Name: in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

E. T. ble støttet av The Magic som teller og AHA. C. K. ble støttet av tilskudd fra NICHD/NIH (R01HD086026), AHA, og MSCRF.

Merk: In vitro generasjon av hjerte felt-spesifikk mus CARDIAC stamceller (figur 1).
1. vedlikehold av mus ESCs
<ol><li>Grow mESCs (mESCsTbx1-grobunn; Rosa-RFP; HCN4-GFP, MESCISL1-RFP)25 på 0,1% (w/v) gelatin belagt T25 flasker i 2i medium (870 ml GLASCOW minimum viktig medium (GMEM), 100 ml fosterets storfe serum (FBS), 10 mL av GlutaMAX, 10 ml av ikke-essensielle aminosyrer, 10 m...

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li><li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+cardiomyocyte.">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li><li>Birket, M. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+cardiovascular+progenitors--a+developmental+perspective.">Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective.</a> Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient.">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Atrial+and+Ventricular+Cardiomyocytes+Develop+from+Distinct+Mesoderm+Populations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Galdos, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Regeneration:+Lessons+From+Development.">Cardiac Regeneration: Lessons From Development.</a> Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).</li><li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lineage+restriction+in+temporally+distinct+populations+of+Mesp1+progenitors+during+mammalian+heart+development.">Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development.</a> Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+networks+in+heart+development+and+regeneration.">Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).</li><li>Bruneau, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber-specific+cardiac+expression+of+Tbx5+and+heart+defects+in+Holt-Oram+syndrome.">Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.</a> Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+gene+regulation+in+the+second+heart+field+by+Tbx1,+Nkx2-5,+and+Islet1+reveals+a+genetic+switch+for+down-regulation+in+the+myocardium.">Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).</li><li>Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fate+map+of+Tbx1+expressing+cells+reveals+heterogeneity+in+the+second+cardiac+field.">A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field.</a> Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+Distinct+Six2-Positive+Second+Heart+Field+Progenitors+Regulate+Mammalian+Heart+Development+and+Disease.">Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease.</a> Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+neonatal+rat+system+as+a+bioincubator+to+generate+adult-like+mature+cardiomyocytes+from+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells.">Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).</li><li>Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+heart+disease:+entering+a+new+era+of+human+genetics.">Congenital heart disease: entering a new era of human genetics.</a> Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome.">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAND1+loss-of-function+mutation+contributes+to+congenital+double+outlet+right+ventricle.">HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells.">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, 02164 (2014).</li><li>Morita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall1+transiently+marks+undifferentiated+heart+precursors+and+regulates+their+fate.">Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326 (5951), 426-429 (2009).</li></ol>

I vår protokoll beskriver vi en metodikk for å generere hjerte-spheroids og isolerte hjerte Feltspesifikke CPC-er. De kan brukes til å studere mekanismer for CPC-spesifikasjonen og deres egenskaper, så vel som for CARDIAC kammer-spesifikk sykdom modellering. En tidligere publisert arbeid brukt en mESC linje med to fluorescerende journalister (Mef2c/Nkx 2.5) for å studere cardiogenesis in vitro, men begge disse markørene uttrykkes på embryonale dag 9.5-10 når cardiomyocytes er allerede dannet26</...

