Name: in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

E. T. foi apoiado por a magia que importa e AHA. C. K. foi apoiado por subvenções da NICHD/NIH (R01HD086026), AHA e MSCRF.

Nota: Geração in vitro de células progenitoras cardíacas do rato específicas do campo cardíaco (Figura 1).
1. manutenção dos ESCs do rato
<ol><li>Cresça mESCs (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP, mescISL1-RFP)25 em 0,1% (p/v) frascos de T25 revestidos com gelatina em meio 2i (870 ml de meio essencial de Glascow mínimo (Gmem), 100 ml de soro fetal bovino (FBS), 10 ml de glut...

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li><li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+cardiomyocyte.">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li><li>Birket, M. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+cardiovascular+progenitors--a+developmental+perspective.">Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective.</a> Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient.">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Atrial+and+Ventricular+Cardiomyocytes+Develop+from+Distinct+Mesoderm+Populations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Galdos, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Regeneration:+Lessons+From+Development.">Cardiac Regeneration: Lessons From Development.</a> Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).</li><li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lineage+restriction+in+temporally+distinct+populations+of+Mesp1+progenitors+during+mammalian+heart+development.">Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development.</a> Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+networks+in+heart+development+and+regeneration.">Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).</li><li>Bruneau, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber-specific+cardiac+expression+of+Tbx5+and+heart+defects+in+Holt-Oram+syndrome.">Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.</a> Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+gene+regulation+in+the+second+heart+field+by+Tbx1,+Nkx2-5,+and+Islet1+reveals+a+genetic+switch+for+down-regulation+in+the+myocardium.">Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).</li><li>Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fate+map+of+Tbx1+expressing+cells+reveals+heterogeneity+in+the+second+cardiac+field.">A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field.</a> Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+Distinct+Six2-Positive+Second+Heart+Field+Progenitors+Regulate+Mammalian+Heart+Development+and+Disease.">Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease.</a> Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+neonatal+rat+system+as+a+bioincubator+to+generate+adult-like+mature+cardiomyocytes+from+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells.">Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).</li><li>Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+heart+disease:+entering+a+new+era+of+human+genetics.">Congenital heart disease: entering a new era of human genetics.</a> Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome.">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAND1+loss-of-function+mutation+contributes+to+congenital+double+outlet+right+ventricle.">HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells.">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, 02164 (2014).</li><li>Morita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall1+transiently+marks+undifferentiated+heart+precursors+and+regulates+their+fate.">Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326 (5951), 426-429 (2009).</li></ol>

Em nosso protocolo, nós descrevemos uma metodologia para gerar esferoides cardíacos e CPCS campo-específicos isolados do coração. Esses podem ser usados para estudar mecanismos de especificação de CPC e suas propriedades, bem como para a modelagem da doença de câmara cardíaca específica. Um trabalho publicado anteriormente utilizou uma linha de mESC com dois repórteres fluorescentes (Mef2c/nkx 2.5) para estudar a cardiogênese in vitro, no entanto, ambos os marcadores são expressos no dia embrionário 9.5-10...

