Name: quantification of atherosclerosis in mice
Uploaded: 2019-06-12T15:00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Atherosclerosis in Mice at JoVE.com

Vi takker alle tidligere medlemmer af Göran K Hanssons eksperimentelle kardiovaskulære forskningsenhed, som hjalp med at udvikle denne protokol i løbet af det sidste kvart århundrede. Vi er især taknemmelige for bidragene fra Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson og Inger Bodin. Dette arbejde blev støttet af Project Grant 06816 og Linnaeus support 349-2007-8703 fra det svenske Forskningsråd og af tilskud fra den svenske hjerte-lunge fond, Stockholms Amts råd, professor Nanna Svartz Foundation, Loo og hans Osterman Institut for medicinsk forskning, Karolinska Institutet Research Foundation og Foundation for geriatriske sygdomme i Karolinska Institutet.

<ol>
	<li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010.">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).</li><li>Gistera, A., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+atherosclerosis.">The immunology of atherosclerosis.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 368-380 (2017).</li><li>Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+atherosclerosis,+and+coronary+artery+disease.">Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease.</a> New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).</li><li>Williams, K. J., Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response-to-retention+hypothesis+of+early+atherogenesis.">The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).</li><li>Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+LDL+-+trigger+of+atherosclerosis+and+inflammation+in+the+arterial+intima.">Modified LDL - trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima.</a> Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).</li><li>Ruuth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+low-density+lipoprotein+particles+to+aggregate+depends+on+particle+lipidome,+is+modifiable,+and+associates+with+future+cardiovascular+deaths.">Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths.</a> European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).</li><li>Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+VCAM-1+and+ICAM-1+at+atherosclerosis-prone+sites+on+the+endothelium+in+the+ApoE-deficient+mouse.">Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).</li><li>Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+on+macrophages+that+mediates+uptake+and+degradation+of+acetylated+low+density+lipoprotein,+producing+massive+cholesterol+deposition.">Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).</li><li>Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+susceptibility+to+atherosclerosis+among+inbred+strains+of+mice.">Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice.</a> Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).</li><li>Russell, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+history+of+mouse+inbred+strains:+contributions+of+Clarence+Cook+Little.">Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little.</a> Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).</li><li>Waterston, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+comparative+analysis+of+the+mouse+genome.">Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.</a> Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).</li><li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-driven+immunometabolic+responses+in+atherosclerosis.">Lipid-driven immunometabolic responses in atherosclerosis.</a> Current Opinion in Lipidology. 29 (5), 375-380 (2018).</li><li>Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+atherosclerosis.">Mouse models of atherosclerosis.</a> Current Protocols in Immunology. Chapter 15, (2012).</li><li>Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hypercholesterolemia+and+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice+created+by+homologous+recombination+in+ES+cells.">Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells.</a> Cell. 71 (2), 343-353 (1992).</li><li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E.">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258 (5081), 468-471 (1992).</li><li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery.">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).</li><li>Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+xanthomatosis+and+atherosclerosis+in+cholesterol-fed+low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice.">Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).</li><li>Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-based+therapies+for+atherosclerosis.">T cell-based therapies for atherosclerosis.</a> Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).</li><li>Skalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subendothelial+retention+of+atherogenic+lipoproteins+in+early+atherosclerosis.">Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis.</a> Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).</li><li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+low+density+lipoprotein+receptor-binding+site+in+apolipoprotein+B100+and+the+modulation+of+its+binding+activity+by+the+carboxyl+terminus+in+familial+defective+apo-B100.">Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100.</a> Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).</li><li>Sanan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice+expressing+human+apolipoprotein+B-100+develop+complex+atherosclerotic+lesions+on+a+chow+diet:+no+accentuation+by+apolipoprotein(a).">Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).</li><li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+against+T-cell+epitopes+of+native+ApoB100+reduces+vascular+inflammation+and+disease+in+a+humanized+mouse+model+of+atherosclerosis.">Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis.</a> Journal of Internal Medicine. , (2017).</li><li>Johnson, J. L., Jackson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerotic+plaque+rupture+in+the+apolipoprotein+E+knockout+mouse.">Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse.</a> Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).</li><li>Calara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+plaque+rupture+and+secondary+thrombosis+in+apolipoprotein+E-deficient+and+LDL+receptor-deficient+mice.">Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice.</a> The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).</li><li>Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+infarction+mediated+by+endothelin+receptor+signaling+in+hypercholesterolemic+mice.">Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).