Name: in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

E. T. fue apoyado por The Magic That Matters y AHA. C. K. fue apoyado por las concesiones de NICHD/NIH (R01HD086026), AHA y MSCRF.

NOTA: Generación in vitro de células progenitoras cardíacas de ratón específicas del campo cardíaco (Figura1).
1. Mantenimiento de esCs de ratón
<ol><li>Cultivar mESCs (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP, mESCIsl1-RFP)25 on 0.1% (w/v) frascos T25 recubiertos de gelatina en 2i medio (870 mL de medio esencial glascow (GMEM), 100 mL de suero bovino fetal (FBS), 10 mL de GlutaMAX,...

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li><li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+cardiomyocyte.">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li><li>Birket, M. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+cardiovascular+progenitors--a+developmental+perspective.">Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective.</a> Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient.">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Atrial+and+Ventricular+Cardiomyocytes+Develop+from+Distinct+Mesoderm+Populations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Galdos, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Regeneration:+Lessons+From+Development.">Cardiac Regeneration: Lessons From Development.</a> Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).</li><li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lineage+restriction+in+temporally+distinct+populations+of+Mesp1+progenitors+during+mammalian+heart+development.">Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development.</a> Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+networks+in+heart+development+and+regeneration.">Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).</li><li>Bruneau, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber-specific+cardiac+expression+of+Tbx5+and+heart+defects+in+Holt-Oram+syndrome.">Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.</a> Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+gene+regulation+in+the+second+heart+field+by+Tbx1,+Nkx2-5,+and+Islet1+reveals+a+genetic+switch+for+down-regulation+in+the+myocardium.">Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).</li><li>Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fate+map+of+Tbx1+expressing+cells+reveals+heterogeneity+in+the+second+cardiac+field.">A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field.</a> Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+Distinct+Six2-Positive+Second+Heart+Field+Progenitors+Regulate+Mammalian+Heart+Development+and+Disease.">Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease.</a> Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+neonatal+rat+system+as+a+bioincubator+to+generate+adult-like+mature+cardiomyocytes+from+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells.">Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).</li><li>Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+heart+disease:+entering+a+new+era+of+human+genetics.">Congenital heart disease: entering a new era of human genetics.</a> Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome.">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAND1+loss-of-function+mutation+contributes+to+congenital+double+outlet+right+ventricle.">HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells.">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, 02164 (2014).</li><li>Morita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall1+transiently+marks+undifferentiated+heart+precursors+and+regulates+their+fate.">Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326 (5951), 426-429 (2009).</li></ol>

En nuestro protocolo, describimos una metodología para generar esferoides cardíacos y CPC específicos del campo cardíaco aislado. Estos se pueden utilizar para estudiar los mecanismos de especificación de CPC y sus propiedades, así como para el modelado de enfermedades específicas de la cámara cardíaca. Un trabajo publicado anteriormente utilizó una línea mESC con dos reporteros fluorescentes (Mef2c/Nkx2.5) para estudiar cardiogénesis in vitro, sin embargo, ambos marcadores se expresan en el día embrionario ...

