Name: in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

E. T. はマジック・マターズとAHAによって支えられました。C. K. は NICHD/NIH (R01HD086026)、AHA、および MSCRF からの助成金によってサポートされました。

注:心臓場特異的マウス心臓前駆細胞のインビトロ生成(図1)。
1. マウスESCのメンテナンス
<ol><li>MESC(MESCTbx1-Cre;ローザ RFP;HCN4-GFP,mESCIsl1-RFP)25上 0.1% (w/v) ゼラチンコーティング T25 フラスコを 2i 培地 (870 mL のグラスコウ最小必須必須培地 (GMEM), 100 mL の胎児ウシ血清 (FBS), 10mL のグルタマックス,...

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li><li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+cardiomyocyte.">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li><li>Birket, M. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+cardiovascular+progenitors--a+developmental+perspective.">Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective.</a> Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient.">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Atrial+and+Ventricular+Cardiomyocytes+Develop+from+Distinct+Mesoderm+Populations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Galdos, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Regeneration:+Lessons+From+Development.">Cardiac Regeneration: Lessons From Development.</a> Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).</li><li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lineage+restriction+in+temporally+distinct+populations+of+Mesp1+progenitors+during+mammalian+heart+development.">Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development.</a> Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+networks+in+heart+development+and+regeneration.">Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).</li><li>Bruneau, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber-specific+cardiac+expression+of+Tbx5+and+heart+defects+in+Holt-Oram+syndrome.">Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.</a> Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+gene+regulation+in+the+second+heart+field+by+Tbx1,+Nkx2-5,+and+Islet1+reveals+a+genetic+switch+for+down-regulation+in+the+myocardium.">Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).</li><li>Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fate+map+of+Tbx1+expressing+cells+reveals+heterogeneity+in+the+second+cardiac+field.">A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field.</a> Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+Distinct+Six2-Positive+Second+Heart+Field+Progenitors+Regulate+Mammalian+Heart+Development+and+Disease.">Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease.</a> Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+neonatal+rat+system+as+a+bioincubator+to+generate+adult-like+mature+cardiomyocytes+from+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells.">Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).</li><li>Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+heart+disease:+entering+a+new+era+of+human+genetics.">Congenital heart disease: entering a new era of human genetics.</a> Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome.">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAND1+loss-of-function+mutation+contributes+to+congenital+double+outlet+right+ventricle.">HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells.">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, 02164 (2014).</li><li>Morita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall1+transiently+marks+undifferentiated+heart+precursors+and+regulates+their+fate.">Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326 (5951), 426-429 (2009).</li></ol>

我々のプロトコルでは、心臓スフェロイドおよび単離された心臓場特異的CPCを生成する方法論について説明する。これらは、CPC仕様とその特性のメカニズムを研究するだけでなく、心臓室特異的疾患モデリングのために使用することができます。以前に発表された1つの研究は、2つの蛍光レポーター(Mef2c/Nkx2.5)を用いてmESCラインを用いてインビトロでの心生形成を研究したが、これらのマー?...