</li><li>Daugherty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendation+on+Design,+Execution,+and+Reporting+of+Animal+Atherosclerosis+Studies:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), (2017).</li><li>Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+atherosclerotic+lesions+in+mice.">Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice.</a> Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).</li><li>Purcell-Huynh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+high+levels+of+human+apolipoprotein+B+develop+severe+atherosclerotic+lesions+in+response+to+a+high-fat+diet.">Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet.</a> Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).</li><li>Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+treatment+reduces+atherosclerosis+in+apo+E+knockout+mice.">Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).</li><li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+of+Lymphocytes+in+Mouse+Atherosclerotic+Plaque.">Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).</li><li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta+signaling+in+T+cells+promotes+stabilization+of+atherosclerotic+plaques+through+an+interleukin-17-dependent+pathway.">Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway.</a> Science Translational Medicine. 5 (196), (2013).</li><li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Density+Lipoprotein-Reactive+T+Cells+Regulate+Plasma+Cholesterol+Levels+and+Development+of+Atherosclerosis+in+Humanized+Hypercholesterolemic+Mice.">Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice.</a> Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).</li><li>Daugherty, A., Whitman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+atherosclerosis+in+mice.">Quantification of atherosclerosis in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 209, 293-309 (2003).</li><li>Baglione, J., Smith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assay+for+mouse+atherosclerosis+in+the+aortic+root.">Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root.</a> Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).</li><li>Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gamma-irradiation+and+bone+marrow+transplantation+on+atherosclerosis+in+LDL+receptor-deficient+mice.">Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).</li><li>Naghavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+vulnerable+plaque+to+vulnerable+patient:+a+call+for+new+definitions+and+risk+assessment+strategies:+Part+I.">From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I.</a> Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).</li><li>Seijkens, T. T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CD40-Induced+TRAF6+Signaling+in+Macrophages+Reduces+Atherosclerosis.">Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Hjerte-kar-sygdom er den største morder i verden og nye forebyggende målinger er nødvendige2. Musemodeller af sygdommen giver en omfattende platform for undersøgelse af Patofysiologi og eksperimentelle behandlinger13. Pålidelig læsion størrelse kvantificering er afgørende for denne tilgang. Kvantificerings metoderne varierer dog mellem laboratorierne. Standardisering og optimering har været en løbende proces siden 1980 ' er13,27,33,34. Aorta rødder er dukket op som den mest populære sted at kvantificere eksperimentel åreforkalkning. Tværsnit af plaques muliggør sammenligning af plaque volumen mellem grupperne. En ansigt præparater er begunstiget for læsion kvantificering i større segmenter af aorta. En Face metode visualiserer plaque mængde og muliggør kvantificering af plaque områdedækning, men ikke tager plaque tykkelse i betragtning. Den biologiske relevans for observerede forskelle underbygges af sammenhængende resultater på forskellige steder i det vaskulære træ. Evaluering af åreforkalkning udvikling på forskellige steder adresser mulige site specifikke effekter. Effekten af transplanterede hæmatopoietiske celler på åreforkalkning udvikling kan vurderes i hyperkolesterolemic ldlr-/- chimeras. Men, hele kroppen bestråling påvirker åreforkalkning proces med site specifikke effekter. Mere fremtrædende aterosklerotiske læsioner er udviklet i aorta roden, mens reduceret læsion udvikling observeres i aorta buer35.
Vigtigere, ikke kun læsion størrelse skal behandles i undersøgelser af eksperimentel åreforkalkning. Lesion sammensætning er også en nøgleparameter. Flere plaque funktioner har været forbundet med manifestationer af sygdommen hos mennesker36. Seriel skæring af aorta roden efterlader flere sektioner til rådighed for omhyggelig analyse af plaque sammensætning. Plaque ruptur i mennesker er karakteriseret ved en tynd fibrøs hætte med få glatte muskelceller, sparsom kollagen indhold og tegn på betændelse i plaques36. Selvom plaque ruptur er en sjælden begivenhed i musemodeller af åreforkalkning, markører for plaque stabilitet er informative at evaluere. Translationelle tilgange kan bekræfte mekanistiske fund fra musemodeller og afdække vigtige træk ved sygdomme hos mennesker31. Inflammatorisk status af atherosclerotiske plaques kunne bestemmes ved at immun histokemi farvning af VCAM-1, MHC klasse II, makrofager, og lymfocytter30. Nogle protokoller bruger langsgående sektioner i den koronale plan af aortabuen eller brachiocephalic arterien til måling af aterosklerotisk læsion størrelse og sammensætning37. Men, denne alternative metode efterlader kun få sektioner, der skal analyseres, som begrænser sine applikationer.
Et første kritisk skridt i denne protokol er evnen til at høste Aortas effektivt. Hånd-øje koordination under mikroskop kræver praksis og er afgørende både for mikrodissektion og den efterfølgende fastgørelse af aortabuen. Det næste kritiske trin i denne protokol er samlingen af serielle sektioner fra aorta roden. 80 på hinanden følgende sektioner skal indsamles for hver mus, hvilket kræver både fokus og tålmodighed. Metodologiske færdigheder kunne fremskynde de beskrevne processer betragteligt. Ikke desto mindre, aterosklerotisk læsion kvantificering er stadig en tidskrævende opgave. Ny teknologi, automatiseret håndtering, og små dyr billeddannelse kan lette kvantificering af eksperimentel åreforkalkning i fremtiden. Progression af åreforkalkning er langsom og de fleste eksperimentelle protokoller i musemodeller tager mere end fire måneder at fuldføre13. Derfor, Aortas skal indsamles på en optimeret måde på undersøgelsens endepunkter. Denne protokol giver en omfattende guide til høst Aortas effektivt og den foreslåede behandling forbereder Aortas til multi-purpose brug, herunder læsion kvantificering i aorta rod, aortabuen, og brachiocephalic arterie. Forhåbentlig protokollen kan reducere eksperimentel variation, øge pålideligheden af resultater, og føre til resultater, der vil bane vejen for nye behandlinger mod åreforkalkning.

