Name: in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

E. T. была поддержана Магией, которая имеет значение и AHA. К. К. получил поддержку грантов от NICHD/NIH (R01HD086026), AHA и MSCRF.

ПРИМЕЧАНИЕ: В пробирке поколения сердца поле конкретных клеток сердца клеток-прародителей(Рисунок 1).
1. Обслуживание мыши ESCs
<ol><li>Рост mESC (mESCsTbx1-Cre; Роза-РФП; HCN4-GFP, mESCIsl1-RFP)25 на 0,1% (w/v) желатина покрытием T25 колбы в 2i с...

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li><li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+cardiomyocyte.">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li><li>Birket, M. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+cardiovascular+progenitors--a+developmental+perspective.">Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective.</a> Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient.">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Atrial+and+Ventricular+Cardiomyocytes+Develop+from+Distinct+Mesoderm+Populations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Galdos, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Regeneration:+Lessons+From+Development.">Cardiac Regeneration: Lessons From Development.</a> Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).</li><li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lineage+restriction+in+temporally+distinct+populations+of+Mesp1+progenitors+during+mammalian+heart+development.">Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development.</a> Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+networks+in+heart+development+and+regeneration.">Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).</li><li>Bruneau, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber-specific+cardiac+expression+of+Tbx5+and+heart+defects+in+Holt-Oram+syndrome.">Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.</a> Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+gene+regulation+in+the+second+heart+field+by+Tbx1,+Nkx2-5,+and+Islet1+reveals+a+genetic+switch+for+down-regulation+in+the+myocardium.">Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).</li><li>Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fate+map+of+Tbx1+expressing+cells+reveals+heterogeneity+in+the+second+cardiac+field.">A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field.</a> Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+Distinct+Six2-Positive+Second+Heart+Field+Progenitors+Regulate+Mammalian+Heart+Development+and+Disease.">Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease.</a> Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+neonatal+rat+system+as+a+bioincubator+to+generate+adult-like+mature+cardiomyocytes+from+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells.">Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).</li><li>Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+heart+disease:+entering+a+new+era+of+human+genetics.">Congenital heart disease: entering a new era of human genetics.</a> Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome.">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAND1+loss-of-function+mutation+contributes+to+congenital+double+outlet+right+ventricle.">HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells.">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, 02164 (2014).</li><li>Morita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall1+transiently+marks+undifferentiated+heart+precursors+and+regulates+their+fate.">Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326 (5951), 426-429 (2009).</li></ol>

В нашем протоколе мы описываем методологию генерации сердечных сфероидов и изолированных сердечных полевых КПК. Они могут быть использованы для изучения механизмов спецификации КТК и их свойств, а также для моделирования сердечных камер ных заболеваний. Одна из ранее опубликованных ?...