Bruken av Pluripotent stamceller (PSCer) har revolusjonert feltet av CARDIAC regenerering og personlig medisin med pasient-spesifikke myocytter for sykdoms modellering og narkotikabehandling1,2,3, 4. mer nylig har in vitro protokoller for generering av atrieflimmer vs ventrikkel samt pacemaker-lignende cardiomyocytes har blitt utviklet5,6. Men om cardiogenesis kan gjenopprettes in vitro for å studere hjerte utvikling og deretter generere ventrikkel kammer spesifikke CARDIAC celler er fortsatt uklart.
Under tidlig embryoutvikling, mesodermal celler under påvirkning av utskilt morphogens som BMP4, Wnts og Activin A danner primitive strek7. CARDIAC mesodermal celler preget av uttrykk for Mesp1, migrere anteriort og senere tid å danne CARDIAC halvmåne og deretter primitive hjerte tube7,8. Denne trekk gruppen av celler inneholder to svært distinkte populasjoner av hjerte stamceller (CPC), nemlig det første og det andre hjerte feltet (FHF og SHF)9,10. Celler fra SHF er svært proliferativ og trekk, og er primært ansvarlig for forlengelse og looping av hjertet røret. I tillegg SHF celler differensiere til cardiomyocytes, fibroblaster, glatt muskel og endothelial celler som de kommer inn i hjertet røret for å danne høyre ventrikkel, høyre ventrikkel utløp og stor del av både Atria7,10. I kontrast, FHF celler er mindre proliferativ og trekk og skille hovedsakelig til cardiomyocytes som de gir opphav til venstre ventrikkel og en mindre del av Atria11. I tillegger SHF forfedre preget av uttrykk for Tbx1, FGF8, FGF10 og Six2 mens FHF celler uttrykker Hcn4 og Tbx511,12,13,14,15.
PSCer kan differensiere til alle tre bakterie lag og deretter til en hvilken som helst celle type i kroppen4,16. Derfor tilbyr de enormt potensial for å forstå hjerte utvikling og for modellering spesifikke utviklingsmessige defekter som resulterer i medfødt hjertesykdom, den hyppigste årsaken til fødselen defekter17. En stor undergruppe av medfødt hjertesykdom inkluderer kammer-spesifikke CARDIAC unormalt18,19. Men det fortsatt uklart om disse stammer fra uregelrett hjerte feltutbygging. I tillegg, gitt manglende evne til cardiomyocytes å spre etter fødselen, har det vært omfattende anstrengelser for å skape hjerte vev for hjertet gjenfødelse1,7,20. Tatt i betraktning de fysiologiske og morfologiske forskjellene mellom CARDIAC kamre, generasjon av kammer-spesifikke CARDIAC vev bruker PSCer er av vesentlig betydning. Mens nylige fremskritt innen utviklings kardiologi har ført til en robust generasjon av CARDIAC celler fra PSCer, er det fortsatt uklart om de to hjerte feltene kan bli indusert i PSC-systemer.
For å recapitulate cardiogenesis in vitro og studere spesifikasjonen og egenskapene til CPC, har vi tidligere brukt et system basert på differensiering av PSC-avledet CARDIAC spheroids21,22,23,24. Nylig genererte vi mus embryonale stamceller (mESCs) med GFP og RFP journalister under kontroll av FHF genet Hcn4 og SHF genet Tbx1, henholdsvis (mESCsTbx1-grobunn; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. In vitro differensiert mESCs dannet CARDIAC spheroids der GFP + og RFP + celler dukket opp fra to forskjellige områder av mesodermal celler og mønstret på en komplementær måte. De resulterende GFP +-og RFP +-cellene viste henholdsvis FHF-og SHF-egenskapene, bestemt av RNA-sekvensering og klonal-analyser. Betydelig, benytter mESCs bærer det Isl1-RFP reporter (mESCIsl1-RFP), vi oppdaget det SHF celler var trofast Fair av cellen-overflate protein CXCR4, og denne kanne sette i stand isolasjon av hjertet åker-spesifikk celler uten transgenes. Den nåværende protokollen vil beskrive generering og isolering av hjerte Feltspesifikke CPC-er fra mESCs, som kan tjene som et verdifullt verktøy for å studere kammer spesifikk hjertesykdom.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1251px;" width="1250">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.1% (w/v) Gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100X Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1X PBS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40&#956;m cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td align="right">35223</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Activin A</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>338-AC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 minus vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BMP4</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:245px;">Sony</td>
			<td style="width:344px;">SH800</td>
			<td style="width:241px;">Sony or any other fluorescence-activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell strainer 70&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge Sorvall Legend XT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">75004508</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CHIR99021</td>
			<td>Selleck chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">51030285</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Corning Ultra Low Attachment T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Countless II FL automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571, Lot #1757130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium high glucose (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ESGRO (LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EVOS FL microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glasgow&#8217;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monothioglycero (MTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MS-295-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acid solution (NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suspension culture dish 150 mm x 25mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE (Trypsin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td align="right">72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells

Pluripotent stamceller tilbyr stort potensial for å forstå hjerte utvikling og sykdom og for regenererende medisin. Mens de siste fremskritt i utviklingsmessige kardiologi har ført til generering av CARDIAC celler fra Pluripotent stamceller, er det uklart om de to CARDIAC felt-den første og andre hjerte felt (FHF og SHF)-er indusert i Pluripotent stamceller systemer. For å løse dette, genererte vi en protokoll for in vitro spesifikasjon og isolering av hjerte felt-spesifikke CARDIAC stamceller. Vi brukte embryonale stamceller linjer bærer Hcn4-GFP og Tbx1-grobunn; Rosa-RFP journalister av FHF og SHF, henholdsvis, og live celle immunostaining av cellemembranen protein Cxcr4, en SHF markør. Med denne tilnærmingen genererte vi stamceller som recapitulate de funksjonelle egenskapene og transcriptome til deres in vivo motstykker. Vår protokoll kan utnyttes til å studere tidlig spesifikasjon og segregering av de to hjerte felt og å generere kammer-spesifikke CARDIAC celler for hjertesykdom modellering. Siden dette er et in vitro organoid system, kan det ikke gi presis anatomisk informasjon. Men, dette systemet overvinner dårlig tilgjengelighet av gastrulation-scenen embryo og kan oppskalert for høy gjennomstrømming skjermer.

