Name: in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells
Uploaded: 2019-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

E. T. Magic this Matters ve AHA tarafından desteklenmektedir. C. K. NICHD/NıH (R01HD086026), AHA ve MSCRF tarafından hibe tarafından destekleniyordu.

Not: In vitro nesil kalp alanına özgü fare kardiyak progenitör hücreler (Şekil 1).
1. fare ESCs Bakımı
<ol><li>MESCs büyümeye (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-Gfp, mescIsl1-RFP)25 üzerinde 0,1% (w/v) jelatin kaplı T25 flsorlar 2i Orta (870 ml toplarlar asgari temel Orta (gmem), 100 ml fetal sığır serumu (FBS), 10 ml glutamax, 10 ml olmayan esansiyel amino asitler, 10 ml...

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).</li><li>Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+cardiomyocyte.">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li><li>Birket, M. J., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+cardiovascular+progenitors--a+developmental+perspective.">Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective.</a> Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient.">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Atrial+and+Ventricular+Cardiomyocytes+Develop+from+Distinct+Mesoderm+Populations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).</li><li>Protze, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+node+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+cells+function+as+a+biological+pacemaker.">Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).</li><li>Galdos, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Regeneration:+Lessons+From+Development.">Cardiac Regeneration: Lessons From Development.</a> Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).</li><li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lineage+restriction+in+temporally+distinct+populations+of+Mesp1+progenitors+during+mammalian+heart+development.">Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development.</a> Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+networks+in+heart+development+and+regeneration.">Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).</li><li>Bruneau, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber-specific+cardiac+expression+of+Tbx5+and+heart+defects+in+Holt-Oram+syndrome.">Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome.</a> Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+10+gene+regulation+in+the+second+heart+field+by+Tbx1,+Nkx2-5,+and+Islet1+reveals+a+genetic+switch+for+down-regulation+in+the+myocardium.">Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).</li><li>Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fate+map+of+Tbx1+expressing+cells+reveals+heterogeneity+in+the+second+cardiac+field.">A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field.</a> Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+Distinct+Six2-Positive+Second+Heart+Field+Progenitors+Regulate+Mammalian+Heart+Development+and+Disease.">Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease.</a> Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+neonatal+rat+system+as+a+bioincubator+to+generate+adult-like+mature+cardiomyocytes+from+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells.">Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).</li><li>Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+heart+disease:+entering+a+new+era+of+human+genetics.">Congenital heart disease: entering a new era of human genetics.</a> Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome.">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAND1+loss-of-function+mutation+contributes+to+congenital+double+outlet+right+ventricle.">HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).</li><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+contact+with+endoderm-like+cells+efficiently+induces+cardiac+progenitors+from+mouse+and+human+pluripotent+stem+cells.">Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, 02164 (2014).</li><li>Morita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall1+transiently+marks+undifferentiated+heart+precursors+and+regulates+their+fate.">Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326 (5951), 426-429 (2009).</li></ol>

Protokolimizde, kalp kürleri ve izole kalp alanına özgü TBM 'Ler oluşturmak için bir metodoloji tarif ediyoruz. Bunlar, TBM spesifikasyonlarının mekanizmaları ve özelliklerinin yanı sıra kardiyak odasına özel hastalık modelleme için de kullanılabilir. Daha önce yayınlanmış bir çalışma, iki floresan muhabiriyle (Mef2c/nkx 2.5) bir mESC hattı kullanmış ve kardiyogenezi in vitro olarak incelemek için, her iki işaretçinin de kardiyomiyositler zaten26meydana geldiğinde em...