El uso de células madre pluripotentes (PSC) ha revolucionado el campo de la regeneración cardíaca y la medicina personalizada con miocitos específicos del paciente para el modelado de enfermedades y terapias farmacológicas1,2,3, 4. Más recientemente, se han desarrollado protocolos in vitro para la generación de cardiomiocitos derivados de la PSC auricular es adictivo y similares a marcapasos, 5,6. Sin embargo, aún no está claro si la cardiogénesis puede recrearse in vitro para estudiar el desarrollo cardíaco y, posteriormente, generar células cardíacas específicas de la cámara ventricular.
Durante el desarrollo embrionario temprano, las células mesodérmicas bajo la influencia de morógenos secretados como BMP4, Wnts y Activin A forman la racha primitiva7. Células mesodermales cardíacas marcadas por la expresión de Mesp1, migran antes y más bien para formar la media luna cardiaca y luego el tubo cardíaco primitivo7,8. Este grupo migratorio de células incluye dos poblaciones muy distintas de células progenitoras cardíacas (CPC), a saber, el primer y segundo campo cardíaco (FHF y SHF)9,10. Las células del SHF son altamente proliferativas y migratorias y son las principales responsables del alargamiento y bucle del tubo cardíaco. Además, las células SHF se diferencian a cardiomiocitos, fibroblastos, músculo liso y células endoteliales a medida queentran en el tubo cardíaco para formar el ventrículo derecho, tracto de salida ventricular derecha y gran parte de ambas aurículas 7,10. Por el contrario, las células FHF son menos proliferativas y migratorias y se diferencian principalmente a los cardiomiocitos, ya que dan lugar al ventrículo izquierdo y a una parte más pequeña de la aurícula11. Además, los progenitores SHF están marcados por la expresión de Tbx1, FGF8, FGF10 y Six2, mientras que las células FHF expresan Hcn4 y Tbx511,12,13,14,15.
Los PSC pueden diferenciarse a las tres capas germinales y posteriormente a cualquier tipo de célula en el cuerpo4,16. Por lo tanto, ofrecen un enorme potencial para entender el desarrollo del corazón y para modelar defectos específicos del desarrollo que resultan en enfermedades cardíacas congénitas, la causa más frecuente de defectos congénitos17. Un gran subgrupo de cardiopatía congénita incluye anomalías cardíacas específicas de la cámara18,19. Sin embargo, todavía no está claro si estos se originan en el desarrollo anómalo del campo del corazón. Además, dada la incapacidad de los cardiomiocitos para proliferar después del nacimiento, se han realizado grandes esfuerzos para crear tejido cardíaco para la regeneración cardíaca1,7,20. Teniendo en cuenta las diferencias fisiológicas y morfológicas entre las cámaras cardíacas, la generación de tejido cardíaco específico de la cámara utilizando PsCs es de importancia significativa. Si bien los recientes avances en cardiología del desarrollo han llevado a una generación robusta de células cardíacas a partir de PSC, todavía no está claro si los dos campos cardíacos pueden ser inducidos en los sistemas PSC.
Para recapitular la cardiogénesis in vitro y estudiar las especificaciones y propiedades de los CPC, anteriormente utilizamos un sistema basado en la diferenciación de esferoides cardíacos derivados de PSC21,22,23,24. Recientemente, generamos células madre embrionarias de ratón (mESC) con reporteros de GFP y RFP bajo el control del gen DeFHcn4 y el gen SHF Tbx1, respectivamente (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. Los mESC diferenciados in vitro formaron esferoides cardíacos en los que las células GFP+ y RFP+ aparecieron de dos áreas distintas de células mesodeérmicas y se modelaron de manera complementaria. Las células GFP+ y RFP+ resultantes mostraron características de FHF y SHF, respectivamente, determinadas por la secuenciación del ARN y los análisis clonales. Es importante destacar que, utilizando mESC que transporta el reportero Isl1-RFP (mESCIsl1-RFP),descubrimos que las células SHF estaban marcadas fielmente por la proteína de superficie celular CXCR4, y esto puede permitir el aislamiento de células específicas del campo cardíaco sin transgenes. El presente protocolo describirá la generación y el aislamiento de cPC específicos en el campo cardíaco de los mESC, que pueden servir como una herramienta valiosa para estudiar las cardiopatías específicas de la cámara.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1251px;" width="1250">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.1% (w/v) Gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100X Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1X PBS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40&#956;m cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td align="right">35223</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Activin A</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>338-AC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 minus vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BMP4</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:245px;">Sony</td>
			<td style="width:344px;">SH800</td>
			<td style="width:241px;">Sony or any other fluorescence-activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell strainer 70&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge Sorvall Legend XT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">75004508</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CHIR99021</td>
			<td>Selleck chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">51030285</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Corning Ultra Low Attachment T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Countless II FL automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571, Lot #1757130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium high glucose (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ESGRO (LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EVOS FL microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glasgow&#8217;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monothioglycero (MTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MS-295-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acid solution (NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suspension culture dish 150 mm x 25mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE (Trypsin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td align="right">72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells

Las células madre pluripotentes ofrecen un gran potencial para entender el desarrollo del corazón y las enfermedades y para la medicina regenerativa. Si bien los recientes avances en la cardiología del desarrollo han llevado a generar células cardíacas a partir de células madre pluripotentes, no está claro si los dos campos cardíacos -el primer y segundo campo cardíaco (FHF y SHF)- se inducen en sistemas de células madre pluripotentes. Para abordar esto, generamos un protocolo para la especificación in vitro y el aislamiento de células progenitoras cardíacas específicas del campo cardíaco. Utilizamos líneas de células madre embrionarias que llevan Hcn4-GFP y Tbx1-Cre; Los reporteros de Rosa-RFP de la FHF y la SHF, respectivamente, y la inmunomancha de células vivas de la proteína de membrana celular Cxcr4, un marcador de SHF. Con este enfoque, generamos células progenitoras que recapitulan las propiedades funcionales y el transcriptoma de sus contrapartes in vivo. Nuestro protocolo se puede utilizar para estudiar la especificación temprana y la segregación de los dos campos cardíacos y para generar células cardíacas específicas de la cámara para el modelado de enfermedades cardíacas. Dado que se trata de un sistema organoide in vitro, es posible que no proporcione información anatómica precisa. Sin embargo, este sistema supera la escasa accesibilidad de los embriones en etapa de gastrulación y se puede ampliar para pantallas de alto rendimiento.