Hjerte-kar-sygdom er den vigtigste dødsårsag i verden med iskæmisk hjertesygdomme og slagtilfælde tegner sig for en ud af fire dødsfald1. De fleste tilfælde er forårsaget af åreforkalkning, en sygdom karakteriseret ved en langsom ophobning af lipid-lastet plaques med tegn på kronisk inflammation i store og mellemstore arterier2. Sygdommen normalt forbliver ubemærket over flere årtier, indtil en ruptur eller erosion af plaque fremkalder en arteriel trombose, der fører til iskæmisk vævsskade.
En normal arterie består af et intima lag med endotelceller og tyndt fordelte glatte muskelceller, et medielag med glatte muskelceller og elastik lamel, og et omgivende utilsigtet lag med løst bindevæv3. En intima fastholdelse af LDL forskydninger åreforkalkning udvikling4. Ophobning og modifikation af lipoproteiner fører til aggregering og fastklemning inden for arteriel intima5. En inflammatorisk respons er fremkaldt af de fangede og modificerede lipoproteiner6. Endotelceller begynder at udtrykke vedhæftnings molekyler, såsom VCAM-1 på steder i arteriel træet med turbulent blodgennemstrømning, hvilket fører til rekruttering af cirkulerende monocytter og andre leukocytter7. De infiltrerende monocytter skelner i makrofager, der opsluge lipid med efterfølgende omdannelse til makrofag skum celler8.
Atherosclerose er blevet undersøgt i musemodeller med stigende hyppighed siden midten af 1980 ' erne. C57BL/6 er den mest almindeligt anvendte indavlede musestamme for disse undersøgelser, og det bruges som den genetiske baggrund for de fleste genetisk modificerede stammer9. Denne stamme blev etableret i 1920 ' er10, og dens genom blev offentliggjort i 200211. Eksperimenter i musemodeller har flere fordele: kolonierne gengiver hurtigt, huset er pladsbesparende, og indavl reducerer eksperimentel variabilitet. Modellen giver også mulighed for genetiske manipulationer, såsom målrettede gensletninger og indsættelse af transgener. Dette har ført til ny patofysiologisk forståelse af sygdommen og nye terapi mål12.
Wild-type C57BL/6 mus er naturligt resistente over for åreforkalkning. De har de fleste af de cirkulerende kolesterol i HDL, og komplekse aterosklerotiske læsioner dannes ikke selv når fodret en højt fedtindhold og højt kolesteroltal kost13. Hyperkolesterolemic mus, såsom ApoE-/- på C57BL/6-baggrund, anvendes derfor som eksperimentelle modeller af åreforkalkning14,15. Manglen på ApoE hæmmer hepatisk optagelse af rest lipoproteiner og alvorligt foruroliger lipid metabolisme. I ApoE-/- mus er cirkulerende kolesterol overvejende i VLDL-partikler, og musene udvikler komplekse aterosklerotiske plaques på en almindelig Chow diæt.
Ldlr-/- mus efterligner udviklingen af aterosklerose set hos mennesker med familiær hyperkolesterolæmi16. Ldlr-/- mus har brug for en vestlig type kost for at udvikle åreforkalkning17. Vestlig kost efterligner menneskelig fødeindtagelse og indeholder normalt 0,15% kolesterol. LDL-receptoren genkender ApoB100 og ApoE og medierer optagelsen af LDL-partikler gennem endokytose. LDL-receptorer er grundlæggende for lever clearance af LDL fra cirkulation, mens LDL-receptor ekspression i hæmatopoietiske celler ikke påvirker denne proces. Dette åbner mulighed for knoglemarvstransplantation af ldlr+/+ celler til hyperkolesterolemic ldlr-/- modtagere og vurdering af åreforkalkning udvikling. Knoglemarv kimærer har almindeligvis været anvendt til at studere deltagelse af hæmatopoietiske celler i eksperimentel åreforkalkning. Men, knoglemarvstransplantation kan påvirke størrelsen og sammensætningen af aterosklerotiske plaques, gør fortolkningen af resultaterne tvetydige.
Forskellige varianter af ApoE-/- og ldlr-/- mus med yderligere genetiske ændringer er blevet udviklet til at studere specifikke processer af sygdommen18. Et eksempel er human APOB100-transgene ldlr-/- (hubl) mus, der bærer fuld længde menneske APOB100 gen19,20. Disse mus udvikler hyperkolesterolæmi og åreforkalkning på en regelmæssig Chow kost. Men, udviklingen af komplekse aterosklerotiske plaques tager mindst seks måneder og kortere eksperimentelle protokoller normalt bruge vestlig kost21. En stor brøkdel af plasma kolesterol cirkulerer i LDL-partikler, hvilket giver hubl -mus en mere menneskelig-lignende dyslipidemisk lipoprotein profil sammenlignet med ApoE-/- og ldlr-/- mus. Hubl -mus tillader også studier af human apob som Auto antigen22.
Musens modeller af åreforkalkning udvikle komplekse aterosklerotiske plaques med fælles træk ved sygdomme hos mennesker. Men, plaques er temmelig modstandsdygtige over for ruptur med efterfølgende myokardieinfarkt. Aterotrombose er kun sporadisk detekteres og eksperimentelt udfordrende at vurdere23,24,25. Der er udviklet særlige modeller for plaque ruptur, men forsøgsområdet mangler en pålidelig og reproducerbar model til vurdering af plaque-stabiliserende stoffer.
Kvantificering af åreforkalkning er blevet rapporteret på mange måder i litteraturen. De seneste bestræbelser har forsøgt at standardisere eksperimentel design, udførelse og rapportering af dyreforsøg26. Efterforskere har forskellige præferencer og teknikker tilpasset deres laboratorier. De fleste forskningsprojekter er også unikke på en måde, at de kræver nogle protokol ændringer. På grund af sygdommens multifaktorielle karakter varierer de optimale Kontroller mellem projekterne. Lokale forhold og manglende standardisering kan forårsage observerede forskelle i sygdomsudvikling, hvilket hæmmer fremskridtene på forskningsområdet. Forskelle i eksperimentel variation betyder også, at beregninger af statistisk effekt skal baseres på pilotundersøgelser under lokale forhold.