多能性幹細胞(PSC)の使用は、疾患モデリングおよび薬物療法のための患者特異的筋細胞を用いた心臓再生および個別化医療の分野に革命を起こした1,2,3,4.さらに最近では、心房対心室およびペースメーカー様PSC由来心筋細胞の生成のためのインビトロプロトコルが5、6に開発されている。しかし、心臓の発達を研究し、その後心室特異的な心臓細胞を生成するために、心形成をインビトロで再現できるかどうかは、まだ不明である。
初期胚発生の間、BMP4、WntsおよびアクティビンAなどの分泌された形態素の影響下にある中皮細胞は原始的な筋7を形成する。Mesp1の発現によってマークされた心臓中皮細胞は、心三日月を形成し、次いで原始的な心臓管7、8を形成するために前部および後者に移行する。この細胞の移動群は、心臓前駆細胞(CPC)の2つの非常に異なる集団、すなわち第1および第2の心臓場(FHFおよびSHF)9、10を含む。SHFからの細胞は非常に増殖性と移動性であり、主に心臓管の伸びとループを担当しています。さらに、SHF細胞は心筋細胞、線維芽細胞、平滑筋および内皮細胞に分化し、心臓管に入り、右心室、右心室流出路および両方の心房7、10の大部分を形成する。対照的に、FHF細胞は、左心室および心房11の小さな部分を生み出すので、主に心筋細胞に分化する増殖性および移動性が低い。さらに、SHF前駆体は、THF細胞がHcn4およびTbx511、12、13、14、15を発現する間、Tbx1、FGF8、FGF10およびSix2の発現によって特徴付けされる。
PSCは、すべての3つの胚芽層に分化し、その後、体内の任意の細胞タイプ4、16に分化することができます。したがって、それらは、心臓の発達を理解し、先天性心疾患をもたらす特定の発達欠陥をモデル化するための大きな可能性を提供し、出生時欠損の最も頻繁な原因17。先天性心疾患の大きなサブグループは、チャンバー特異的な心臓異常18,19を含む。しかし、これらは異常な心臓分野の発達に起因するかどうかは依然として不明である。さらに、出生後に増殖する心筋細胞の能力を考えると、心臓再生1、7、20のための心臓組織を作成するための広範な努力があった。心臓室間の生理的および形態学的な違いを考慮すると、PSCを用いたチャンバー特異的心臓組織の生成は非常に重要である。発達心理学の最近の進歩はPSCからの心臓細胞の堅牢な生成につながったが、2つの心臓界がPSCシステムで誘導できるかどうかはまだ不明である。
体外での心生発生を要約し、CPCの仕様と特性を研究するために、以前にPSC由来心臓スフェロイド21、22、23、24の分化に基づくシステムを使用した。最近では、FHF遺伝子Hcn4とSHF遺伝子Tbx1の制御下でGFPおよびRFPレポーターを用いてマウス胚性幹細胞(MESC)をそれぞれ生成した(mESCTbx1-Cre;ローザ RFP;HCN4-GFP) 25.インビトロ分化MESCは、GFP+およびRFP+細胞が中皮細胞の2つの異なる領域から出現し、相補的な方法でパターン化された心臓スフェロイドを形成した。得られたGFP+およびRFP+細胞は、それぞれRNAシーケンシングおよびクローン解析によって決定されたFHFおよびSHF特性を示した。重要なことに、Isl1-RFPレポーター(mESCIsl1-RFP)を搭載したMESCを用いて、SHF細胞が細胞表面タンパク質CXCR4によって忠実にマークされ、トランスジーンのない心臓場特異的細胞の単離を可能にすることが分かりました。本プロトコルは、室内特異的な心臓病を研究するための貴重なツールとして役立つ可能性のあるMESCからの心臓場特異的CPCの生成と単離について説明する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1251px;" width="1250">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.1% (w/v) Gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100X Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1X PBS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40&#956;m cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td align="right">35223</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Activin A</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>338-AC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 minus vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BMP4</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:245px;">Sony</td>
			<td style="width:344px;">SH800</td>
			<td style="width:241px;">Sony or any other fluorescence-activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell strainer 70&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge Sorvall Legend XT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">75004508</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CHIR99021</td>
			<td>Selleck chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">51030285</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Corning Ultra Low Attachment T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Countless II FL automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571, Lot #1757130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium high glucose (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ESGRO (LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EVOS FL microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glasgow&#8217;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monothioglycero (MTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MS-295-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acid solution (NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suspension culture dish 150 mm x 25mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE (Trypsin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td align="right">72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells

多能性幹細胞は、心臓の発達や病気を理解し、再生医療に大きな可能性を提供します。近年の発達心理学の進歩は多能性幹細胞から心臓細胞を生成することにつながっているが、第1および第2の心臓場(FHFおよびSHF)の2つの心臓界が多能性幹細胞系に誘導されているかどうかは不明である。この問題に対処するために、心臓界特異的心臓前駆細胞のインビトロ仕様および単離のためのプロトコルを生成した。Hcn4-GFPとTbx1-Creを運ぶ胚性幹細胞ラインを使用しました。FHFとSHFのRosa-RFPレポーターは、それぞれ、細胞膜タンパク質Cxcr4の生細胞免疫染色、SHFマーカーである。このアプローチにより、生体内の機能特性とトランスクリプトームを要約する前駆細胞を生成した。我々のプロトコルは、2つの心臓分野の早期の仕様と分離を研究し、心臓病のモデリングのためのチャンバー特異的心臓細胞を生成するために利用することができる。これはインビトロオルガノイド系であるため、正確な解剖学的情報を提供しない場合があります。しかし、このシステムは、胃の段階胚の貧弱なアクセシビリティを克服し、ハイスループットスクリーンのためにアップスケールすることができます。

約132時間の分化後、Tbx1-RFPおよびHcn4-GFP CPCを蛍光顕微鏡で検出することができる(図2)。一般に、GFP セルと RFP セルはほぼ同じ時刻に表示されます。CPC の 2 つの母集団は、近接して、一般的に相補的なパターンで拡大し続けています。アクティビン A と BMP4 の濃度を調整すると、FHF 対 SHF CPC のパーセンテージが変化します (図3)。インビトロでのCPC?...

