4 della proteina superficiale, rimescolare le cellule progenitrici cardiache a cellule staminali embrionali a singola topo che esprimono RFP in 300 microlitri del 10%FBS in PBS integrati con anticorpi anti-Cxcr4 coniugati con fluorescenza.Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, lavare le cellule tre volte in uno o due millilitri di PBS fresco e freddo per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, rimescolare le cellule in 500 microlitri di soluzione FACS e filtrare le celle attraverso un colino di 40 micrometri in un tubo a cinque millilitri, a fondo tondo. Quindi ordinare le cellule in base alla loro espressione Cxcr4, raccogliendo sia le popolazioni Cxcr4-positive che negative in singoli tubi contenenti un millilitro di FPS per tubo su ghiaccio.Per ricolturare le cellule progenitrici cardiache isolate dal FACS, specifiche del campo cardiaco, raccogliere le cellule ordinate per centrifugazione e rimorsire il pellet nel mezzo SFD. Quindi seminare circa tre volte 10 alle quattro cellule per pozzo in una piastra ricoperta di gelatina dello 0,1%, 384 po '. Se si nota un aumento della morte cellulare dopo lo smistamento, aggiungere un inibitore ROCK a 10 micromolare ad ogni pozzo.Dopo due giorni di cultura, si dovrebbe osservare il pestaggio spontaneo. Per analizzare la capacità dei CPC placcati di differenziarsi dai cardiomiociti, raccogliere le cellule al giorno 12 di differenziazione con tripside, come dimostrato, per isolare i singoli cardiomiociti e resospedere le cellule in paraformaldeide al 4%. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, raccogliere le cellule fisse per centrifugazione e lavare il pellet in PBS per rimuovere l'eccesso fissativo.Successivamente, resospendare le cellule in 10%FBS in PBS, e incubare metà del campione cellulare con anticorpo T anti-troponina del topo e utilizzare l'altra metà del campione come controllo negativo. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, lavare le cellule due volte in PBS fresco e rimorsi i campioni in 10%FBS più PBS integrati con un anticorpo secondario appropriato. Dopo un'altra incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente, lavare le cellule due volte in PBS fresco per lavaggio e rimescolare le cellule in 200 microlitri di PBS per tubo per l'analisi su un citometro a flusso.Dopo circa 132 ore di differenziazione, le cellule progenitrici cardiache Tbx1-RFP e Hcn4-GFP possono essere rilevate mediante microscopia a fluorescenza. Generalmente, sia le cellule GFP che RFP appaiono approssimativamente nello stesso periodo, e le due popolazioni di cellule progenitrici continuano ad espandersi in prossimità e in genere in un modello complementare. La regolazione delle concentrazioni di attivina A e proteina morfogenetica ossea quattro altererà le percentuali delle cellule progenitrici cardiache del primo rispetto al secondo campo cardiaco.Allo stesso modo, utilizzando una linea di cellule staminali embrionali di topo reporter RFP, dopo 132 ore di differenziazione, compaiono cellule progenitrici cardiache positive alla RFP. Dopo l'immunosottenzione per cellule Cxcr4, RFP-positive, Cxcr4-positive e RFP-positive, le cellule Cxcr4-negative possono essere isolate. L'immunostaining per la troponina cardiaca T al giorno 12 della differenziazione conferma che le prime cellule del campo cardiaco si differenziano principalmente in miociti.Allo stesso modo, le cellule derivate da cellule progenitrici cardiache positive rfp, Cxcr4-negative danno origine a cardiomiociti a percentuali molto più elevate rispetto alle singole cellule progenitrici cardiache positive Cxcr4. Occasionalmente, le cellule staminali embrionali del topo non riescono a differenziarsi in modo efficiente e formano un numero molto basso di cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco. La tempistica, la concentrazione e la consistenza dell'aggiunta delle citochine e il numero delle cellule sono fondamentali per una generazione riuscita di cellule progenitrici cardiache specifiche della camera.Seguendo questa procedura, gli investigatori possono analizzare le proprietà fisiologiche delle diverse popolazioni di cellule progenitrici cardiache per ottenere ulteriori informazioni sulle loro specifiche e funzioni.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Derivazione di cellule cardiache progenitrici di cellule staminali embrionali

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Generazione di Murine Cardiac pacemaker aggregati di cellule Sulla base ES-Cell-programmazione in combinazione con MYH6-Promoter-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Avvio di differenziazione in cellule multipotenti immortalizzate Otic progenitrici

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony saggi per Caratterizzazione Tri-potenti cellule progenitrici isolato dal adulti murini Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Precondizionamento ipossico delle cellule progenitori derivate dal midollo osseo come fonte per la generazione di cellule Schwann mature

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Analisi quantitativa intero-monta immunofluorescenza delle popolazioni di cellule progenitrici cardiache in embrioni di topo

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Sviluppo di un test In Vitro per quantificare progenitrici e staminali ematopoietiche cellule (HSPCs) nello sviluppo di embrioni di Zebrafish

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generazione del primo cuore campo-come progenitori cardiaci e ventricolare-come cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti umane

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Induzione di differenziazione endoteliale in cellule progenitrici cardiache in condizioni di basso del siero

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...