O uso de células-tronco pluripotentes (PSCs) revolucionou o campo de regeneração cardíaca e medicina personalizada com miócitos específicos do paciente para modelagem de doenças e terapias medicamentosas1,2,3, 4. mais recentemente, os protocolos in vitro para a geração de cardiomiócitos atrial vs ventricular, bem como de marca-passo-tipo PSC-derivados têm sido desenvolvidos5,6. No entanto, se a cardiogênese pode ser recriada in vitro para estudar o desenvolvimento cardíaco e, posteriormente, gerar células cardíacas específicas da câmara ventricular ainda não está clara.
Durante o desenvolvimento embrionário adiantado, as pilhas Mesodermal a influência de espécies secretado tais como BMP4, wnts e activin a formam a raia primitiva7. Células mesodérmicas cardíacas marcadas pela expressão de Mesp1, migram anterioramente e ultimamente para formar o crescente cardíaco e, em seguida, o tubo do coração primitivo7,8. Este grupo migratório de células inclui duas populações muito distintas de células progenitoras cardíacas (CPCS), ou seja, o primeiro e o segundo campo cardíaco (FHF e SHF)9,10. As células do SHF são altamente proliferativas e migratórias e são principalmente responsáveis pelo alongamento e looping do tubo cardíaco. Adicionalmente, as células de SHF diferenciam-se aos cardiomiócitos, fibroblastos, músculo liso e células endoteliais à medida que entram no tubo cardíaco para formar o ventrículo direito, o trato de saída do ventrículo direito e grande parte de ambos os átrios7,10. Em contrapartida, as células FHF são menos proliferativas e migratórias e diferenciam-se principalmente dos cardiomiócitos, pois dão origem ao ventrículo esquerdo e menor parte dos átrios11. Além disso, os progenitores de SHF são marcados pelaexpressão de Tbx1, FGF8, FGF10 e Six2 enquanto as células FHF expressam Hcn4 e Tbx511,12,13,14,15.
PSCs pode diferenciar-se a todas as três camadas do germe e subseqüentemente a todo o tipo da pilha no corpo4,16. Conseqüentemente, oferecem o potencial tremendo para compreender o desenvolvimento do coração e para modelar defeitos desenvolventes específicos tendo por resultado a doença cardíaca congenital, a causa a mais freqüente de defeitos de nascimento17. Um grande subgrupo de cardiopatia congênita inclui anormalidades cardíacas específicas da câmara,18,19. Entretanto, ainda incerto se estes originam do desenvolvimento anômalo do campo do coração. Além disso, dada a incapacidade de os cardiomiócitos proliferar após o nascimento, tem havido esforços extensivos para criar tecido cardíaco para a regeneração cardíaca1,7,20. Considerando as diferenças fisiológicas e morfológicas entre as câmaras cardíacas, a geração de tecido cardíaco específico da câmara utilizando PSCs é de importância significativa. Quando os avanços recentes na Cardiologia desenvolvente conduziram à geração robusta de pilhas cardíacas de PSCs, é ainda obscuro se os dois campos do coração podem ser induzidos em sistemas do PSC.
Para recapitular a cardiogênese in vitro e estudar a especificação e as propriedades de CPCS, utilizou-se previamente um sistema baseado na diferenciação de esferóides cardíacos derivados do PSC21,22,23,24. Recentemente, geramos células-tronco embrionárias do camundongo (mESCs) com repórteres GFP e RFP o controle do gene FHF Hcn4 e do gene SHF Tbx1, respectivamente (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. Os mESCs diferenciados in vitro formaram esferóides cardíacos nos quais as células GFP + e RFP + apareceram de duas áreas distintas de células mesodérmicas e padronizadas de forma complementar. As células GFP + e RFP + resultantes exibiram características de FHF e SHF, respectivamente, determinadas por sequenciamento de RNA e análises clonais. Importante, usando mESCs carregando o Isl1-RFP Reporter (mESCIsl1-RFP), descobrimos que as células de SHF foram fielmente marcadas pela proteína de superfície celular CXCR4, e isso pode permitir o isolamento de células específicas do campo cardíaco sem transgenes. O protocolo atual descreverá a geração e o isolamento de CPCs de campo específico do coração de mESCs, que pode servir como uma ferramenta valiosa para estudar a doença cardíaca câmara-específica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1251px;" width="1250">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.1% (w/v) Gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100X Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1X PBS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40&#956;m cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td align="right">35223</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Activin A</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>338-AC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 minus vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BMP4</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:245px;">Sony</td>
			<td style="width:344px;">SH800</td>
			<td style="width:241px;">Sony or any other fluorescence-activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell strainer 70&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge Sorvall Legend XT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">75004508</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CHIR99021</td>
			<td>Selleck chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">51030285</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Corning Ultra Low Attachment T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Countless II FL automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571, Lot #1757130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium high glucose (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ESGRO (LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EVOS FL microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glasgow&#8217;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monothioglycero (MTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MS-295-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acid solution (NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suspension culture dish 150 mm x 25mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE (Trypsin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td align="right">72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells

Células-tronco pluripotentes oferecem grande potencial para a compreensão do desenvolvimento do coração e da doença e para a medicina regenerativa. Embora os recentes avanços na Cardiologia do desenvolvimento tenham levado a gerar células cardíacas a partir de células-tronco pluripotentes, não é claro se os dois campos cardíacos-o primeiro e o segundo campos cardíacos (FHF e SHF) – são induzidos em sistemas de células-tronco pluripotentes. Para abordar este, nós geramos um protocolo para in vitro a especificação e a isolação de pilhas cardíacas campo-específicas do progenitor do coração. Foram utilizadas linhagens de células-tronco embrionárias portadoras de Hcn4-GFP e Tbx1-CRE; Os repórteres de rosa-RFP do FHF e do SHF, respectivamente, e a imunomarcação da pilha viva da proteína Cxcr4 da membrana de pilha, um marcador de SHF. Com esta aproximação, nós geramos as pilhas do progenitor que recapitular as propriedades funcionais e o transcriptoma de seus homólogos in vivo. Nosso protocolo pode ser utilizado para estudar a especificação adiantada e a segregação dos dois campos do coração e para gerar pilhas cardíacas câmara-específicas para a modelagem da doença cardíaca. Uma vez que este é um sistema organoide in vitro, não pode fornecer informações anatômicas precisas. No entanto, este sistema supera a má acessibilidade dos embriões de estágio de gastrulação e pode ser aumentado para telas de alta taxa de transferência.