Pluripotent kök hücrelerinin kullanımı (PSC 'ler) kardiyak rejenerasyon ve kişisel tıp alanında hastalık modelleme ve ilaç terapileri için hasta spesifik miyositlerle devrim yarattı1,2,3, 4. daha yakın zamanda, atriyal vs ventriküler üretimi için in vitro protokoller ve pacemaker gibi PSC türevi kardiyomiyositler geliştirilmiştir5,6. Bununla birlikte, kardiyogenezinin kardiyak gelişimi incelemek ve daha sonra ventriküler odasına özgü kardiyak hücreler oluşturmak için yeniden oluşturulabilir olup olmadığı hala belirsiz.
Erken embriyonik gelişim sırasında, BMP4 gibi salgılanmış morfojenlerin etkisi altında Mezodermal hücreler, Wnts ve Activin A form ilkel çizgi7. Mesp1 ifadesi ile işaretlenmiş kardiyak Mezodermal hücreler, kalp hilal ve sonra ilkel kalp tüpü7,8oluşturmak için anteriora ve latterly göç. Bu göç grubu hücre kalp progenitör hücrelerin iki çok farklı nüfus içerir (TBM), yani ilk ve ikinci kalp alanı (FHF ve SHF)9,10. SHF hücreleri yüksek proliferatif ve göç ve öncelikle uzama ve kalp tüpü döngü sorumludur. Ayrıca, SHF hücreleri kardiyomiyositler ayırt, fibroblastlar, düz kas ve endotel hücreler onlar sağ ventrikül oluşturmak için kalp tüpü girerken, sağ ventriküler çıkış yolu ve hem Atria büyük parçası7,10. Buna karşılık, FHF hücreleri daha az proliferatif ve göç ve onlar sol ventrikül ve Atria11daha küçük bir kısmı yükselmesine gibi kardiyomiyositler çoğunlukla ayırt. Ayrıca, SHF ataları Tbx1, FGF8, FGF10 ve Six2 ifadesiyle işaretlenmiş iken FHF hücreleri Express Hcn4 ve Tbx511, 12,13,14,15.
PSC 'ler üç germ katmanını ve daha sonra vücudun4,16' daki herhangi bir hücre tipine ayırt edebilir. Bu nedenle, kalp gelişimini anlamak ve konjenital kalp hastalığı ile sonuçlanan spesifik gelişimsel kusurları modelleme için muazzam bir potansiyel sunuyoruz, Doğum kusurlarının en sık nedeni17. Konjenital kalp hastalığının büyük bir alt grubu, Odaya özgü kardiyak anormallikleri içerir18,19. Ancak, hala bu anormalli kalp alanı gelişimi kaynaklanan olup olmadığını belirsiz. Buna ek olarak, kardiyomiyositlerin doğumdan sonra proliferasyon yetersizlik göz önüne alındığında, kalp rejenerasyonu için kardiyak doku oluşturmak için geniş çaba olmuştur1,7,20. Kardiyak Odalar arasındaki fizyolojik ve morfolojik farklılıkları göz önünde bulundurarak, PSC 'leri kullanarak odaya özgü kalp dokusu üretme önemli bir öneme sahiptir. Gelişimsel kardiyolojideki son gelişmeler, PSC 'lerde iki kalp alanlarının indüklenmiş olması durumunda, hala belirsizdir.
İn vitro kardiyogenezi ve TBM 'lerin spesifikasyonunu ve özelliklerini incelemek için, daha önce PSC 'den türeyen kardiyak küre21,22,23,24farklılaşmasına dayanan bir sistem kullandık. Son zamanlarda, FHF geni Hcn4 ve SHF geni Tbx1 kontrolü altında GFP ve RFP muhabirleri ile fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) ürettik (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. In vitro farklılaşmış mescs, Gfp + ve RFP + hücrelerinin iki farklı mezodermal hücre alanlarından ortaya çıktığı ve tamamlayıcı bir şekilde desenli kardiyak kürler oluşturdu. Elde edilen GFP + ve RFP + hücreleri, sırasıyla RNA sıralaması ve klonal analizler ile belirlenen FHF ve SHF özelliklerini sergiledi. Önemlisi, Isl1-RFP muhabiri (mESCIsl1-RFP) taşıyan mescs kullanarak, BIZ SHF hücrelerinin sadakatle hücre yüzeyı protein CXCR4 tarafından işaretlenmiş olduğunu keşfetti ve bu transgenes olmadan kalp alanına özgü hücrelerin yalıtım etkinleştirebilirsiniz. Mevcut protokol, odağa özel kalp hastalığının incelenmesi için değerli bir araç olarak hizmet veren mESCs 'den kalp alanına özgü TBM 'lerin oluşumunu ve yalıtımını tarif edecektir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1251px;" width="1250">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.1% (w/v) Gelatin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100X Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1X PBS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">20% Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40&#956;m cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td align="right">35223</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Activin A</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>338-AC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 minus vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BMP4</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:245px;">Sony</td>
			<td style="width:344px;">SH800</td>
			<td style="width:241px;">Sony or any other fluorescence-activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">Cell strainer 70&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge Sorvall Legend XT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">75004508</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CHIR99021</td>
			<td>Selleck chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:420px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">51030285</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Corning Ultra Low Attachment T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Countless II FL automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571, Lot #1757130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium high glucose (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ESGRO (LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EVOS FL microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glasgow&#8217;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">11710035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monothioglycero (MTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Troponin T antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MS-295-P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2-SUPPLEMENT</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acid solution (NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suspension culture dish 150 mm x 25mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE (Trypsin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td align="right">72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of heart field-specific cardiac progenitor cells