Kvantificering af åreforkalkning anbefales på flere steder i det vaskulære træ. Denne protokol beskriver, hvordan man kan opnå resultater fra aorta roden, aorta Arch, og brachiocephalic arterie i en enkelt mus, ud over at forlade resten af thoracoabdominal aorta for andre analyser. En ansigts præparater giver mulighed for hurtig kvantificering af lipid-ladede plaques i aortabuen. Sygdomsbyrden i brachiocephalic arterien kan også kvantificeres, hvis prøverne er omhyggeligt vist. Jo mere tidskrævende Cross-skæring af aorta roden efterlader flere sektioner til rådighed for detaljeret vurdering af plaque sammensætning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20066.296</td>
			<td>For fixation of sections for immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black electrical insulation tape (50 mm wide)</td>
			<td>Any specialized retailer</td>
			<td>-</td>
			<td>To create pinning beds for aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417C</td>
			<td>Benchtop microcentrifuge.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork board</td>
			<td>Any specialized retailer</td>
			<td>-</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 560</td>
			<td>For serial cryosectioning of aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For rinsing and preparation of solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DC480</td>
			<td>5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors (10 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td>For general dissection of organs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5 (11 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500341</td>
			<td>For microdissection of aorta.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% (v/v)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.290</td>
			<td>Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.8%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.310</td>
			<td>Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>9713.1000</td>
			<td>Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>-</td>
			<td>Image analysis software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris forceps (10 cm, curved, serrated)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15915-G</td>
			<td>Used as anatomical forceps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1096341011</td>
			<td>Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaiser&#39;s glycerol gelatine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1092420100</td>
			<td>Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM LB2</td>
			<td>For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>1820</td>
			<td>Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (17 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501751-G</td>
			<td>For general dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503376</td>
			<td>For pinning of aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td>Polypropylene microtubes with snaplock cap.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 3 needles, 23 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>300800</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 3 needles, 27 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>302200</td>
			<td>For perfusion of mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette 500 &#181;L, K3 EDTA</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1341.100</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette 500 &#181;L, Lithium Heparin</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1345.100</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien insect pins, 0.10 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>For pinning of aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625</td>
			<td>Not classified as a hazardous substance or mixture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) cryomount</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>45830</td>
			<td>For embedding tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td>Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100x20 mm)</td>
			<td>Any cell culture supplier</td>
			<td>-</td>
			<td>Proposed as a storage container for pinned aortas.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper (grade 1001)</td>
			<td>Munktell</td>
			<td>120006</td>
			<td>For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 &#181;m).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater RNA stabilization reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76106</td>
			<td>For stabilization of RNA in tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>A surface decontamination solution that destroys RNases on contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3 (13 cm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard scalpel blade #10</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500239</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>For dissection and en face documentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4261</td>
			<td>Not classified as a hazardous substance or mixture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>To collect aortic root sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps (15 cm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501741-G</td>
			<td>For general dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek cryomolds (10x10x5 mm)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4565</td>
			<td>For embedding aortic roots in OCT.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors (8 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503378</td>
			<td>For microdissection of aorta.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of atherosclerosis in mice