Após aproximadamente 132 h de diferenciação, os CPCs Tbx1-RFP e Hcn4-GFP podem ser detectados usando um microscópio fluorescente (Figura 2). Geralmente, as células GFP e RFP aparecem aproximadamente ao mesmo tempo. As duas populações de CPCs continuam a se expandir em estreita proximidade e comumente em um padrão complementar. O ajuste das concentrações de activin A e BMP4 alterará as porcentagens de FHF vs SHF CPCs (Figura 3). A especificação de CP...

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In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

O objetivo deste método é gerar células progenitoras cardíacas específicas do campo cardíaco in vitro para estudar a especificação de células progenitoras e propriedades funcionais, e para gerar células cardíacas específicas de câmara para modelagem de doenças cardíacas.

In vitro geração de células progenitoras cardíacas específicas do coração do rato

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Nosso método visa gerar células progenitoras cardíacas específicas do campo cardíaco a partir de células-tronco embrionárias de camundongos. Esta linha de células-tronco do campo cardíaco permite o estudo de alto rendimento dos mecanismos subjacentes à doença cardíaca congênita, fornecendo um sistema que é favorável à manipulação genética e farmacológica. Existem várias doenças cardíacas congênitas específicas da câmara.Ao recapitular a cardiogênese in vitro, este protocolo permite o estudo do mecanismo da doença e o desenvolvimento de futuras terapias regenerativas. Este protocolo pode fornecer uma visão de como células progenitoras cardíacas de diferentes câmaras são especificadas durante o desenvolvimento cardíaco. Comece cultivando células-tronco embrionárias de camundongos transgênicos em frascos T25 revestidos de gelatina em 2i médio.Quando as células atingirem 70 a 80% de confluência, enxágue as culturas com PBS e adicione um mililitro de trippsina por frasco para dissociar a cultura em células únicas a 37 graus Celsius por três minutos. Quando as células se separarem, neutralize a reação com quatro mililitros 10 FBS em DMEM e conte as células por um método apropriado. Diluir as células para aproximadamente três vezes 10 às cinco células por concentração média fresca, e coletar as células por centrifugação.Em seguida, resuspenque a pelota em cinco mililitros de meio 2i fresco para replacar em novos frascos T25 revestidos de gelatina de 0,1%. Para a geração CPC a partir de esferoides cardíacos, coletar 2,5 vezes 10 para seis da amostra de células-tronco embrionárias do camundongo transgênico destacado por centrifugação, e resuspensar as células em 25 mililitros de meio SFD. Coloque a suspensão da célula em uma placa estéril de 150 por 25 milímetros para incubação a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas.No final da incubação, colete os esferoides cardíacos em um tubo cônico. Sedimentar os esferoides por centrifugação para facilitar o isolamento seletivo dos esferoides e evitar células únicas. Resuspend os esferoides em 25 mililitros de médio SFD fresco suplementado com um nanograma por mililitro de ativação A e 1,5 nanogramas por mililitro de proteína morfogenética óssea quatro.Replouse os esferoides de volta à mesma placa de cultura para uma incubação de 24 horas na incubadora de cultura celular. No dia seguinte, lembre-se de todos os esferoides cardíacos por centrifugação. Resuspenque os corpos embrióides diferenciados em 25 mililitros de meio SFD fresco para chapeamento em um acessório ultra-baixo, frasco quadrado de 75 centímetros na incubadora de cultura celular por 48 horas.Para o isolamento do CPC específico do campo cardíaco usando repórteres fluorescentes, colete os corpos embrionários por centrifugação e dissocia as culturas 3D com um mililitro de trippsina a 37 graus Celsius por três minutos. No final da incubação, misture bem por pipetação para dissociar as células e neutralizar a reação com quatro mililitros de 10% FBS em DMEM. Passe a mistura sobre um coador de 70 micrômetros para remover quaisquer corpos embrióides não dissociados, e sedimente as células filtradas por centrifugação.Para classificar os CPCs por sua expressão de repórter fluorescente, resuspenque a pelota em 500 microliters SOLUÇÃO FACS e filtrar as células através de um coador de células de 40 micrômetros em um tubo de fundo redondo de poliestireno de cinco mililitros no gelo. Em seguida, classifique as células para isolar as células expressas por RFP e GFP pela FACS, coletando as células em um mililitro de FBS. Para isolar cpcs de primeiro versus segundo coração com base em sua expressão de proteína superficial Cxcr4, resuspend células-tronco embrionárias de camundongos RFP expressando células progenitoras cardíacas em 300 microliters de 10% FBS em PBS complementados com anticorpo anti-Cxcr4 conjugado fluorescência.Depois de cinco minutos em temperatura ambiente, lave as células três vezes em um a dois mililitros de PBS fresco e frio por lavagem. Após a última