Etter ca 132 h av differensiering, kan Tbx1-RFP og Hcn4-GFP CPC oppdages ved hjelp av et fluorescerende mikroskop (figur 2). Vanligvis, GFP og RFP celler komme ca i nærheten det likt tid. De to populasjoner av CPC fortsetter å ekspandere i umiddelbar nærhet og ofte i et utfyllende mønster. Justering av konsentrasjonen av Activin A og BMP4 vil endre prosentene av FHF vs SHF CPC (Figur 3). CPC-spesifikasjonen in vitro ble først og fremst bestemt av konsentras...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Formålet med denne metoden er å generere hjerte Feltspesifikke CARDIAC stamceller in vitro for å studere Stamcelle spesifikasjonen og funksjonelle egenskaper, og å generere kammer spesifikke CARDIAC celler for hjertesykdom modellering.

In vitro generasjon av mus hjerte Field-spesifikke CARDIAC stamceller

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Vår metode tar sikte på å generere hjertefeltspesifikke hjertestamceller fra mus embryonale stamceller. Dette hjertefeltet reporter stamcellelinje gjør det mulig for høy gjennomstrømning studie av mekanismene underliggende medfødt hjertesykdom, og gir et system som er mottagelig for genetisk og farmakologisk manipulasjon. Det er flere kammerspesifikke medfødte hjertesykdommer.Ved å rekafulere kardiogenese in vitro, tillater denne protokollen studiet av sykdomsmekanisme og utvikling av fremtidige regenerative terapier. Denne protokollen kan gi innsikt i hvordan hjerte stamceller av forskjellige kamre er spesifisert under hjerteutvikling. Begynn med å dyrke transgene mus embryonale stamceller i 0,1% gelatinbelagte T25 flasker i 2i medium.Når cellene når 70 til 80% samløpet, skyll kulturene med PBS og legg til en milliliter trypsin per kolbe for å dissosiere kulturen i enkeltceller ved 37 grader Celsius i tre minutter. Når cellene har løsnet, nøytralisere reaksjonen med fire milliliter 10 FBS i DMEM og telle cellene med en passende metode. Fortynn cellene til omtrent tre ganger 10 til de fem cellene per frisk middels konsentrasjon, og samle cellene ved sentrifugering.Deretter resuspend pellet i fem milliliter av friske 2i medium for replating på nye 0,1% gelatin-belagt T25 flasker. For CPC generasjon fra hjerte sfæroider, samle 2,5 ganger 10 til seks av frittliggende transgen mus embryonale stamcelleprøven ved sentrifugering, og resuspend cellene i 25 milliliter SFD medium. Plate celle suspensjon i en 150-by-25-millimeter steril plate for inkubasjon ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 48 timer.På slutten av inkubasjonen, samle hjertesfæroider i et konisk rør. Sediment sfæroider ved sentrifugering for å lette selektiv isolering av sfæroider og for å unngå enkeltceller. Resuspend spheroids i 25 milliliter av frisk SFD medium supplert med ett nanogram per milliliter activin A og 1,5 nanogram per milliliter bein morfogenetisk protein fire.Plate om spheroidene tilbake på samme kulturplate for en 24-timers inkubasjon i cellekulturinkubatoren. Neste dag, husker alle hjertesfæroider ved sentrifugering. Gjenoppusser de differensierte embryolegemene i 25 milliliter friskt SFD-medium for plating i et ultra-lavt vedlegg, 75-centimeter kvadrert kolbe i cellekulturinkubatoren i 48 timer.For isolering av hjertefeltspesifikk CPC ved hjelp av fluorescerende reportere, samle embryoide organer ved sentrifugering og dissosiere 3D-kulturene med en milliliter trypsin ved 37 grader Celsius i tre minutter. På slutten av inkubasjonen, bland godt ved å pipettering for å dissosiere cellene og nøytralisere reaksjonen med fire milliliter på 10% FBS i DMEM. Pass blandingen over en 70-mikrometer sil for å fjerne eventuelle ikke-dissosierte embryoidlegemer, og sediment de filtrerte cellene ved sentrifugering.For å sortere CPC-ene etter deres fluorescerende reporteruttrykk, gjenoppstår pelleten i 500 mikroliter FACS-løsning og filtrerer cellene gjennom en 40-mikrometercellesil i et fem milliliter polystyren rundbunnsrør på is. Sorter deretter cellene for å isolere RFP- og GFP-uttrykkende celler ved FACS, samle cellene i en milliliter FBS. For å isolere første versus andre hjertefelt HLCer basert på deres overflateprotein Cxcr4 uttrykk, resuspend enkelt mus embryonale stamcelle RFP-uttrykke hjerte stamceller i 300 mikroliter på 10% FBS i PBS supplert med fluorescens-konjugert anti-Cxcr4 antistoff.Etter fem minutter ved romtemperatur, vask cellene tre ganger i en til to milliliter frisk, kald PBS per vask. Etter siste vask, resuspend cellene i 500 mikroliter facs løsning og filtrere