Hjerte-kar-sygdom er den vigtigste dødsårsag i verden. Den underliggende årsag i de fleste tilfælde er åreforkalkning, som er delvis en kronisk inflammatorisk sygdom. Eksperimentelle åreforkalkning undersøgelser har belyst rollen af kolesterol og inflammation i sygdomsprocessen. Dette har ført til vellykkede kliniske forsøg med farmaceutiske agenter, der reducerer kliniske manifestationer af åreforkalkning. Omhyggelig og velkontrollerede eksperimenter i musemodeller af sygdommen kunne yderligere belyse patogenesen af sygdommen, som ikke er fuldt forstået. Standardiseret læsions analyse er vigtig for at reducere eksperimentel variabilitet og øge reproducerbarhed. Bestemmelse af læsion størrelse i aorta rod, aortabuen, og brachiocephalic arterie er fælles endepunkter i eksperimentel åreforkalkning. Denne protokol giver en teknisk beskrivelse til vurdering af åreforkalkning på alle disse steder i en enkelt mus. Protokollen er særlig nyttig, når der er tale om begrænset materiale, hvilket ofte er tilfældet, når genetisk modificerede dyr er karakteriseret.

I musemodeller af åreforkalkning de mest fremtrædende læsioner tendens til at udvikle sig i aorta roden og aortabuen. Denne protokol beskriver kvantificering af åreforkalkning i aorta roden, aortabuen, og brachiocephalic arterien i en enkelt mus. Målbare læsioner i thorax faldende aorta og abdominal aorta er kun til stede hos dyr med Advance sygdom. I denne protokol, disse dele er ikke analyseret for aterosklerotisk byrde, men gemt til efterfølgende analyse af mRNA niveauer eller andre analyser. Serielle sektioner af aterosklerotiske læsioner i aorta roden vises normalt i en graf med læsion størrelse på y-aksen og afstanden til aorta sinus på x-aksen28. True Cross-sektioner er afgørende for læsion størrelse kvantificering. Skrå sektioner kan overvurdere læsions størrelserne, og en hældning på kun 20 ° kan overvurdere den absolutte læsions flade med 15%29. Beregningen af læsions fraktionen af det samlede fartøjs areal gør imidlertid resultatet mindre følsomt over for mulige vinkel forskelle under skæring (figur 4a). En hensigtsmæssig statistisk metode til påvisning af forskelle mellem grupperne er sædvanligvis en regelmæssig 2-vejs analyse af variansen (ANOVA). Bonferroni efter test udføres derefter for at påvise forskelle på visse niveauer. Fishers mindste betydelige forskel kunne også bruges som en opfølgende test til ANOVA. Det reducerer sandsynligheden for type II statistiske fejl, men ikke tegner sig for flere sammenligninger. Desuden kunne det være illustrativt at beregne arealet under kurven eller den gennemsnitlige læsions tørrelse pr. mus og præsentere dataene i et prik plot for yderligere at visualisere individuelle variationer i grupperne (figur 4b).
Olie rød O er en fedtopløselig klar rød Diazo farvestof, som pletter neutrale lipider. Polar lipider i cellemembraner er ikke plettet. Olie rød O farvning kan udføres på ferske, frosne eller formalin-faste prøver, men ikke på paraffin-indlejrede prøver på grund af fjernelsen af lipider i den krævede deparaffinisering proces. Der kan foretages en kvantificering af hud lipid-akkumulering ved farve tærskel for olie rødt O positivt område af det samlede læsionsområde (figur 4c). Hematoxylin producerer en blå farvning af cellekerner, hvilket er nyttigt at visualisere plaque morfologi. De højre og venstre kranspulsårerne afviger normalt fra aorta omkring 250 μm fra aorta sinus27, som ofte falder sammen med de mest fremtrædende læsions størrelser. Tværsnit fra denne region vises ofte som repræsentative resultater (figur 4d).