Pluripotent kök hücreleri kalp gelişimi ve hastalık ve rejeneratif tıp anlamak için büyük bir potansiyel sunuyor. Gelişimsel kardiyolojideki son gelişmeler, pluripotent kök hücrelerinden kardiyak hücreler üretmeye yol açtı, Eğer iki kardiyak alan-ilk ve ikinci kalp alanları (FHF ve SHF) — pluripotent kök hücreler sistemlerinde indüklenir. Bunu ele almak için, In vitro spesifikasyon ve kalp alanına özgü kardiyak progenitör hücrelerinin izolasyonu için bir protokol oluşturacağız. Hcn4-GFP ve Tbx1-CRE taşıyan embriyonik kök hücre hatları kullandık; FHF ve SHF 'nin Rosa-RFP gazetecileri, sırasıyla ve hücre membranı protein Cxcr4, bir SHF Marker canlı hücre immün boyama. Bu yaklaşım ile, biz fonksiyonel özellikleri ve onların in vivo karşı transkriptom özetlemek progenitör hücreler oluşturuldu. Protokollerimiz, iki kalp alanlarının erken spesifikasyonları ve ayrım çalışması için ve kalp hastalığı modelleme için odasına özgü kardiyak hücreler oluşturmak için kullanılabilir. Bu bir in vitro nevuslardır sistemi olduğundan, hassas anatomik bilgiler sağlayamayabilir. Ancak, bu sistem gastrülasyon-aşama embriyoları kötü erişilebilirlik üstesinden gelir ve yüksek verim ekranlar için ölçeklendirilebilir.

Yaklaşık 132 farklılaşma sonrasında Tbx1-RFP ve Hcn4-GFP TBM 'Ler floresan mikroskop kullanılarak tespit edilebilir (Şekil 2). Genellikle, GFP ve RFP hücreleri yaklaşık olarak aynı anda görünür. TBM 'lerin iki nüfusu yakın ve yaygın olarak tamamlayıcı bir desen genişletmek için devam ediyor. Activin A ve BMP4 konsantrasyonlarını ayarlamak FHF vs SHF TBM 'lerin yüzdeleri değiştirir (Şekil 3). TBM belirtimi içinde vitro öncelikle BMP4 ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells at JoVE.com

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Bu yöntemin amacı, progenitör hücre spesifikasyonu ve fonksiyonel özelliklerini incelemek ve kalp hastalığı modelleme için oda spesifik kardiyak hücreler oluşturmak için, in vitro kalp alanına özgü kardiyak progenitör hücreleri oluşturmadır.