Использование плюрипотентных стволовых клеток (PSCs) произвелреволюцию в области регенерации сердца и персонализированной медицины с конкретными миоцитами для пациентов для моделирования заболеваний и медикаментозной терапии1,2,3, 4. Совсем недавно, в пробирке протоколы для генерации предсердий против желудочков, а также кардиостимулятор, как PSC полученных кардиомиоцитов были разработаны5,6. Однако, может ли кардиогенез быть воссоздан в пробирке для изучения развития сердца и последующего создания желудочковых камер-специфических сердечных клеток до сих пор неясно.
Во время раннего эмбрионального развития, мезодермальные клетки под влиянием секретных морфогенов, таких как BMP4, Wnts и Activin A образуют примитивную полосу7. Сердечные мезодермальные клетки, отмеченные выражением Mesp1, мигрируют передним и в последнее время, чтобы сформировать сердечный полумесяц, а затем примитивную сердечную трубку7,8. Эта мигрированная группа клеток включает в себя две очень разные популяции клеток-прародителей сердца (КПК), а именно первое и второе поле сердца (FHF и SHF)9,10. Клетки из SHF являются высоко пролиферативными и мигрирующими и в первую очередь отвечают за удлинение и петлю сердечной трубки. Кроме того, SHF клетки дифференцируются к кардиомиоцитов, фибробластов, гладких мышц и эндотелиальных клеток, как они входят в сердечную трубку, чтобы сформировать правый желудочек, правый желудочковой оттока и большую часть обоих предсердий7,10. В отличие от этого, клетки FHF менее пролиферативной и мигрирующих и дифференцировать в основном кардиомиоцитов, поскольку они приводят к левому желудочку и меньшая часть предсердий11. Кроме того, shF прародители отмечены выражением Tbx1, FGF8, FGF10 и Six2 в то время как клетки FHF выражают Hcn4 и Tbx511,12,13,14,15.
PSCs может дифференцировать к всем 3 слоямзародыша и затем к любому типу клетки в теле 4,16. Таким образом, они предлагают огромный потенциал для понимания развития сердца и для моделирования конкретных дефектов развития, приводящих к врожденным порокам сердца, наиболее частой причиной врожденных дефектов17. Большая подгруппа врожденных пороков сердца включает камерно-специфические сердечные аномалии18,19. Тем не менее, до сих пор неясно, являются ли они происходят из аномальной разработки поля сердца. Кроме того, учитывая неспособность кардиомиоцитов размножаться после рождения, были предприняты значительные усилия посозданию сердечной ткани для регенерации сердца 1,7,20. Учитывая физиологические и морфологические различия между сердечными камерами, генерация камерной сердечной ткани с использованием ПСК имеет важное значение. Хотя последние достижения в области развития кардиологии привели к надежной генерации сердечных клеток из PSCs, до сих пор неясно, если два сердца поля могут быть индуцированы в системах PSC.
Для повторения кардиогенеза in vitro и изучения спецификации и свойств КПК, мы ранее использовали систему, основанную на дифференциации PSC полученных сердечных сфероидов21,22,23,24. Недавно мы создали эмбриональные стволовые клетки мыши (mESCs) с GFP и RFP репортеров под контролем гена FHF Hcn4 и гена SHF Tbx1, соответственно (mESCsTbx1-Cre; Роза-РФП; HCN4-GFP) 25. В пробирке дифференцированные mESCs образуются сердечные сфероиды, в которых GFP и RFP' клетки появились из двух различных областей мезодермальных клеток и узорчатые в комплементарной манере. В результате клетки ГФПЗ и ПФР, проявляющие соответственно характеристики FHF и SHF, определяемые анализами РНК-секвенирования и клонального анализа. Важно отметить, что с помощью mESCs проведения Isl1-RFP репортер (mESCIsl1-RFP), мы обнаружили, что SHF клетки были точно отмечены клеточной поверхности белка CXCR4, и это может позволить изоляцию сердца поля конкретных клеток без трансгенов. В настоящем протоколе будет описано генерация и изоляция сердечных полевых КТК от МСК, которые могут служить ценным инструментом для изучения камерных сердечных заболеваний.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1251px;" width="1250">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.1% (w/v) Gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100X Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1X PBS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40&#956;m cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td align="right">35223</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Activin A</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>338-AC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 minus vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BMP4</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:245px;">Sony</td>
			<td style="width:344px;">SH800</td>
			<td style="width:241px;">Sony or any other fluorescence-activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell strainer 70&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge Sorvall Legend XT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">75004508</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CHIR99021</td>
			<td>Selleck chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">51030285</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Corning Ultra Low Attachment T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Countless II FL automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571, Lot #1757130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium high glucose (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ESGRO (LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EVOS FL microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glasgow&#8217;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monothioglycero (MTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MS-295-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acid solution (NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suspension culture dish 150 mm x 25mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE (Trypsin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td align="right">72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells

Плюрипотентные стволовые клетки предлагают большой потенциал для понимания развития сердца и болезней и для регенеративной медицины. Хотя последние достижения в области развития кардиологии привели к генерации сердечных клеток из плюрипотентных стволовых клеток, неясно, если два сердечных полей - первое и второе сердце поля (FHF и SHF) - индуцируются в плюрипотентных стволовых клеток систем. Для решения этой проблемы мы создали протокол для спецификации in vitro и изоляции клеток сердечного полевого декабриста. Мы использовали эмбриональные линии стволовых клеток, несущие Hcn4-GFP и Tbx1-Cre; Роза-RFP репортеров FHF и SHF, соответственно, и живые клетки иммуно-сточки клеточного белка cxcr4, маркер SHF. При таком подходе мы создали клетки-прародители, которые переизбавляли функциональные свойства и транскриптом их аналогов in vivo. Наш протокол может быть использован для изучения ранней спецификации и сегрегации двух сердечных полей и для создания камерных клеток сердца для моделирования сердечных заболеваний. Так как это в пробирке органоидной системы, он не может обеспечить точную анатомическую информацию. Тем не менее, эта система преодолевает низкую доступность эмбрионов ступенчатой стадии и может быть высококлассным для высокопроизводительных экранов.