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig4.jpg"> Figur 4: aterosklerotiske læsioner i aorta roden. (A) otteogtyve uger gamle mandlige knoglemarv kimærer fodret vestlig kost i otte uger blev evalueret for at bestemme effekten af Smad7-mangelfulde T-celler på åreforkalkning udvikling. Eksperimentel ldlr-/- kimærer fik CD4-CRE+Smad7fl/fl knoglemarv og kontroller fik CD4-CRE+Smad7fl/+ knoglemarv. Grafen viser kvantificering af aterosklerotisk læsion område fra otte på hinanden følgende sektioner, 100-800 μm fra aorta sinus vises som læsion fraktion af den samlede fartøjs overflade (Cd4-CRE+Smad7fl/+/ldlr-/- n = 6, Cd4-CRE+Smad7fl/fl/ldlr-/- n = 9, 2-vejs ANOVA med bonferroni's post test, graf viser Mean ± SEM, seler indikerer signifikansniveau for stamme sammenligning). B) den kombinerede prik-plot og søjlegrafen viser det gennemsnitlige aterosklerotiske læsionsområde fra aorta-rodsektionerne (CD4-CRE+Smad7fl/+/ldlr-/- n = 6, CD4-CRE+Smad7fl/fl/ Ldlr-/- n = 9, student's t-test) (C) fraktion af olie rødt O-farvet område i læsionerne (CD4-CRE+Smad7fl/+/ldlr-/- n = 4, Cd4-CRE+Smad7fl/fl /Ldlr-/- n = 6, student's t-test, ns = ikke-signifikant) (B-C) prikker repræsenterer individuelle mus og søjler viser gennemsnit ± SEM.D) repræsentative mikrografer, der viser olie-rød O-farvning (i rødt farve) af neutrale lipiderne i aorta roden 300 μm fra aorta sinus (50x forstørrelse), skala bar = 500 μm. *p ≤ 0,05, * * *p ≤ 0,001. Dette tal er blevet modificeret fra Gisterå et al.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Olie rød O kunne bruges til farvning af en ansigt forberedt Aortas, men denne protokol bruger Sudan IV, en anden praktisk fedtopløselige Diazo farvestof. Sudan IV visualiserer tydeligt aterosklerotiske plaques i en orange-rød farve ved farvning af lipiderne, triglycerider og lipoproteiner. Fjernelse af den mørke baggrund i repræsentative billeder af en-Face aorta buer kunne forbedre det visuelle display (figur 5a). Normalt er læsion størrelse normalt distribueres inden for grupper, tillader statistisk test med elevens t-test mellem grupperne. Et prik plot, der viser både individuelle mus og middelværdien, som sammenlignes mellem grupperne, er en informativ måde at vise resultaterne på (figur 5b-C). Da variationen inden for grupperne typisk er forskellig mellem steder i det vaskulære træ, er der normalt behov for separate effekt beregninger. Unødvendig variation kan undgås ved metode færdighed og protokol standardisering. Det er vigtigt at opnå statistisk signifikante resultater, men den biologiske relevans for en observeret forskel skal altid også overvejes.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig5.jpg"> Figur 5: aterosklerotiske læsioner i aortabuen og brachiocephalic arterie. (A) repræsentative en ansigt mikrografer af aorta buer med lipid-lastet plaques farvet med Sudan IV (i orange farve) fra 20 uger gamle mus fodret vestlig kost i ti uger, visualiseret sammen. Scale bar = 2 mm. Human APOB100-transgene ldlr-/- (hubl) mus blev anvendt som kontrol og den eksperimentelle gruppe bestod af TCR-Transgene mus med LDL-reaktive T celler (BT1) krydsede til hubl mus. B) aterosklerotiske læsioner i aortabuen (hubl n = 10, BT1xHuBL n = 12; Elevens t-test). C) aterosklerotiske læsioner i brachiocephalic arterien (hubl n = 8, BT1xHuBL n = 9, student's t-test). (B-C) Prikker repræsenterer individuelle mus, søjler viser gennemsnit ± SEM. *p ≤ 0,05. Dette tal er blevet modificeret fra Gisterå et al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende figur 1: alternativ organisering af dias til serielle sektioner af aorta roden. En forenklet systematisk slide organisation til indsamling af sektioner fra aorta roden. Samlingen muliggør olie rød O farvning for lipiderne og immun histokemi eller immunofluorescens farvning. Dedikerede slides til Picrosirius rød farvning af kollagen er udeladt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/2019-JoVE-Figure-S1.eps">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Atherosclerosis in Mice at JoVE.com