lavagem, resuspenja as células em 500 microliters de solução FACS e filtrar as células através de um coador de 40 micrômetros em um tubo de fundo redondo de cinco milímetros. Em seguida, classifique as células por sua expressão Cxcr4, coletando populações Cxcr4-positivas e negativas em tubos individuais contendo um mililitro de FPS por tubo no gelo.Para reculturar as células progenitoras cardíacas isoladas do campo cardíaco, coletar as células classificadas por centrifugação e resuspensar as pelotas em meio SFD. Em seguida, semente aproximadamente três vezes 10 para as quatro células por poço em uma placa de 0,1% revestida de gelatina, 384-bem. Se o aumento da morte celular for notado após a classificação, adicione o inibidor de ROCK de 10 micromolar a cada poço.Após dois dias de cultura, deve-se observar espancamento espontâneo. Para analisar a capacidade dos CPCs banhados de diferenciar-se aos cardiomiócitos, coletar as células no dia 12 de diferenciação com trippsina, como demonstrado, para isolar os cardiomiócitos únicos e resuspensar as células em 4%paraformaldeído. Após 30 minutos em temperatura ambiente, colete as células fixas por centrifugação e lave a pelota em PBS para remover o excesso de fixação.Em seguida, resuspensar as células em 10% FBS em PBS, e incubar metade da amostra celular com anticorpo anti-troponina T do rato e usar a outra metade da amostra como um controle negativo. Após 30 minutos em temperatura ambiente, lave as células duas vezes em PBS fresco e resuspenja as amostras em 10% FBS mais PBS complementado com um anticorpo secundário apropriado. Após outra incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, lave as células duas vezes em PBS fresco por lavagem e resuspenja as células em 200 microliters de PBS por tubo para análise em um citómetro de fluxo.Após aproximadamente 132 horas de diferenciação, as células progenitoras cardíacas Tbx1-RFP e Hcn4-GFP podem ser detectadas por microscopia de fluorescência. Geralmente, as células GFP e RFP aparecem aproximadamente ao mesmo tempo, e as duas populações de células progenitoras continuam a expandir-se nas proximidades e tipicamente em um padrão complementar. Ajustar as concentrações de ativação A e proteína morfogenética óssea quatro alterará as porcentagens das células progenitoras cardíacas do primeiro versus segundo coração.Da mesma forma, usando uma linha de células-tronco embrionárias de rato-de-repórter RFP, após 132 horas de diferenciação, aparecem células progenitoras cardíacas positivas de RFP. Após a imunostaining para Cxcr4, RFP-positive, Cxcr4-positivo e RFP-positivo, as células Cxcr4-negativas podem ser isoladas. A imunostaining para troponina cardíaca T no 12º dia de diferenciação confirma que as primeiras células do campo cardíaco se diferenciam principalmente em miócitos.Da mesma forma, as células derivadas de células progenitoras cardíacas Cxcr4-negativas do RFP dão origem a cardiomiócitos em percentuais muito maiores em comparação com células progenitoras cardíacas positivas Cxcr4. Ocasionalmente, as células-tronco embrionárias do rato não se diferenciam eficientemente e formam um número muito baixo de células progenitoras cardíacas específicas do campo cardíaco. O tempo, a concentração e a consistência da adição das citocinas e o número de células são críticos para uma geração bem sucedida de células progenitoras cardíacas específicas da câmara.Após esse procedimento, os pesquisadores podem analisar as propriedades fisiológicas das diferentes populações de células progenitoras cardíacas para obter mais informações sobre sua especificação e função.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Derivação de Cardiac células progenitoras de células estaminais embrionárias

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Biologia do Desenvolvimento

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Geração de Murino Marcapasso Cardíaco Agregados célula com base na ES-Cell-Programação em combinação com Myh6-Promotor-Seleção

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Iniciando A diferenciação em células multipotentes imortalizadas Otic progenitoras

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Os ensaios para a caracterização de células progenitoras Tri-potentes Isolado das adultas murino Pâncreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Pré-condicionamento hipóxico de células progenitoras derivadas da medula como fonte para a geração de células maduras de Schwann

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Desenvolvimento de um ensaio In Vitro para dosar o Progenitor e Hematopoietic Stem Cells (HSPCs) no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Geração do primeiro coração campo-como progenitores cardíaca e Cardiomyocytes Ventricular, como de células-tronco pluripotentes humanas

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Indução de diferenciação endotelial em células progenitoras cardíacas sob condições de baixo de soro

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...