После примерно 132 ч дифференциации, Tbx1-RFP и Hcn4-GFP CpCs могут быть обнаружены с помощью флуоресцентного микроскопа(рисунок 2). Как правило, ячейки GFP и RFP появляются примерно в одно и то же время. Две популяции КПК продолжают расширяться в непосредственной близости и, как правил...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Цель этого метода состоит в том, чтобы генерировать сердце поле конкретных клеток-прародителей в пробирке для того, чтобы изучить спецификации клеток-прародителей и функциональные свойства, а также для создания камерных конкретных сердечных клеток для моделирования сердечно-сосудистых заболеваний.

В vitro Поколение мыши сердце поле конкретных сердечных клеток-прародителей

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Наш метод направлен на генерацию сердечных полевых клеток-предшественников сердца из эмбриональных стволовых клеток мыши. Это поле сердца репортер стволовых клеток линия позволяет с высокой пропускной способностью исследования механизмов, лежащих в основе врожденного порока сердца, обеспечивая систему, которая подлежма для генетических и фармакологических манипуляций. Существует несколько камерных врожденных пороков сердца.Повторив кардиогенез в пробирке, этот протокол позволяет изучать механизм заболевания и развитие будущих регенеративных методов лечения. Этот протокол может дать представление о том, как клетки-предшественники сердца различных камер указаны во время развития сердца. Начните с выращивания трансгенных эмбриональных стволовых клеток мыши в 0,1%желатин покрытием T25 колбы в 2i среды.Когда клетки достигают 70 до 80% слияния, промыть культуры с PBS и добавить один миллилитр трипсина на колбу, чтобы разъединить культуру в одиночные клетки при 37 градусов по Цельсию в течение трех минут. Когда клетки отсоединились, нейтрализовать реакцию с четырьмя миллилитров 10 FBS в DMEM и рассчитывать клетки соответствующим методом. Разбавить клетки примерно в три раза от 10 до пяти клеток на свежую средней концентрации, и собирать клетки центрифугации.Затем повторно покрыть гранулы в пять миллилитров свежих 2i среды для replating на новые 0,1% желатина покрытием T25 колбы. Для поколения КТК из сердечных сфероидов, собирать 2,5 раза 10 до шести отдельных трансгенных мыши эмбриональной образца стволовых клеток центрифугации, и повторного перерасхода клеток в 25 миллилитров SFD среды. Плита подвески клетки в один 150-на-25-миллиметровой стерильной пластины для инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение 48 часов.В конце инкубации соберите сердечные сфероиды в коническую трубку. Осадок сфероидов центрифугации для облегчения селективной изоляции сфероидов и избежать одиночных клеток. Resuspend сфероидов в 25 миллилитров свежей среды SFD дополняется одним нанограммом на миллилитр активина А и 1,5 нанограмма на миллилитр костного морфогенетического белка четыре.Replate сфероиды обратно на ту же культурную пластину для 24-часовой инкубации в инкубаторе клеточной культуры. На следующий день вспомните все сердечные сфероиды путем центрифугации. Resuspend дифференцированных эмбриональных органов в 25 миллилитров свежей среды SFD для покрытия в ультра-низкой крепления, 75-сантиметровый квадрат колбы в инкубаторе культуры клеток в течение 48 часов.Для изоляции сердечного поля конкретных КПК с помощью флуоресцентных репортеров, собирать эмбриональные тела центрифугации и разобщить 3D культур с одним миллилитр трипсина при 37 градусов по Цельсию в течение трех минут. В конце инкубации хорошо перемешать с помощью пипетки, чтобы разобщить клетки и нейтрализовать реакцию с четырьмя миллилитров 10%FBS в DMEM. Перейти смесь на 70-микрометровый ситечко, чтобы удалить любые неразобщенных эмбриональных тел, и осадок фильтрованных клеток центрифугации.Чтобы сортировать CPCs по их флуоресцентное выражение репортера, повторно гранулы в 500 микролитров FACS решение и фильтровать клетки через 40-микрометровый ситечко клеток в пятими миллилитр полистирола круглого дна трубки на льду. Затем сортировать клетки, чтобы изолировать RFP-и GFP-экспрессинговых клеток FACS, собирая клетки в один миллилитр FBS. Чтобы изолировать первый по сравнению со вторым сердцем поле CPCs на основе их поверхностного белка Cxcr4 выражение, resuspend одной мыши эмбриональной стволовой клетки RFP-экспрессирующих сердечных клеток прародителя в 300 микролитров 10%FBS в PBS дополнен флуоресценции конъюгированных анти-Cxcr4 антитела.После пяти минут при комнатной температуре, мыть клетки три раза в один-два миллилитров свежих, холодных PBS за стирку. После последней стирки, повторное стечь клетки в 500 микролитров раствора FACS и фильтровать клетки через 40-микрометровый ситечко в пятими миллилитров, круглое дно трубки. Затем сортировать клетки по их выражению Cxcr4, собирая как Cxcr4-положительных и отрицательных популяций в отдельных труб, содержащих один миллилитр FPS на трубку на льду.