Name: in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

E. T. 중요한 매직과 AHA에 의해 지원되었다. C. K.는 NICHD/NIH(R01HD086026), AHA 및 MSCRF의 보조금으로 지원되었습니다.

참고: 심장 필드 특정 마우스 심장 전구 세포의 시험관내 생성 (그림 1).
1. 마우스 ESC의 유지 보수
<ol><li>mESCs 성장 (mESCsTbx1-Cre; 로사-RFP; HCN4-GFP,mESCIsl1-RFP)25 에 0.1% (w/v) 젤라틴 코팅 T25 플라스크 2i 매체 (870 mL의 글래스코우 최소 필수 배지 (GMEM), 태아 소 혈청 (FBS), 100 mL의 글루타맥스, 10 mL의 비 ?...

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li><li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+cardiomyocyte.">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li><li>Birket, M. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+cardiovascular+progenitors--a+developmental+perspective.">Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective.</a> Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient.">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Atrial+and+Ventricular+Cardiomyocytes+Develop+from+Distinct+Mesoderm+Populations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Galdos, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Regeneration:+Lessons+From+Development.">Cardiac Regeneration: Lessons From Development.</a> Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).</li><li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lineage+restriction+in+temporally+distinct+populations+of+Mesp1+progenitors+during+mammalian+heart+development.">Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development.</a> Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+networks+in+heart+development+and+regeneration.">Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).</li><li>Bruneau, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber-specific+cardiac+expression+of+Tbx5+and+heart+defects+in+Holt-Oram+syndrome.">Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.</a> Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+gene+regulation+in+the+second+heart+field+by+Tbx1,+Nkx2-5,+and+Islet1+reveals+a+genetic+switch+for+down-regulation+in+the+myocardium.">Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).</li><li>Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fate+map+of+Tbx1+expressing+cells+reveals+heterogeneity+in+the+second+cardiac+field.">A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field.</a> Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+Distinct+Six2-Positive+Second+Heart+Field+Progenitors+Regulate+Mammalian+Heart+Development+and+Disease.">Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease.</a> Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+neonatal+rat+system+as+a+bioincubator+to+generate+adult-like+mature+cardiomyocytes+from+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells.">Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).</li><li>Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+heart+disease:+entering+a+new+era+of+human+genetics.">Congenital heart disease: entering a new era of human genetics.</a> Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome.">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAND1+loss-of-function+mutation+contributes+to+congenital+double+outlet+right+ventricle.">HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells.">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, 02164 (2014).</li><li>Morita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall1+transiently+marks+undifferentiated+heart+precursors+and+regulates+their+fate.">Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326 (5951), 426-429 (2009).</li></ol>

우리의 프로토콜에서는, 우리는 심장 스페로이드 및 고립된 심혼 필드 특정 CPC를 생성하는 방법론을 기술합니다. 이들은 CPC 명세서및 그들의 속성의 기계장치, 뿐만 아니라 심장 약실 특정 질병 모델링을 위해 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이전에 발표된 한 연구는 체외에서 심장 발생을 연구하기 위해 2개의 형광 기기자(Mef2c/Nkx2.5)와 mESC 라인을 사용했지만, 두 마커 모두 심근세포가<sup cl...