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Murine modeller af åreforkalkning er nyttige værktøjer til at undersøge patogene veje på et Molekylær niveau, men kræver standardiseret kvantificering af læsion udvikling. Denne protokol beskriver en optimeret metode til at bestemme læsion størrelse i de store arteriel beholdere, herunder aorta roden, aortabuen, og brachiocephalic arterie.

Kvantificering af åreforkalkning i mus

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Hjerte-kar-sygdom er den vigtigste dødsårsag globalt. Musemodeller er nyttige værktøjer til at studere denne sygdom, og vores protokol kan bruges til at kvantificere åreforkalkning i mus. Ved hjælp af denne protokol, læsion størrelse kan måles i tre vaskulære steder.Den aorta rod, aorta bue og brachiocephalic arterie. Kvantificeringen af åreforkalkning hos mus kan være en kedelig opgave. Vi har fremlagt detaljerede skridt, som vi håber kan fremskynde processen.Nogle af disse trin er vanskelige at beskrive skriftligt. Vi håber, at denne video vil hjælpe dig med at opnå robust aterosklerotisk læsion størrelse analyse. Efter høst en mus hjerte i henhold til standard protokoller, placere hjertet på en kork seng, ventrale side op under en dissekere mikroskop og bruge en nål til at fastsætte hjertet til kork gennem spidsen.Holde bunden af hjertet med anatomiske stænde, bruge en skalpel holdt i en 20 graders vinkel caudally i sagittal flyet, og 20 grader kranielt i det tværgående plan, at skære væk apikale to tredjedele af hjertet. Integrer aortaroden og bunden af hjertet i optimal skæretemperatur forbindelse, eller OLT, og forsigtigt klemme hjertet med snævler til at fylde aortaroden med sammensatte og til at fjerne eventuelle luftbobler. Overfør prøven til bunden af en kryomet fyldt med OCT med aortaroden vinkelret på bundoverfladen og frys forbindelsen på tøris.Opbevar derefter vævsprøven i en frysepose på minus 80 grader Celsius, indtil kryosektionen. For at forberede en pinning seng til en ansigtsanalyse, fold et segment af paraffin voks film otte gange for at gøre en flad 25 af 25 mm overflade og wrap sort elektrisk isolering tape omkring filmen for at gøre en mørk baggrund for aorta. Placer en etiket på bagsiden af fastgørelsessengen, og brug en leadblyant til at registrere muse-id'et.Overfør aortabuen til pinning sengen og tilsæt en dråbe PBS til vævet. Ved hjælp af et stereomikroskop skal aortaen renses for det resterende periadventitiale fedtvæv, og vannas saks og Dumont-vicessinlering forsigtigt skræller alt det omgivende fedtvæv væk uden at manipulere eller beskadige aortaen. Dernæst indføre Vannas saks i aorta lumen at udsætte intimal overflade.Begynd at skære den ydre krumning af den opstigende bue i den distale retning, fortsætter med at skære åbne grenene, herunder brachiocephalic arterie og skåne den dorsale del af den faldende thorax region. For at vise den intimale overflade, skæres åbne mindre krumning og fold åbne aorta. Ved hjælp af en mikro Castroviejo nål holder, fastgør den åbne bue til pinning sengen med den stumpe ende af minuten insekt stifter uden at strække prøven, forsigtigt bøje stifterne væk fra prøven som vævet holdes på plads.Gem derefter den fastgjorte bue med billedsiden nedad i en petriskål af PBS ved fire grader Celsius. For Farvning i Sudan IV skylles prøven i fem minutter i en petriskål på 70% ethanol med buen nedad, før prøven overføres til en skål af Sudan IV arbejdsopløsning i syv minutter. Ved inkubationens afslutning skylles prøven med to tre minutters vask i 80%ethanol for at afplette den normale intimoverflade efterfulgt af en endelig skylning i PBS, før vævet returneres til