Для того чтобы re-culture FACS-изолированные, сердце поле-специфические клетки heartdiac progenitor, собирают сортированные клетки центрифугацией и resuspend гранулы в среде SFD. Затем семена примерно в три раза 10 до четырех клеток на колодец в 0,1%желатина покрытием, 384-хорошо пластины. Если повышенная гибель клеток отмечается после сортировки, добавьте 10-микромолярный ингибитор ROCK к каждой колодец.После двух дней культуры следует наблюдать спонтанное избиение. Чтобы проанализировать способность потроханные КПК дифференцироваться к кардиомиоцитам, соберите клетки в день 12 дифференциации с трипсином, как попродемонстрировано, чтобы изолировать одиночные кардиомиоциты и повторно использовать клетки в 4%paraformaldehyde. После 30 минут при комнатной температуре, собирать фиксированные клетки центрифугации и мыть гранулы в PBS, чтобы удалить избыток фиксации.Далее, повторное использование клеток в 10%FBS в PBS, и инкубировать половину образца клетки с мышью антитропонин T антитела и использовать другую половину образца в качестве отрицательного контроля. После 30 минут при комнатной температуре, мыть клетки два раза в свежем PBS и повторно образцы в 10%FBS плюс PBS дополняется соответствующим вторичным антителом. После еще одной 30-минутной инкубации при комнатной температуре, мыть клетки два раза в свежем PBS за стирку и повторного анализа клеток в 200 микролитров PBS на трубку для анализа на поток цитометра.Примерно через 132 часа дифференциации клетки-предшественники tbx1-RFP и Hcn4-GFP могут быть обнаружены с помощью микроскопии флуоресценции. Как правило, клетки GFP и RFP появляются примерно в одно и то же время, и две популяции клеток-предшественников продолжают расширяться в непосредственной близости и, как правило, в дополнительной модели. Корректировка концентраций активина А и костного морфогенетического белка четыре изменит процент первого по сравнению со вторым сердечным полем сердечных клеток-предшественников.Аналогичным образом, используя RFP репортер мыши эмбриональной линии стволовых клеток, после 132 часов дифференциации, RFP-положительные клетки-предшественники сердца появляются. После иммуностимпонирования для Cxcr4, RFP-положительных, Cxcr4-положительных и RFP-положительных, Cxcr4-отрицательные клетки могут быть изолированы. Иммуностимулятор для сердечного тропонина Т на 12-й день дифференциации подтверждает, что первые клетки сердечного поля дифференцируются в основном в миоциты.Аналогичным образом, клетки, полученные из RFP-положительных, Cxcr4-отрицательных клеток-предшественников сердца, дают результат кардиомиоцитов на гораздо более высоких процентах по сравнению с одиночными положительными клетками-предшественниками сердца Cxcr4. Иногда эмбриональные стволовые клетки мыши не могут эффективно дифференцироваться и образуют очень низкое количество клеток-предшественников сердца. Сроки, концентрация и консистенция добавления цитокинов и количество клеток имеют решающее значение для успешного поколения камерных клеток-предшественников сердца.После этой процедуры, исследователи могут проанализировать физиологические свойства различных популяций клеток-предшественников сердца, чтобы получить дальнейшее представление об их спецификации и функции.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Вывод сердца клеток-предшественников из эмбриональных стволовых клеток

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Генерация мышиный кардиостимулятор клеточных агрегатов на основе ES-Cell-программирования в комбинации с Myh6-промоутер-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Инициирование дифференциация в увековечена МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ ушные клетки-предшественники

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Колонии Assays Характеризуя Tri-сильнодействующие прогениторных клеток , выделенных из мышиной поджелудочной железы для взрослых

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Гипоксическое предварительное кондиционирование клеток-предшественников, полученных из костного мозга, в качестве источника для генерации зрелых клеток Шванна

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Анализ количественного состава Гора иммунофлюоресценции сердечной прародитель населения в эмбрионов мыши

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Разработка в Vitro Assay чтобы Quantitate гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) в развитии эмбрионов у рыбок данио

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Создание первого поля как сердце сердца прародителями и кардиомиоцитов желудочков как от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Индукция эндотелиальной дифференцировки в клетках сердечной Progenitor в условиях низкой сыворотки

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...