Name: in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

E. T. stöddes av The Magic that Matters och AHA. C. K. stöddes av bidrag från NICHD/NIH (R01HD086026), AHA, och MSCRF.

Anmärkning: In vitro-generering av hjärt fält-specifika mus hjärt stamceller celler (figur 1).
1. underhåll av mus-ESCs
<ol><li>Odla mESCs (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP, mescISL1-RFP)25 på 0,1% (vikt/volym) gelatinbelagda T25 kolvar i 2i medium (870 ml av glascow minimum viktigt medium (Gmem), 100 ml av fetalt bovint serum (FBS), 10 mL glutamax, 10 ml icke-essentiella ami...

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li><li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+cardiomyocyte.">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li><li>Birket, M. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+cardiovascular+progenitors--a+developmental+perspective.">Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective.</a> Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient.">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Atrial+and+Ventricular+Cardiomyocytes+Develop+from+Distinct+Mesoderm+Populations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Galdos, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Regeneration:+Lessons+From+Development.">Cardiac Regeneration: Lessons From Development.</a> Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).</li><li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lineage+restriction+in+temporally+distinct+populations+of+Mesp1+progenitors+during+mammalian+heart+development.">Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development.</a> Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+networks+in+heart+development+and+regeneration.">Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).</li><li>Bruneau, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber-specific+cardiac+expression+of+Tbx5+and+heart+defects+in+Holt-Oram+syndrome.">Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.</a> Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+gene+regulation+in+the+second+heart+field+by+Tbx1,+Nkx2-5,+and+Islet1+reveals+a+genetic+switch+for+down-regulation+in+the+myocardium.">Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).</li><li>Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fate+map+of+Tbx1+expressing+cells+reveals+heterogeneity+in+the+second+cardiac+field.">A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field.</a> Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+Distinct+Six2-Positive+Second+Heart+Field+Progenitors+Regulate+Mammalian+Heart+Development+and+Disease.">Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease.</a> Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+neonatal+rat+system+as+a+bioincubator+to+generate+adult-like+mature+cardiomyocytes+from+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells.">Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).</li><li>Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+heart+disease:+entering+a+new+era+of+human+genetics.">Congenital heart disease: entering a new era of human genetics.</a> Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome.">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAND1+loss-of-function+mutation+contributes+to+congenital+double+outlet+right+ventricle.">HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells.">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, 02164 (2014).</li><li>Morita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall1+transiently+marks+undifferentiated+heart+precursors+and+regulates+their+fate.">Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326 (5951), 426-429 (2009).</li></ol>

I vårt protokoll beskriver vi en metodik för att generera kardiella sfäroider och isolerade hjärtfältspecifika CPCs. Dessa kan användas för att studera mekanismer för CPC-specifikation och deras egenskaper, samt för kardiell kammarspecifik sjukdoms modellering. Ett tidigare publicerat arbete används en mesc linje med två fluorescerande reportrar (Mef2c/NKX 2.5) att studera cardiogenesis in vitro, emellertid, båda dessa markörer uttrycks vid embryonal dag 9.5-10 när hjärt muskel celler redan bildas<sup clas...