만능 줄기 세포 (PSC)의 사용은 질병 모델링 및 약물 치료를위한 환자 별 근세포와 심장 재생 및 개인화된 의학의 분야에 혁명을 일으켰습니다 1,2,3, 4.최근에는 심방 대 심실 생성을 위한 시험관내 프로토콜뿐만 아니라 심박동기 유사 PSC 유래 심근세포가 5,6으로개발되었다. 그러나, 심장 발생이 심실 발달을 연구하고 이어서 심실 챔버 특이적 심장 세포를 생성하기 위해 시험관 내에서 재현될 수 있는지 여부는 여전히 불분명하다.
초기 배아 발달 동안, BMP4, Wnts 및 Activin A와 같은 분비 된 모르포겐의 영향으로중피 세포는 원시 적 줄무늬 7을 형성한다. Mesp1의 발현에 의해 표시된 심장 중피 세포는 전방 및 후후반에 이동하여 심장 초승달을 형성한 다음 원시 심장 튜브 7,8을형성합니다. 세포의 이 철새 군은 심장 전구 세포 (CPC) 즉 제 1 및 제 2 심장 필드 (FHF및 SHF) 9,10의두 개의 매우 뚜렷한 집단을 포함한다. SHF에서 세포는 높게 증식하고 철새이고 심장 관의 신장 그리고 반복에 1 차적으로 책임 있습니다. 또한, SHF 세포는 심근세포, 섬유아세포, 평활근 및 내피 세포가 심장관에 진입하여 우심실, 우심실 유출관 및 아트리아7,10의큰 부분을 형성함에 따라 분화한다. 대조적으로, FHF 세포는 덜 증식하고 철새이며 주로 심근세포로 분화하여 좌심실과 심방의 작은 부분을 발생시며11. 더욱이, SHF 전구체는 Tbx1, FGF8, FGF10 및 식스2의 발현에 의해 표시되고 FHF 세포는 Hcn4 및 Tbx511,12,13,14,15를발현한다.
PSCs는 3개의 세균 층 모두를 분화하고 그후에 바디에 있는 어떤 세포 모형든지4,16로분화할 수 있습니다. 그러므로, 그(것)들은 선천적인 심장병, 출생 결함의 가장 빈번한 원인17의결과로 심장 발달을 이해하고 특정 발달 결함을 모델링을 위한 엄청난 잠재력을 제안합니다. 선천성 심장 질환의 큰 하위 그룹은 챔버 특정 심장 이상을 포함18,19. 그러나, 그것은 여전히 불분명 여부 이러한 비정상적인 심장 필드 개발에서 유래. 또한, 출생 후 증식하는 심근세포의 무능력을 감안할 때, 심장 재생을 위한 심장조직을 만들기 위한 광범위한 노력이 있었다 1,7,20. 심장 챔버 사이의 생리적 및 형태학적 차이를 고려할 때, PSC를 사용하는 챔버 특이적 심장 조직의 생성은 매우 중요하다. 발달 심장학에 있는 최근 어드밴스는 PSC에서 심장 세포의 강력한 생성으로 이끌어 냈습니다 그러나, 2개의 심혼 필드가 PSC 시스템에서 유도될 수 있는지 아직도 불분명합니다.
시험관내 심장 발생을 재량화하고 CPC의 사양 및 특성을 연구하기 위해 이전에는 PSC 유래 심장 스페로이드21,22,23,24를차별화하는 시스템을 사용했습니다. 최근, 우리는 FHF 유전자 Hcn4 및 SHF 유전자 Tbx1의 통제 하에 GFP 및 RFP 리포터를 가진 마우스 배아 줄기 세포(mESCs)를 각각 생성하였다(mESCsTbx1-Cre; 로사-RFP; HCN4-GFP) 25. 시험관 내 분화 mESCs는 GFP+ 및 RFP + 세포가 중피 세포의 두 개의 별개의 영역에서 나타나고 상보적인 방식으로 패턴화 된 심장 스페로이드를 형성했습니다. 생성된 GFP+ 및 RFP+ 세포는 각각 RNA 시퀀싱 및 클론 분석에 의해 결정된 FHF 및 SHF 특성을 나타내었다. 중요한 것은, Isl1-RFP 리포터 (mESCIsl1-RFP)를운반하는 mESCs를 사용하여, 우리는 SHF 세포가 세포 표면 단백질 CXCR4에 의해 충실하게 표시되었다는 것을 것을을 발견하고, 이것은 형질 전환 없이 심혼 필드 특정 세포의 격리를 가능하게 할 수 있습니다. 본 프로토콜은 mcCS에서 심장 필드 특정 CPC의 생성 그리고 격리를 기술할 것입니다, 이는 챔버 특정 심장 병을 공부하기위한 귀중한 도구로 봉사 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1251px;" width="1250">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.1% (w/v) Gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100X Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1X PBS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40&#956;m cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td align="right">35223</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Activin A</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>338-AC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 minus vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BMP4</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:245px;">Sony</td>
			<td style="width:344px;">SH800</td>
			<td style="width:241px;">Sony or any other fluorescence-activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell strainer 70&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge Sorvall Legend XT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">75004508</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CHIR99021</td>
			<td>Selleck chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">51030285</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Corning Ultra Low Attachment T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Countless II FL automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571, Lot #1757130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium high glucose (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ESGRO (LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EVOS FL microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glasgow&#8217;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monothioglycero (MTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MS-295-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acid solution (NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suspension culture dish 150 mm x 25mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE (Trypsin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
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			<td align="right">72304</td>
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in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells