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In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

この方法の目的は、前駆細胞の仕様および機能性を研究するためにインビトロで心臓界特異的心臓前駆細胞を生成し、心臓病モデリングのためのチャンバー特異的心臓細胞を生成することである。

マウス心臓分野特異的心臓前駆細胞のインビトロ生成

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

我々の方法は、マウス胚性幹細胞から心臓フィールド特異的心臓前駆細胞を生成することを目的としている。この心臓フィールドレポーター幹細胞ラインは、先天性心疾患の根底にあるメカニズムのハイスループット研究を可能にし、遺伝的および薬理学的操作に適したシステムを提供する。いくつかのチャンバー固有の先天性心疾患があります。このプロトコルは、インビトロでの心新生を再現することにより、疾患メカニズムの研究と将来の再生療法の開発を可能にする。このプロトコルは、異なるチャンバーの心臓前駆細胞が心臓の発達中にどのように指定されるかについての洞察を提供することができる。2i培地で0.1%ゼラチンコーティングT25フラスコでトランスジェニックマウス胚性幹細胞を増殖させることから始めます。細胞が70〜80%合流に達したら、PBSで培養液をすすい、フラスコあたり1ミリリットルのトリプシンを加えて、37°Cで単一細胞に培養を解約する。細胞が剥離したら、DMEMで4ミリリットル10FBSで反応を中和し、適切な方法で細胞を数える。新鮮な培地濃度ごとに5個の細胞に約3倍10倍に希釈し、遠心分離により細胞を回収する。その後、新しい0.1%ゼラチンコーティングT25フラスコに再めっきするために新鮮な2i培地の5ミリリットルでペレットを再懸濁します。心臓スフェロイドからのCPC生成の場合、遠心分離によって切り離されたトランスジェニックマウス胚性幹細胞サンプルの6個に2.5回10を収集し、25ミリリットルのSFD培地で細胞を再懸濁する。セル懸濁液を150~25ミリメートルの無菌プレートに1枚に入れ、摂氏37度でインキュベーションし、5%の二酸化炭素を48時間加熱します。インキュベーションの終わりに、心臓の回転楕円体を円錐形の管に集める。遠心分離によってスフェロイドを沈下し、スフェロイドの選択的な単離を促進し、単一細胞を回避する。スピフェロイドを、アクチビンAのミリリットル当たり1ナノグラム、骨形態形成タンパク質4の1ミリリットル当たり1.5ナノグラムを添加した新鮮なSFD培地の25ミリリットルで再懸濁する。スフェロイドを同じ培養プレートに再プレートし、細胞培養インキュベーターで24時間インキュベートします。翌日、心筋分離によってすべての心臓回転楕円体を思い出す。分化した胚体を、超低い付着体でめっきするための新鮮なSFD培地25ミリリットルで再懸濁し、細胞培養インキュベーター内の75センチメートル平方フラスコを48時間再中断する。蛍光レポーターを用いた心臓フィールド特異的CPCの分離については、遠心分離により胚体を採取し、37°Cでトリプシンを1ミリリットルで3D培養物に3分間解離する。インキュベーションの終わりに、ピペット処理を行って細胞を解約し、DMEMで10%FBSの4ミリリットルで反応を中和します。70マイクロメートルのストレーナーの上に混合物を渡して、解心しない胚体を除去し、遠心分離によって濾過された細胞を沈下する。蛍光レポーター発現でCPCを選別するには、ペレットを500マイクロリットルFACS溶液で再懸濁し、40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して氷上の5ミリリットルポリスチレン丸底管に細胞を濾過します。次に、細胞を並べ替えてFACSによってRFPおよびGFP発現細胞を単離し、1ミリリットルのFBSで細胞を収集する。表面タンパク質Cxcr4発現に基づいて第1の心臓界CPCを分離するために、蛍光共役抗Cxcr4抗体を補ったPBS中の100マイクロリットルの10%FBSにおける単一マウス胚性幹細胞RFP発現心臓前駆細胞を再懸濁する。室温で5分後、1回の新鮮で冷たいPBSの1〜2ミリリットルで細胞を3回洗浄します。