Användningen av pluripotenta stamceller (PSCs) har revolutionerat området för hjärt förnyelse och personlig medicin med patientspecifika myocyter för sjukdoms modellering och läkemedels terapier1,2,3, 4. mer nyligen, in vitro-protokoll för generering av förmaksflimmer vs ventrikulär liksom pacemaker-liknande PSC-härledda hjärt muskel celler har utvecklats5,6. Emellertid, om cardiogenesis kan återskapas in vitro för att studera hjärt utveckling och därefter generera ventrikulära kammarspecifika hjärt celler är fortfarande oklart.
Under tidig embryonal utveckling, mesodermala celler under påverkan av utsöndras morfogener såsom BMP4, Wnts och Activin en form primitiva strimma7. Kardiella mesodermala celler som kännetecknas av uttrycket av Mesp1, migrera anteriorly och senare för att bilda den kardiella halv månen och sedan primitiva hjärta röret7,8. Denna flyttande grupp av celler innehåller två mycket distinkta populationer av hjärt stamceller (CPCS), nämligen det första och det andra hjärt fältet (fhf och SHF)9,10. Celler från SHF är mycket proliferativa och flyttande och är primärt ansvariga för töjning och looping av hjärt röret. Dessutom, SHF celler differentiera till cardiomyocytes, fibroblaster, glatt mus kula tur och endotelceller som de in i hjärtat röret för att bilda höger kammare, höger kammare utflöde tarm kanalen och stor del av både Atria7,10. Däremot är FHF-celler mindre proliferativa och flyttande och differentierar främst till cardiomyocyter eftersom de ger upphov till vänster kammare och en mindre del av Atria11. Dessutom kännetecknas SHF-progenitorerna av uttrycket Tbx1, FGF8, FGF10 och Six2 medan fhf-celler uttrycker Hcn4 och Tbx511,12,13,14,15.
PSCs kan differentiera till alla tre köns lagren och därefter till vilken cell typ som helst i kroppen4,16. Därför, de erbjuder en enorm potential för att förstå hjärt utveckling och för modellering specifika utvecklingsdefekter som resulterar i kon geni tal hjärt sjukdom, den vanligaste orsaken till foster skador17. En stor under grupp av kon geni tal hjärt sjukdom inkluderar kammarspecifika hjärt avvikelser18,19. Emellertid, det fortfarande oklart om dessa kommer från avvikande hjärt fält utveckling. Dessutom, med tanke på oförmågan av hjärt muskel celler att förökar sig efter födseln, det har varit omfattande ansträngningar för att skapa hjärt vävnad för hjärt förnyelse1,7,20. Med tanke på de fysiologiska och morfologiska skillnaderna mellan hjärtats kammare, är generering av kammarspecifik hjärt vävnad med PSCs av stor betydelse. Även om de senaste framstegen inom utveckling kardiologi har lett till en robust generation av hjärt celler från PSC, är det fortfarande oklart om de två hjärt fält kan induceras i KUSP-system.
För att upprepa cardiogenesis in vitro och studera specifikationen och egenskaperna hos CPCS, vi tidigare använt ett system baserat på differentiera PSC-derived kardiella sfäroider21,22,23,24. Nyligen genererade vi mus embryonala stamceller (mESCs) med GFP och RFP reportrar under kontroll av FHF genen Hcn4 och SHF genen Tbx1, respektive (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. In vitro differentierade mESCs bildade hjärt sfäroider där GFP + och RFP + celler dök upp från två distinkta områden av mesodermala celler och mönstrade på ett komplementärt sätt. De resulterande GFP +-och RFP +-cellerna uppvisade FHF-och SHF-egenskaper, respektive bestämdes av RNA-sekvensering och klon analyser. Viktigt, med hjälp av mESCs redovisade Isl1-RFP reporter (mESCIsl1-RFP), upptäckte vi att SHF celler troget präglades av cell-ytan protein CXCR4, och detta kan möjliggöra isolering av hjärt fält-specifika celler utan transgenes. Detta protokoll kommer att beskriva generering och isolering av hjärt fält-specifika CPCs från mESCs, som kan fungera som ett värdefullt verktyg för att studera kammarspecifik hjärt sjukdom.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1251px;" width="1250">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.1% (w/v) Gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100X Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1X PBS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40&#956;m cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td align="right">35223</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Activin A</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>338-AC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 minus vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BMP4</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:245px;">Sony</td>
			<td style="width:344px;">SH800</td>
			<td style="width:241px;">Sony or any other fluorescence-activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell strainer 70&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge Sorvall Legend XT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">75004508</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CHIR99021</td>
			<td>Selleck chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">51030285</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Corning Ultra Low Attachment T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Countless II FL automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571, Lot #1757130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium high glucose (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ESGRO (LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EVOS FL microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glasgow&#8217;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monothioglycero (MTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MS-295-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acid solution (NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suspension culture dish 150 mm x 25mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE (Trypsin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td align="right">72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells

Pluripotenta stamceller erbjuder stor potential för att förstå hjärt utveckling och sjukdom och för regenerativ medicin. Även om de senaste framstegen inom utveckling kardiologi har lett till att generera hjärt celler från pluripotenta stamceller, är det oklart om de två hjärt fält-den första och andra hjärt fält (FHF och SHF)-induceras i pluripotenta stamceller system. För att ta itu med detta genererade vi ett protokoll för in vitro-specifikation och isolering av hjärtfältspecifika hjärt stamceller. Vi använde embryonala stamcells linjer som transporterar Hcn4-GFP och Tbx1-CRE; Rosa-RFP reportrar av FHF och SHF, respektive, och levande cell immunofärgning av cell membranet protein Cxcr4, en SHF markör. Med detta tillvägagångs sätt genererade vi stamceller som rekapitulera de funktionella egenskaper och transkriptome av deras in vivo motsvarigheter. Vårt protokoll kan användas för att studera tidig specifikation och segregering av de två hjärt fälten och för att generera kammarspecifika hjärt celler för modellering av hjärt sjukdomar. Eftersom detta är ett in vitro-organoidsystem, kan det inte ge exakt anatomisk information. Men detta system övervinner dålig till gång till gastrulation Stadium embryon och kan skalas för hög genom strömning skärmar.