만능 줄기 세포는 심장 발달과 질병을 이해하고 재생 의학에 대한 큰 잠재력을 제공합니다. 발달 심장학에 있는 최근 어드밴스는 다능성 줄기 세포에서 심장 세포를 생성하는 지도하는 동안, 두 개의 심장 필드 - 첫번째와 두 번째 심장 필드 (FHF 및 SHF) - 만능 줄기 세포 시스템에서 유도되는 경우에 불분명합니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 시험관 내 사양 및 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 격리를위한 프로토콜을 생성했다. 우리는 Hcn4-GFP 및 Tbx1-Cre를 운반하는 배아 줄기 세포 라인을 사용; FHF 및 SHF의 로사-RFP 리포터는 각각 세포막 단백질 Cxcr4의 세포 면역염색, SHF 마커의 살아있는 세포 면역염색. 이 접근법으로, 우리는 생체 내 대응물의 기능적 특성 및 전사체를 재량화시키는 전구 세포를 생성하였다. 우리의 프로토콜은 두 심장 필드의 초기 명세 및 분리를 연구하고 심장 질환 모델링을위한 챔버 특정 심장 세포를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 시험관 내 오르가노이드 시스템이기 때문에 정확한 해부학 정보를 제공하지 않을 수 있습니다. 그러나, 이 시스템은 가위 단계 배아의 가난한 접근성을 극복하고 높은 처리량 스크린을 위해 업스케일링될 수 있습니다.

분화의 대략 132 시간 후에, Tbx1-RFP 및 Hcn4-GFP CPC는 형광 현미경을 사용하여 검출될 수 있습니다(그림2). 일반적으로, GFP 및 RFP 세포는 대략 같은 시간에 나타납니다. CPC의 두 인구는 근접하고 일반적으로 상호 보완적인 패턴으로 계속 확장됩니다. 액티빈 A 및 BMP4의 농도를 조정하면 FHF 대 SHF CPC의 백분율이 변경됩니다(그림 3). 시험관내 CPC 사양은 주로 BMP4...

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In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

이 방법의 목적은 전구 세포 사양 및 기능적 특성을 연구하기 위해 시험관 내에서 심장 필드 특이적 심장 전구 세포를 생성하고 심장 질환 모델링을 위한 챔버 특정 심장 세포를 생성하는 것이다.