最後の洗浄後、FACS溶液500マイクロリットルで細胞を再懸濁し、40マイクロメートルのストレーナーを通して5ミリリットルの丸底チューブに細胞をフィルター処理します。次に、Cxcr4発現で細胞をソートし、Cxcr4陽性集団と負母集団の両方を、氷上のチューブあたり1ミリリットルのFPSを含む個々のチューブに収集します。FACS単離された心臓フィールド特異的心臓前駆細胞を再培養するには、遠心分離によって選別された細胞を収集し、SFD培地中のペレットを再懸濁する。その後、0.1%ゼラチンコーティングされた384ウェルプレートに4つの細胞あたり約30倍を播種します。細胞死の増加が選別後に注目される場合は、各ウェルに10マイクロモルROCK阻害剤を加える。2日間の培養の後、自発的な殴打を観察すべきである。メッキされたCPCが心筋細胞に分化する能力を分析するために、トリプシンによる分化の12日目に細胞を収集し、示されているように、単一の心筋細胞を単一の心筋細胞を単離し、4%パラホルムアルデヒドで細胞を再懸濁させる。室温で30分後、遠心分離により固定細胞を採取し、PBSでペレットを洗浄して過剰な固定剤を除去する。次に、PBSで細胞を10%FBSで再懸濁し、マウス抗トロポニンT抗体で細胞サンプルの半分をインキュベートし、残りの半分のサンプルを陰性対照として使用する。室温で30分後、新鮮なPBSで細胞を2回洗浄し、適切な二次抗体を加えた10%FBSプラスPBSでサンプルを再懸濁します。室温でさらに30分間のインキュベーションの後、洗浄ごとに新鮮なPBSで細胞を2回洗浄し、フローサイトメーターで分析するためにチューブあたり200マイクロリットルのPBSで細胞を再懸濁します。約132時間分化した後、Tbx1-RFPおよびHcn4-GFP心臓前駆細胞は蛍光顕微鏡で検出することができる。一般的に、GFP細胞とRFP細胞は、ほぼ同時期に出現し、前駆細胞の2つの集団は、近接して、典型的には相補的なパターンで拡大し続ける。アクチビンAと骨形態形成タンパク質4の濃度を調整すると、第1心臓フィールド心臓前駆細胞の割合が変化する。同様に、RFPレポーターマウス胚性幹細胞株を用いて、132時間分化後、RFP陽性心臓前駆細胞が現れる。Cxcr4の免疫染色後、RFP陽性、Cxcr4陽性、およびRFP陽性、Cxcr4陰性細胞を単離することができます。分化の12日目の心臓トロポニンTの免疫染色は、最初の心臓フィールド細胞が主に筋細胞に分化することを確認する。同様に、RFP陽性、Cxcr4陰性心前駆細胞に由来する細胞は、Cxcr4単一陽性心臓前駆細胞と比較してはるかに高い割合で心筋細胞を生じさせる。時折、マウス胚性幹細胞は効率的に分化できず、心臓フィールド特異的な心臓前駆細胞の数が非常に少ない。サイトカインの添加のタイミング、濃度、および一貫性と細胞の数は、チャンバー特異的心臓前駆細胞の生成を成功させるために重要です。この手順に従って、研究者は心臓前駆細胞の異なる集団の生理学的特性を分析し、その仕様および機能に関するさらなる洞察を得ることができる。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

MYH6プロモーター - 選択と組み合わせたES細胞のプログラミングに基づいて、マウス心臓ペースメーカー細胞凝集体の生成

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

不死化多能耳の前駆細胞に分化を開始

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

成熟シュワン細胞の発生源としての骨髄由来前駆細胞の低酸素プレコンディショニング

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ初期胚細胞 (HSPCs) を造血幹・前駆細胞の量的にIn Vitroアッセイの開発

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞およびひと多能性幹細胞からのような心室心筋細胞の生成

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

低血清条件下で心臓前駆細胞の内皮への分化の誘導

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...