Efter ca 132 h differentiering, kan Tbx1-RFP och Hcn4-GFP CPCs detekteras med hjälp av ett fluorescerande Mikroskop (figur 2). I allmänhet visas GFP-och RFP-cellerna ungefär ungefär samma tid. De två populationerna av CPCs fortsätter att expandera i nära närhet och ofta i ett komplementärt mönster. Genom att justera koncentrationerna av Activin A och BMP4 ändras procent satserna för FHF vs SHF-CPCs (figur 3). CPC-specifikationen in vitro bestämdes f...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Syftet med denna metod är att generera hjärt-specifika hjärt stamceller in vitro för att studera stamceller specifikation och funktionella egenskaper, och att generera kammarspecifika hjärt celler för hjärt sjukdom modellering.

In vitro generation av mus hjärta fält-specifika hjärt progenitor celler

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Vår metod syftar till att generera hjärtfältspecifika hjärtprogenitorceller från stamceller från mus embryonala. Detta hjärta fält reporter stamcellslinje möjliggör hög genomströmning studie av de mekanismer som ligger bakom medfödd hjärtsjukdom, vilket ger ett system som är mottagliga för genetisk och farmakologisk manipulation. Det finns flera kammarspecifika medfödda hjärtsjukdomar.Genom rekapitulering cardiogenesis in vitro, detta protokoll tillåter studier av sjukdomsmekanism och utveckling av framtida regenerativa terapier. Detta protokoll kan ge insikt i hur hjärt progenitor celler av olika kammare specificeras under hjärtutveckling. Börja med att odla transgena mus embryonala stamceller i 0,1%gelatin-belagda T25 kolvar i 2i medium.När cellerna når 70 till 80%sammanflödet, skölj kulturerna med PBS och tillsätt en milliliter trypsin per kolv för att dissociate kulturen i enstaka celler vid 37 grader Celsius i tre minuter. När cellerna har lossnat, neutralisera reaktionen med fyra milliliter 10 FBS i DMEM och räkna cellerna med en lämplig metod. Späd cellerna till en cirka tre gånger 10 till de fem cellerna per färsk medelkoncentration, och samla cellerna genom centrifugeringen.Sedan återanvänder du pelleten i fem milliliter färskt 2i medium för replating på nya 0,1%gelatinbelagda T25-kolvar. För CPC generation från hjärt sfäroider, samla in 2,5 gånger 10 till sex av de fristående transgena mus embryonala stamceller prov genom centrifugeringen, och resuspend cellerna i 25 milliliter av SFD medium. Platta cellupphängningen i en 150-av-25-millimeters steril platta för inkubering vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid i 48 timmar.Vid slutet av inkubationen, samla in hjärtsfäroiderna i ett koniskt rör. Sedimentera sfäroiderna genom centrifugeringen för att underlätta den selektiva isoleringen av sfäroiderna och för att undvika enstaka celler. Resuspend spheroids i 25 milliliter av färskt SFD medium kompletteras med ett nanogram per milliliter av activin A och 1,5 nanogram per milliliter ben morphogenetic protein fyra.Replate spheroids tillbaka på samma odlingsplatta för en 24-timmars inkubation i cellkulturen inkubatorn. Nästa dag, minns alla hjärtsfäroider genom centrifugeringen. Resuspend de differentierade embryoid organ i 25 milliliter av färskt SFD medium för plätering i en ultra-låg fastsättning, 75-centimeter kvadratkolv i cellkulturen inkubatorn i 48 timmar.För isolering av hjärtfältspecifik CPC med hjälp av fluorescerande reportrar, samla embryoidkropparna genom centrifugation och dissociate 3D-kulturerna med en milliliter trypsin vid 37 grader Celsius i tre minuter. Vid inkubationens, blanda väl genom pipettering för att separera cellerna och neutralisera reaktionen med fyra milliliter på 10%FBS i DMEM. Skicka blandningen över en 70-mikrometer sil för att avlägsna eventuella icke-dissocierade embryoidkroppar, och sediment de filtrerade cellerna genom centrifugeringen.För att sortera CPCs genom deras fluorescerande reporter uttryck, resuspend pelleten i 500 mikroliter FACS lösning och filtrera cellerna genom en 40-mikrometer cell sil i en fem-milliliter polystyren rund-botten rör på is. Sortera sedan cellerna för att isolera CELLERNA RFP-och GFP-uttryck genom FACS, samla cellerna i en milliliter av FBS. För att isolera första kontra andra hjärt fältet CPCs baserat på deras yta protein Cxcr4 uttryck, resuspend enda mus embryonala stamceller RFP-uttrycker hjärt stamceller celler i 300 mikroliter av 10%FBS i PBS kompletteras med fluorescens-conjugated anti-Cxcr4 antikropp.Efter fem minuter i rumstemperatur, tvätta cellerna tre gånger i en till två milliliter färsk, kall PBS per tvätt. Efter den sista tvätten, resuspend cellerna i 500 mikroliter av FACS lösning och filtrera