cellene gjennom en 40-mikrometer sil i en fem-milliliter, rund bunn rør. Sorter deretter cellene etter deres Cxcr4-uttrykk, og samle både Cxcr4-positive og negative populasjoner i individuelle rør som inneholder en milliliter FPS per rør på is.For å re-kultur facs-isolerte, hjertefeltspesifikke hjertestamceller, samle de sorterte cellene ved sentrifugering og gjenbruke pellets i SFD medium. Deretter frø omtrent tre ganger 10 til de fire cellene per brønn i en 0,1% gelatinbelagt, 384-brønnsplate. Hvis økt celledød er notert etter sortering, tilsett 10-mikromos ROCK-hemmer til hver brønn.Etter to dager med kultur bør spontan juling observeres. For å analysere evnen til belagte CPC-er for å differensiere til kardiomyocytter, samle cellene på dag 12 av differensiering med trypsin, som demonstrert, å isolere enkelt kardiomyocytter og resuspend cellene i 4% paraformaldehyd. Etter 30 minutter ved romtemperatur, samle de faste cellene ved sentrifugering og vask pellet i PBS for å fjerne overflødig fikseringsmiddel.Deretter bruker cellene i 10% FBS i PBS, og inkuberer halvparten av celleprøven med mus anti-troponin T antistoff og bruker den andre halvdelen av prøven som en negativ kontroll. Etter 30 minutter ved romtemperatur, vask cellene to ganger i fersk PBS og gjenbruk prøvene i 10% FBS pluss PBS supplert med et passende sekundært antistoff. Etter ytterligere 30-minutters inkubasjon ved romtemperatur, vask cellene to ganger i fersk PBS per vask og gjenoppusser cellene i 200 mikroliter PBS per rør for analyse på et strømningscytometer.Etter ca. 132 timer med differensiering kan Tbx1-RFP- og Hcn4-GFP hjertestamceller oppdages ved fluorescensmikroskopi. Vanligvis vises både GFP- og RFP-celler omtrent omtrent samtidig, og de to populasjonene av stamceller fortsetter å ekspandere i umiddelbar nærhet og vanligvis i et komplementært mønster. Justering av konsentrasjonene av activin A og bein morfogenetisk protein fire vil endre prosentandelene av første versus andre hjerte feltet hjerte stamceller.På samme måte, ved hjelp av en RFP-reporter mus embryonale stamcellelinje, etter 132 timer med differensiering, vises RFP-positive hjertestamceller. Etter immunstaining for Cxcr4 kan RFP-positive, Cxcr4-positive og RFP-positive, Cxcr4-negative celler isoleres. Immunstaining for hjertetrponin T på dag 12 av differensiering bekrefter at første hjertefeltceller skiller hovedsakelig til myocytter.På samme måte gir celler avledet fra RFP-positive, Cxcr4-negative hjertetamtamceller opphav til kardiomyocytter ved mye høyere prosentandeler sammenlignet med Cxcr4 enkeltpositive hjertestamtamceller. Av og til, mus embryonale stamceller ikke klarer å skille effektivt og danne svært lave antall hjertefeltspesifikke hjerte stamceller. Tidspunktet, konsentrasjonen og konsistensen av tilsetning av cytokinene og antall celler er avgjørende for en vellykket generasjon kammerspesifikke hjerte stamceller.Etter denne prosedyren kan forskerne analysere de fysiologiske egenskapene til de forskjellige populasjonene av hjertestamfarceller for å få ytterligere innsikt i deres spesifikasjon og funksjon.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Avledning av Cardiac stamceller fra embryonale stamceller

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Generasjon av murine pacemaker Cell Aggregater Basert på ES-Cell-programmering i kombinasjon med Myh6-arrangøren-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Initiere Differensiering i udødeligmultipotente Otic stamceller

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony analyser for å karakterisere Tri-potente stamceller isolert fra den voksne Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Hypoksisk forbehandling av margenavledede progenitorceller som kilde for generering av modne Schwann-celler

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativ hele-mount Immunofluorescence analyse av Cardiac stamfar populasjoner i Mouse embryoer

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Utvikling av In Vitro analysen å Quantitate blodkreft stilk og stamfar celler (HSPCs) i utvikle sebrafisk embryo

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generasjon første hjertet felt-lignende Cardiac Progenitors og ventrikkel som Cardiomyocytes fra menneskelige Pluripotent stamceller

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Induksjon av Endothelial differensiering i Cardiac Progenitor celler Under lav Serum forhold

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...