마우스 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 시험관 내 생성

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

우리의 방법은 마우스 배아 줄기 세포에서 심장 필드 특정 심장 전구 세포를 생성하는 것을 목표로합니다. 이 심장 필드 기자 줄기 세포주는 선천성 심장 질환의 기본 메커니즘의 높은 처리량 연구를 허용, 유전 및 약리학적 조작에 복막하는 시스템을 제공. 몇몇 챔버 특정 선천성 심장 병이 있습니다.시험관 내 심장 발생을 재구성함으로써, 이 프로토콜은 질병 기계장치 연구와 미래의 재생 치료의 개발을 허용합니다. 이 프로토콜은 심장 발달 도중 다른 챔버의 심장 전구 세포가 어떻게 지정되는지에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 2i 배지에서 0.1%젤라틴 코팅 T25 플라스크에서 형질전환 마우스 배아 줄기 세포를 성장시킴으로써 시작한다.세포가 70~80%에 도달하면 PBS로 배양을 헹구고 플라스크당 트립신 1밀리리터를 추가하여 3분간 섭씨 37도에서 단일 세포로 배양을 전파합니다. 세포가 분리되면 DMEM에서 4밀리리터 10 FBS로 반응을 중화시키고 적절한 방법으로 세포를 계산합니다. 신선한 중간 농도당 5개의 세포에 약 3배 10으로 세포를 희석시키고, 원심분리에 의해 세포를 수집한다.그런 다음 새로운 0.1 %의 젤라틴 코팅 T25 플라스크에 투석하기위한 신선한 2i 매체의 5 밀리리터로 펠릿을 다시 중단합니다. 심장 스페로이드로부터 CPC 생성을 위해, 분리된 형질전환 마우스 배아 줄기세포 샘플 중 6개에서 2.5배 10회 원심분리를 수집하고, SFD 배지의 25밀리리터에서 세포를 재보설한다. 세포 현탁액을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양용 150x 25mm 멸균 플레이트에 48시간 동안 플레이트를 넣습니다.인큐베이션이 끝나면 심장 구체를 원적 튜브로 수집합니다. 스페로이드의 선택적 분리를 용이하게 하고 단일 세포를 피하기 위해 원심분리에 의한 스페로이드를 침전한다. 활성제 A의 밀리리터 당 1나노그램과 뼈 형태유전학 단백질 4의 밀리리터당 1.5 나노그램으로 보충된 신선한 SFD 배지의 25 밀리리터에서 스페로이드를 재중단합니다.세포 배양 인큐베이터에서 24시간 배양용을 위해 동일한 배양 판에 스페로이드를 다시 플레이트로 다시 플레이트합니다. 다음 날, 원심 분리에 의해 심장 스페로이드의 모든 을 회수. 초저 부착, 세포 배양 인큐베이터에서 75센티미터 제곱 플라스크로 도금을 위한 신선한 SFD 배지 25밀리리터에서 분화된 배아 체를 48시간 동안 재중단한다.형광 기자를 사용하여 심장 필드 특정 CPC의 격리를 위해, 원심분리에 의해 배아 체를 수집하고 3분 동안 섭씨 37도에서 트립신 1밀리리터로 3D 배양을 해리시한다. 인큐베이션의 끝에서, 세포를 해리하고 DMEM에서 10 %의 FBS의 4 밀리리터로 반응을 중화하기 위해 파이펫팅하여 잘 섞는다. 70 마이크로미터 여과기 위에 혼합물을 전달하여 비해리된 배아 체를 제거하고 원심분리에 의해 여과된 세포를 퇴적시한다.형광 기자 발현으로 CPC를 정렬하려면 500 마이크로리터 FACS 솔루션의 펠릿을 다시 중단하고 40 마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포를 얼음 위에 5 밀리리터 폴리스티렌 라운드 하단 튜브로 필터링합니다. 그런 다음 세포를 정렬하여 FACS에 의해 RFP 및 GFP 발현 세포를 분리하여 FBS의 1 밀리리터로 세포를 수집합니다. 표면 단백질 Cxcr4 발현에 기초하여 제1 심장필드 CC와 제2 심장필드 CPC를 분리하기 위해, 형광-컨쥬게이트 항 Cxcr4 항체로 보충된 PBS의 10%FBS의 300마이크로리터에서 단일 마우스 배아 줄기 세포 RFP 발현 심장 전구 세포를 재중단한다.실온에서 5 분 후, 세척 당 신선하고 차가운 PBS의 1 ~ 2 밀리리터에 세포를 세 번 씻으시면. 마지막 세척 후, FACS 용액의 500 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고 5 밀리리터, 둥근 바닥 튜브로 40 마이크로 미터 여과기를 통해 세포를 필터링합니다. 