cellerna genom en 40-mikrometer sil i en fem-milliliter, rund-botten rör. Sortera sedan cellerna efter deras Cxcr4-uttryck, samla både Cxcr4-positiva och negativa populationer i enskilda rör som innehåller en milliliter FPS per rör på is.För att återodling av FACS-isolerade, hjärtfältspecifika hjärtprogenitorceller samlar du in de sorterade cellerna genom centrifugering och återanvänder pelletsen i SFD-medium. Sedan utsäde ungefär tre gånger 10 till de fyra cellerna per brunn i en 0,1%gelatin-belagda, 384-brunns platta. Om ökad celldöd noteras efter sortering, tillsätt 10-mikromolar ROCK-hämmare till varje brunn.Efter två dagars kultur ska spontant svävning observeras. För att analysera förmågan hos pläterade CPCs att differentiera till kardiomyocyter, samla in cellerna på dag 12 av differentiering med trypsin, som visat, att isolera de enda kardiomyocyter och resuspend cellerna i 4%paraformaldehyd. Efter 30 minuter i rumstemperatur, samla de fasta cellerna genom centrifugering och tvätta pelleten i PBS för att avlägsna det överskott fixativa.Därefter resuspend cellerna i 10%FBS i PBS, och inkubera hälften av cellprovet med mus anti-troponin T antikropp och använda den andra halvan av provet som en negativ kontroll. Efter 30 minuter i rumstemperatur tvättar du cellerna två gånger i färsk PBS och återanvänder proverna i 10%FBS plus PBS kompletterat med en lämplig sekundär antikropp. Efter ytterligare 30-minuters inkubation vid rumstemperatur, tvätta cellerna två gånger i färsk PBS per tvätt och resuspend cellerna i 200 mikroliter pbs per rör för analys på ett flöde cytometer.Efter cirka 132 timmars differentiering kan Tbx1-RFP och Hcn4-GFP hjärt progenitor celler detekteras av fluorescensmikroskopi. Generellt visas både GFP- och RFP-celler ungefär ungefär samtidigt, och de två populationerna av progenitorceller fortsätter att expandera i närheten och typiskt i ett kompletterande mönster. Justering av koncentrationerna av activin A och benmorfogande protein fyra kommer att förändra procentsatserna för första kontra andra hjärtfält hjärt stamceller.På samma sätt, med hjälp av en RFP reporter mus embryonala stamcellslinje, efter 132 timmars differentiering, RFP-positiva hjärt stamceller visas. Efter immunfärgning för Cxcr4, RFP-positiva, Cxcr4-positiva, och RFP-positiva, Cxcr4-negativa celler kan isoleras. Immunfärgning för hjärt troponin T på dag 12 av differentiering bekräftar att första hjärtat fältceller differentiera främst myocyter.På samma sätt ger celler som härrör från RFP-positiva, Cxcr4-negativa hjärt progenitor celler upphov till kardiomyocyter på mycket högre procentsatser jämfört med Cxcr4 enda positiva hjärt progenitor celler. Ibland, mus embryonala stamceller misslyckas med att skilja effektivt och bildar mycket lågt antal hjärt fält-specifika hjärt stamceller. Tidpunkten, koncentration och konsekvens av tillägg av cytokiner och antalet av cellerna är avgörande för en framgångsrik generation av kammarspecifika hjärt stamceller.Efter detta förfarande kan prövarna analysera de fysiologiska egenskaperna hos de olika populationerna av hjärtprogenitorceller för att få ytterligare insikt i deras specifikation och funktion.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Härledning av Cardiac progenitorceller från embryonala stamceller

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Generation av murina hjärtstimulator cellaggregat Baserat på ES-cell-programmering i kombination med Myh6-promotor-Val

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Initiera Differentiering i Immortaliserade multi Otic stamceller

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony analyser för att karakterisera Tri-potenta stamceller isolerade från vuxen Murina bukspottkörtel

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Hypoxisk förbehandling av margen-härledda progenitorceller som en källa för generering av mogna Schwann-celler

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativa hela-mount immunofluorescens analys av hjärt stamceller populationer i musembryon

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Utveckling av ett In Vitro -test att kvantifiera hematopoetiska stamceller och stamceller celler (HSPCs) utveckla zebrafiskar embryon

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generation av första hjärtat fält-liknande hjärt stamfäder och ventrikulära-liknande hjärtmuskelcellerna från mänskliga pluripotenta stamceller

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Induktion av Endothelial differentiering i hjärt stamceller låga Serum villkor

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...