In vitro Generation fare kalp alanı-spesifik kardiyak progenitor hücreler

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Yöntemimiz fare embriyonik kök hücrelerinden kalp alanına özgü kardiyak progenitor hücreleri üretmeyi amaçlamaktadır. Bu kalp alanı muhabiri kök hücre hattı, genetik ve farmakolojik manipülasyona uygun bir sistem sağlayarak, konjenital kalp hastalığının altında yatan mekanizmaların yüksek iş bölümü çalışmasına olanak sağlar. Odaya özgü çeşitli konjenital kalp hastalıkları vardır.Bu protokol, kardiyogenezin in vitro recapite ile hastalık mekanizmasının incelenmesine ve gelecekteki rejeneratif tedavilerin geliştirilmesine olanak sağlamaktadır. Bu protokol, kalp gelişimi sırasında farklı odaların kardiyak ata hücrelerinin nasıl belirtildiğihakkında bilgi sağlayabilir. Transgenik fare embriyonik kök hücrelerini %0,1 jelatin kaplı T25 şişelerinde 2i ortamda büyüterek başlayın.Hücreler %70 ila %80 birleştiğinde, PBS ile kültürleri durulayın ve kültürü 37 derecede 37 derecede tek hücrelere ayırmak için şişe başına bir mililitre tripsin ekleyin. Hücreler ayrıldığında, DMEM dört mililitre 10 FBS ile reaksiyon nötralize ve uygun bir yöntemle hücreleri saymak. Hücreleri yaklaşık üç kez 10 taze orta konsantrasyon başına beş hücreye seyreltin ve santrifüj ile hücreleri toplamak.Daha sonra yeni 0.1% jelatin kaplı T25 şişeleri üzerine rekaplama için taze 2i orta beş mililitre pelet resuspend. Kardiyak spheroidlerden TBM üretimi için, 2.5 kat 10 ile altı ayırımlı transgenik fare embriyonik kök hücre örneğini santrifüj ile toplayın ve 25 mililitre SFD ortasında hücreleri yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 37 santigrat derecede kuluçka için 150 ila 25 milimetrelik steril bir plakaya ve 48 saat boyunca %5 karbondioksite yerleştirin.Kuluçka sonunda, konik bir tüp içine kardiyak spheroids toplamak. Spheroidlerin selektif izolasyonunu kolaylaştırmak ve tek hücrelerden kaçınmak için spheroidleri santrifüj ile tortula çökün. Taze SFD orta 25 mililitre küresel leri yeniden askıya aktivin A mililitre başına bir nanogram ve kemik morfogenetik protein dört mililitre başına 1.5 nanogram ile takviye.Hücre kültürü kuluçka makinesinde 24 saatlik kuluçka için sıçrıcıları aynı kültür plakasına geri yerleştirin. Ertesi gün, tüm kardiyak küresel leri santrifüjle hatırlayın. Ultra düşük bir eki, hücre kültürü kuvözde 75 santimetre karelik şişede 48 saat kaplama için 25 mililitre taze SFD ortamda farklılaşmış embriyoid cisimleri yeniden askıya alın.Floresan muhabirler kullanarak kalp alanına özgü TBM izolasyon için, santrifüj ile embriyoid organları toplamak ve üç dakika boyunca 37 santigrat derece trypsin bir mililitre ile 3D kültürleri ayrıştırın. Kuluçka sonunda, hücreleri ayrıştırmak ve DMEM'de dört mililitre 10 FBS ile reaksiyonu nötralize etmek için pipetleme ile iyice karıştırın. Ayrık olmayan embriyoid cisimleri çıkarmak için karışımı 70 mikrometrelik bir süzgeç üzerine geçirin ve filtrelenmiş hücreleri santrifüj ile tortulayın.CpC'leri floresan muhabir ifadelerine göre sıralamak için, 500 mikrolitre FACS çözeltisindeki peleti yeniden askıya alın ve hücreleri 40 mikrometrelik hücre süzgecinden geçirerek buz üzerinde beş mililitrelik polistiren yuvarlak alt tüpüne filtreleyin. Daha sonra hücreleri, RFP ve GFP ifade eden hücreleri FACS ile izole etmek için sıralayın ve hücreleri bir mililitre FBS'de toplayın. Yüzey proteini Cxcr4 ekspresyonuna göre birinci ve ikinci kalp alanı CpC'lerini izole etmek için, pbs'de %10 FBS'nin 300 mikrolitresinde tek fare embriyonik kök hücre RFP ifade eden tek fare embriyonik kök hücre RFP ifade eden floresan-konjuge anti-Cxcr4 antikor ile desteklenmiştir.Oda sıcaklığında beş dakika sonra, yıkama başına taze, soğuk PBS bir ila iki mililitre hücreleri üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, 500 mikrolitre FACS çözeltisindeki hücreleri yeniden askıya alın ve hücreleri 40 mikrometrelik bir süzgeçten beş mililitrelik yuvarlak alt tüpe süzün. Daha sonra hücreleri Cxcr4 ekspresyonuna