그런 다음 Cxcr4 발식으로 세포를 정렬하여 Cxcr4 양성 및 부정적인 집단을 얼음에 튜브 당 1 밀리리터를 포함하는 개별 튜브로 수집합니다.FACS 절연, 심장 필드 별 심장 전구 세포를 재배양하기 위해, 원심분리에 의해 정렬 된 세포를 수집하고 SFD 배지에서 펠릿을 다시 중단. 그런 다음 0.1%젤라틴 코팅, 384웰 플레이트에서 잘 4개의 세포에 약 3회 10회 종자한다. 세포 사멸이 정렬 후 지적되는 경우 각 웰에 10 마이크로 몰러 ROCK 억제제를 추가하십시오.문화의 이틀 후, 자발적인 구타를 관찰한다. 도금 된 CPC의 능력을 분석하여 심근세포로 분화하기 위해, 12일째에 트립신과 분화하여 단일 심근세포를 분리하고 세포를 4% 파라포름알데히드로 재보종한다. 실온에서 30 분 후, 원심 분리에 의해 고정 된 세포를 수집하고 초과 고정을 제거하기 위해 PBS에서 펠릿을 세척합니다.다음으로, PBS에서 10%FBS에서 세포를 재보중단하고, 마우스 안티트로포닌 T 항체로 세포 샘플의 절반을 배양하고 샘플의 나머지 절반을 음수 대조군으로 사용한다. 실온에서 30 분 후, 신선한 PBS에서 세포를 두 번 세척하고 적절한 이차 항체로 보충 된 10 %의 FBS 플러스 PBS로 샘플을 다시 중단하십시오. 실온에서 30분 간 배양한 후, 세척당 신선한 PBS로 세포를 두 번 세척하고 튜브당 PBS 200 마이크로리터로 세포를 재보종하여 유동 세포계에 대한 분석을 한다.약 132시간의 분화 후, Tbx1-RFP 및 Hcn4-GFP 심장 전구 세포는 형광 현미경 검사법에 의해 검출될 수 있다. 일반적으로, GFP와 RFP 세포 둘 다 거의 같은 시간에 나타나고, 전구 세포의 2개의 인구는 상호 보완적인 패턴에서 근접하고 전형적으로 확장하는 것을 계속합니다. 액티비틴 A와 뼈 형태유전학 단백질 4의 농도를 조정하면 첫 번째 심장장 과 제2 심장 전구 의 백분율을 변경합니다.유사하게, RFP 기자 마우스 배아 줄기 세포줄을 사용하여, 132시간의 분화 후, RFP 양성 심장 전구세포가 나타난다. Cxcr4, RFP 양성, Cxcr4 양성 및 RFP 양성에 대한 면역 염색 후 Cxcr4-음수 세포를 분리할 수 있습니다. 12일째에 심장 트로포닌 T에 대한 면역 염색은 첫 번째 심장필드 세포가 주로 심낭으로 분화한다는 것을 확인합니다.유사하게, RFP 양성, Cxcr4-음성 심장 전구 세포에서 유래한 세포는 Cxcr4 단 양성 심장 전구 세포에 비해 훨씬 더 높은 비율로 심근구를 초래합니다. 때때로, 마우스 배아 줄기 세포는 효율적으로 분화하고 심장 필드 특정 심장 선조 세포의 아주 낮은 수를 형성하는 데 실패합니다. 사이토카인의 첨가의 타이밍, 농도 및 일관성과 세포의 수는 챔버 별 심장 전구 세포의 성공적인 생성에 매우 중요합니다.이 절차에 따라, 조사자는 그들의 사양 및 기능에 추가 통찰력을 얻기 위하여 심장 전구 세포의 다른 인구의 생리적 특성을 분석할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

연구

발생학

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Myh6 발기인 - 선택과 함께 ES-세포 프로그래밍을 바탕으로 설치류 심장 페이스 메이커 세포 집합체의 생성

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

불멸화 된 다 능성 귀의 전구 세포의 분화를 초기화

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

성숙한 슈반 세포 생성을위한 골수 유래 선조 세포의 저산소 전처리

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

조 혈 줄기와 뿌리를 Quantitate를 생체 외에서 시험의 개발 세포 (HSPCs) Zebrafish 태아를 개발

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

낮은 혈 청 조건 하에서 심장 조상 세포에서 내 피 분화의 유도

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...