Después de aproximadamente 132 h de diferenciación, los CPC Tbx1-RFP y Hcn4-GFP se pueden detectar utilizando un microscopio fluorescente (Figura2). Generalmente, las células GFP y RFP aparecen aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente alrededor del mismo tiempo. Las dos poblaciones de CPC continúan expandiéndose en estrecha proximidad y comúnmente en un patrón complementario. El ajuste de las concentraciones de Activin A y BMP4 alterará los porc...

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In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

El propósito de este método es generar células progenitoras cardíacas específicas del campo cardíaco in vitro con el fin de estudiar la especificación de la célula progenitora y las propiedades funcionales, y para generar células cardíacas específicas de la cámara para el modelado de enfermedades del corazón.

In Vitro Generación de Células Progenitoras Cardíacas específicas de Mouse Field

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Nuestro método tiene como objetivo generar células progenitoras cardíacas específicas del campo cardíaco a partir de células madre embrionarias de ratón. Esta línea de células madre reportera de campo cardíaco permite el estudio de alto rendimiento de los mecanismos subyacentes a la cardiopatía congénita, proporcionando un sistema que es susceptible de manipulación genética y farmacológica. Existen varias enfermedades cardíacas congénitas específicas de la cámara.Mediante la recapitulación de la cardiogénesis in vitro, este protocolo permite el estudio del mecanismo de la enfermedad y el desarrollo de futuras terapias regenerativas. Este protocolo puede proporcionar información sobre cómo se especifican las células progenitoras cardíacas de diferentes cámaras durante el desarrollo cardíaco. Comience por el cultivo de células madre embrionarias de ratón transgénicos en matraces T25 recubiertos con gelatina al 0,1%en un medio 2i.Cuando las células alcancen el 70 al 80%confluencia, enjuague los cultivos con PBS y agregue un mililitro de trippsina por matraz para disociar el cultivo en células individuales a 37 grados centígrados durante tres minutos. Cuando las células se hayan desprendido, neutralice la reacción con cuatro mililitros 10 FBS en DMEM y cuente las células por un método adecuado. Diluir las células a aproximadamente tres veces 10 a las cinco células por concentración media fresca, y recoger las células por centrifugación.A continuación, resuspender el pellet en cinco mililitros de medio 2i fresco para replating en nuevos matraces T25 recubiertos con gelatina 0.1%. Para la generación de CPC a partir de esferoides cardíacos, recoger 2,5 veces 10 a los seis de la muestra de célula madre embrionaria de ratón transgénico desprendido por centrifugación, y resuspend las células en 25 mililitros de medio SFD. Placa la suspensión celular en una placa estéril de 150 por 25 milímetros para incubación a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante 48 horas.Al final de la incubación, recoger los esferoides cardíacos en un tubo cónico. Sedimentar los esferoides por centrifugación para facilitar el aislamiento selectivo de los esferoides y evitar células individuales. Resuspender los esferoides en 25 mililitros de medio SFD fresco complementado con un nanogratro por mililitro de activin A y 1,5 nanogramos por mililitro de proteína morfogenética ósea cuatro.Vuelva a encaminar los esferoides en la misma placa de cultivo para una incubación de 24 horas en la incubadora de cultivo celular. Al día siguiente, recuerde todos los esferoides cardíacos por centrifugación. Resuspender los cuerpos embrionados diferenciados en 25 mililitros de medio SFD fresco para el enchapado en un matraz ultrabajo, matraz cuadrado de 75 centímetros en la incubadora de cultivo celular durante 48 horas.Para el aislamiento del CPC específico del campo cardíaco utilizando reporteros fluorescentes, recoja los cuerpos embrionados por centrifugación y disocia las culturas 3D con un mililitro de tripsina a 37 grados centígrados durante tres minutos. Al final de la incubación, mezclar bien por pipeteo para disociar las células y neutralizar la reacción con cuatro mililitros de 10%FBS en DMEM. Pasar la mezcla sobre un colador de 70 micrómetros para eliminar los cuerpos embrionados no disociados, y sedimentar las células filtradas por centrifugación.Para ordenar las CPC por su expresión fluorescente de reportero, resuspendir el pellet en 500 microlitros solución FACS y filtrar las células a través de un colador celular de 40 micrómetros en un tubo de fondo redondo de poliestireno de cinco mililitros sobre hielo. Luego ordene las células para aislar las células que expresan RFP y GFP por FACS, recogiendo las células en un mililitro de FBS. Para aislar los CPC de campo cardíaco primero frente al segundo basado en su expresión Cxcr4 de proteína superficial, resuspendir células madre embrionarias de ratón único células madre rfp-expresas células progenitoras en 300 microlitros de 10%FBS en PBS complementados con anticuerpo anti-Cxcr4 conjugado con fluorescencia.Después de cinco minutos a temperatura ambiente, lave las células tres veces en uno o dos mililitros de PBS fresco y frío por lavado. Después del último lavado, resuspender las células