den originale petriskål.Derefter erhverve mikrografer under et stereomikroskop tilsluttet et digitalt kamera på en 10X forstørrelse, få billeder af den fastgjorte bue nedsænket i PBS, ved hjælp af små metal vægte til at holde pinning seng til bunden af Petri skålen. For at opnå kryosektioner af den indlejrede aortarod, indstille kryostattemperaturen til minus 20 grader Celsius og afsnittet tykkelse til 10 mikrometer. OLT-blokken, der indeholder aortaroden, monteres på prøveholderen med ventrikelvævet udad.Fastgør positionen med lidt ekstra OKT, hvis det er nødvendigt. Aortaroden skal nu placeres vinkelret på knivbladet. Saml de indledende kontrolsektioner, der indeholder hjertemuskelvæv på almindelige mikroskopdias, og kontroller progressionen gennem vævet hver 200 mikrometer under et let mikroskop.Når den første aorta cusp vises, vippe prøven mod punkt nul cusp at justere sektionen plan med de to andre cusps og tælle hver 10 mikrometer sektion, der er skåret fra punkt nul og fremefter. Begynd at indsamle sektioner til analyse fra 90 mikrometer og fremefter i henhold til det planlagte dias, indtil 800 mikrometer fra punkt nul er nået. Beregning af læsionsfraktionen af aortarodens samlede karareal gør dataene mindre følsomme over for mulige vinkelforskelle under trækning.Desuden kan det være illustrativt at beregne arealet under kurven eller atherotolæsionsstørrelsen pr. mus og præsentere dataene i et dotplot for yderligere at visualisere individuelle variationer inden for grupper. Læsional lipid ophobning kan kvantificeres ved farve thresholding olie rød O positive områder af det samlede læsion område. Højre og venstre koronararterier afviger normalt fra aorta omkring 250 mikrometer fra aorta sinus, som ofte falder sammen med de mest fremtrædende læsion størrelser.Fjernelse af den mørke baggrund i repræsentative billeder af en ansigt aorta buer kan forbedre det visuelle display. Læsionsstørrelsen fordeles typisk normalt i grupper, hvilket gør det muligt at foretage statistisk analyse ved hjælp af Elevernes t-test mellem grupper. Vi vil anbefale at øve med nogle testmateriale, indtil du har opnået tilstrækkelige færdigheder til behandling af dine eksperimentelle prøver.Hvis læsionsstørrelsen er forskellig mellem grupperne, bør du bestemme mekanismen, da en læsionssammensætningsanalyse normalt er det næste skridt at forfølge.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³HV68 Infection in Mice

Måling af γHV68 infektion i Mus

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Udtømning og Rekonstituering af makrofager i mus

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Måling Lokale anafylaksi hos mus

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion af murine tarmbetændelse ved adoptiv overførsel af effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høj</sup&gt; T celler i immunsvækkede mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Dyrkning af makrofag kolonistimulerende faktor differentierede humane monocytafledte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasiv prøveudtagning af slimhindebelægning væske til kvantificering af In Vivo øvre luftveje immun-mægler niveauer

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakterisering af Thymus-afhængige og Thymus-uafhængig Immunoglobulin Isotype svar i mus ved hjælp af enzym-forbundet Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Kvantificeringen af antistof-afhængige Enhancement Zika virus i primære humane celler

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Isolering og kvantificering af Zikavirus fra flere organer i en mus

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...