göre sıralayın ve hem Cxcr4-pozitif hem de negatif popülasyonları buz üzerinde tüp başına bir mililitre FPS içeren tek tek tüplerhalinde toplayın.FACS izole, kalp alanına özgü kardiyak progenitor hücreleri yeniden kültürlendirmek için, santrifüj tarafından sıralanmış hücreleri toplamak ve SFD ortamda pelet resuspend. Sonra yaklaşık üç kez 10 iyi başına dört hücre için tohum 0.1% jelatin kaplı, 384-iyi plaka. Artan hücre ölümü sıralama sonra belirtilirse, her kuyuya 10 mikromolar ROCK inhibitörü ekleyin.Kültür iki gün sonra, spontan dayak gözlenmelidir. Kaplama lı CpC'lerin kardiyomiyositlere ayırt olma yeteneğini analiz etmek için, tek kardiyomiyositleri izole etmek ve %4 paraformaldehitte hücreleri yeniden askıya almak için, tripsin ile 12. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, santrifüj ile sabit hücreleri toplamak ve aşırı fiksatif kaldırmak için PBS pelet yıkayın.Daha sonra, PBS%10 FBS hücreleri resuspend ve fare anti-troponin T antikor ile hücre örneğinin yarısını kuluçka ve negatif kontrol olarak örneğin diğer yarısını kullanın. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, hücreleri taze PBS'de iki kez yıkayın ve uygun bir ikincil antikor la birlikte %10 FBS artı PBS'de numuneleri yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında başka bir 30 dakikalık kuluçka sonra, yıkama başına taze PBS hücreleri iki kez yıkayın ve bir akış sitometre üzerinde analiz için tüp başına PBS 200 mikrolitre hücreleri yeniden askıya.Yaklaşık 132 saatlik farklılaşmadan sonra, Tbx1-RFP ve Hcn4-GFP kardiyak progenitor hücreleri floresan mikroskopi ile saptanabilir. Genellikle, hem GFP hem de RFP hücreleri yaklaşık olarak aynı zamanda görünür ve progenitor hücrelerinin iki popülasyonu yakın ve tipik olarak tamamlayıcı bir desende genişlemeye devam eder. Aktivin A ve kemik morfogenetik protein 4 konsantrasyonlarının ayarlanması birinci ve ikinci kalp alanı kardiyak progenitor hücrelerinin yüzdelerini değiştirecek.Benzer şekilde, bir RFP muhabiri fare embriyonik kök hücre hattı kullanarak, farklılaşma 132 saat sonra, RFP-pozitif kardiyak progenitor hücreleri görünür. Cxcr4, RFP-pozitif, Cxcr4-pozitif ve RFP-pozitif için immünboyama sonra, Cxcr4-negatif hücreler izole edilebilir. Diferansiyasyonun 12.Benzer şekilde, RFP-pozitif, Cxcr4-negatif kardiyak progenitor hücrelerinden elde edilen hücreler, Cxcr4 tek pozitif kardiyak progenitor hücrelerine göre çok daha yüksek yüzdelerde kardiyomiyositlere yol açar. Bazen, fare embriyonik kök hücreleri verimli bir şekilde ayırt etmek ve kalp alanına özgü kardiyak ata hücrelerinin çok düşük sayıda oluşturmak için başarısız. Zamanlaması, konsantrasyonu, sitokinlerin eklenmesi ve hücrelerin sayısı oda kendine özgü kardiyak progenitor hücrelerin başarılı bir nesil için önemlidir.Bu prosedürü takiben, araştırmacılar kardiyak progenitor hücrelerinin farklı popülasyonlarının fizyolojik özelliklerini analiz ederek özellikleri ve işlevleri hakkında daha fazla bilgi edinebilirler.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Myh6-Promotörle Seçim ile kombinasyonu ES-Hücre-Programlama dayanarak Kemirgen Kardiyak Kalp Pili Hücre Agregaların Üretimi

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Ölümsüzleştirdi Multipotent Otic Progenitor Hücrelerde Farklılaşma başlatılıyor

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Olgun Schwann Hücrelerinin Üretimi İçin Bir Kaynak Olarak Kemik İçi Türe Göre Progenitör Hücrelerin Hipoksik Ön Koşullandırma

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Zebra balığı embriyo geliştirilmesinde bir Vitro tahlil hematopoetik kök ve yaratıcı Quantitate gelişimi (HSPCs) hücreleri

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

İlk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri Cardiomyocytes insan Pluripotent kök hücrelerden nesil

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

İndüksiyon düşük Serum koşullar altında kalp Progenitor hücreler endotel farklılaşma

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...