en 500 microlitros de solución FACS y filtrar las células a través de un colador de 40 micrómetros en un tubo de cinco mililitros, de fondo redondo. Luego ordene las células por su expresión Cxcr4, recogiendo las poblaciones Cxcr4 positivas y negativas en tubos individuales que contienen un mililitro de FPS por tubo en hielo.Para re-cultivar las células progenitoras cardíacas aisladas por FACS, específicas del campo cardíaco, recoja las células ordenadas por centrifugación y resusppend los pellets en medio SFD. Luego sembrar aproximadamente tres veces 10 a las cuatro células por pozo en un 0.1%recubierto de gelatina, placa de 384 pozos. Si se observa un aumento de la muerte celular después de la clasificación, agregue el inhibidor de ROCK de 10 micromolares a cada pozo.Después de dos días de cultivo, se debe observar la paliza espontánea. Para analizar la capacidad de los CPC chapados para diferenciarse a los cardiomiocitos, recoja las células en el día 12 de diferenciación con tripina, como se ha demostrado, para aislar los cardiomiocitos individuales y resuspender las células en 4%paraformaldehído. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, recoger las células fijas por centrifugación y lavar el pellet en PBS para eliminar el exceso de fijador.A continuación, resuspender las células en 10%FBS en PBS, e incubar la mitad de la muestra celular con anticuerpos anti-troponina T de ratón y utilizar la otra mitad de la muestra como un control negativo. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, lave las células dos veces en PBS fresco y resuspendir las muestras en 10%FBS más PBS complementado con un anticuerpo secundario apropiado. Después de otra incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, lave las células dos veces en PBS fresco por lavado y resuspendir las células en 200 microlitros de PBS por tubo para su análisis en un citómetro de flujo.Después de aproximadamente 132 horas de diferenciación, las células progenitoras cardíacas Tbx1-RFP y Hcn4-GFP pueden detectarse mediante microscopía de fluorescencia. Generalmente, las células GFP y RFP aparecen aproximadamente alrededor del mismo tiempo, y las dos poblaciones de células progenitoras continúan expandiéndose en proximidad y típicamente en un patrón complementario. Ajustar las concentraciones de activin A y la proteína morfogenética ósea cuatro alterará los porcentajes de células progenitoras cardíacas del primer campo cardíaco frente a las células progenitoras cardíacas del segundo campo cardíaco.Del mismo modo, utilizando una línea de células madre embrionarias de ratón reportero RFP, después de 132 horas de diferenciación, aparecen células progenitoras cardíacas positivas RFP. Después de la inmunostaining para Cxcr4, RFP-positivo, Cxcr4-positivo, y RFP-positivo, las células Cxcr4-negativas se pueden aislar. La inmunostaining para la troponina cardiaca T en el día 12 de diferenciación confirma que las células del primer campo cardíaco se diferencian principalmente en miocitos.Del mismo modo, las células derivadas de RFP positivo, las células progenitoras cardíacas Cxcr4 negativas dan lugar a cardiomiocitos en porcentajes mucho más altos en comparación con las células progenitoras cardíacas positivas únicas cxcr4. Ocasionalmente, las células madre embrionarias de ratón no se diferencian eficientemente y forman un número muy bajo de células progenitoras cardíacas específicas del campo cardíaco. El momento, la concentración y la consistencia de la adición de las citoquinas y el número de células son críticos para una generación exitosa de células progenitoras cardíacas específicas de la cámara.Después de este procedimiento, los investigadores pueden analizar las propiedades fisiológicas de las diferentes poblaciones de células progenitoras cardíacas para obtener más información sobre su especificación y función.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Derivación de células cardiacas progenitoras a partir de células madre embrionarias

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Generación de murino cardíaca marcapasos celulares Agregados Basado en ES-Cell-Programación en combinación con MYH6-promotor-Selección

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Iniciando Diferenciación en inmortalizadas células pluripotentes Otic Progenitoras

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Los ensayos in vitro de colonias para la caracterización de células progenitoras Tri-potentes Aislado de los murinos adultos Páncreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Precondicionamiento hipóxico de las células progenitoras derivadas de la médula como fuente para la generación de células maduras de Schwann

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Desarrollo de un ensayo In Vitro para cuantificar Progenitor y vástago hematopoyética células (HSPCs) en el desarrollo de embriones de pez cebra

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generación del primer corazón campo-como progenitores cardiaca y Ventricular como cardiomiocitos desde células madre humanas pluripotentes

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Inducción de la diferenciación endotelial en las células cardiacas progenitoras en suero bajo condiciones

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...