Name: quantification of atherosclerosis in mice
Uploaded: 2019-06-12T15:00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Atherosclerosis in Mice at JoVE.com

We danken alle voormalige leden van de experimentele cardiovasculaire onderzoekseenheid van Göran K Hansson, die dit protocol in de afgelopen kwart eeuw hielp ontwikkelen. We zijn bijzonder dankbaar voor de bijdragen van Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson en Inger Bodin. Dit werk werd ondersteund door project Grant 06816 en Linnaeus support 349-2007-8703 van de Zweedse Onderzoeksraad, en door subsidies van de Zweedse Heart-Lung Foundation, Stockholm County Council, professor Nanna Svartz Foundation, Loo en Hans Osterman Stichting voor medisch onderzoek, de onderzoeksstichting van Karolinska Institutet en de Stichting voor geriatrische ziekten bij Karolinska Institutet.

<ol>
	<li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010.">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).</li><li>Gistera, A., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+atherosclerosis.">The immunology of atherosclerosis.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 368-380 (2017).</li><li>Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+atherosclerosis,+and+coronary+artery+disease.">Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease.</a> New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).</li><li>Williams, K. J., Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response-to-retention+hypothesis+of+early+atherogenesis.">The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).</li><li>Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+LDL+-+trigger+of+atherosclerosis+and+inflammation+in+the+arterial+intima.">Modified LDL - trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima.</a> Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).</li><li>Ruuth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+low-density+lipoprotein+particles+to+aggregate+depends+on+particle+lipidome,+is+modifiable,+and+associates+with+future+cardiovascular+deaths.">Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths.</a> European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).</li><li>Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+VCAM-1+and+ICAM-1+at+atherosclerosis-prone+sites+on+the+endothelium+in+the+ApoE-deficient+mouse.">Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).</li><li>Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+on+macrophages+that+mediates+uptake+and+degradation+of+acetylated+low+density+lipoprotein,+producing+massive+cholesterol+deposition.">Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).</li><li>Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+susceptibility+to+atherosclerosis+among+inbred+strains+of+mice.">Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice.</a> Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).</li><li>Russell, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+history+of+mouse+inbred+strains:+contributions+of+Clarence+Cook+Little.">Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little.</a> Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).</li><li>Waterston, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+comparative+analysis+of+the+mouse+genome.">Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.</a> Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).</li><li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-driven+immunometabolic+responses+in+atherosclerosis.">Lipid-driven immunometabolic responses in atherosclerosis.</a> Current Opinion in Lipidology. 29 (5), 375-380 (2018).</li><li>Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+atherosclerosis.">Mouse models of atherosclerosis.</a> Current Protocols in Immunology. Chapter 15, (2012).</li><li>Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hypercholesterolemia+and+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice+created+by+homologous+recombination+in+ES+cells.">Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells.</a> Cell. 71 (2), 343-353 (1992).</li><li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E.">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258 (5081), 468-471 (1992).</li><li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery.">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).</li><li>Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+xanthomatosis+and+atherosclerosis+in+cholesterol-fed+low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice.">Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).</li><li>Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-based+therapies+for+atherosclerosis.">T cell-based therapies for atherosclerosis.</a> Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).</li><li>Skalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subendothelial+retention+of+atherogenic+lipoproteins+in+early+atherosclerosis.">Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis.</a> Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).</li><li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+low+density+lipoprotein+receptor-binding+site+in+apolipoprotein+B100+and+the+modulation+of+its+binding+activity+by+the+carboxyl+terminus+in+familial+defective+apo-B100.">Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100.</a> Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).</li><li>Sanan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice+expressing+human+apolipoprotein+B-100+develop+complex+atherosclerotic+lesions+on+a+chow+diet:+no+accentuation+by+apolipoprotein(a).">Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).</li><li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+against+T-cell+epitopes+of+native+ApoB100+reduces+vascular+inflammation+and+disease+in+a+humanized+mouse+model+of+atherosclerosis.">Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis.</a> Journal of Internal Medicine. , (2017).</li><li>Johnson, J. L., Jackson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerotic+plaque+rupture+in+the+apolipoprotein+E+knockout+mouse.">Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse.</a> Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).</li><li>Calara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+plaque+rupture+and+secondary+thrombosis+in+apolipoprotein+E-deficient+and+LDL+receptor-deficient+mice.">Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice.</a> The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).</li><li>Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+infarction+mediated+by+endothelin+receptor+signaling+in+hypercholesterolemic+mice.">Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).</li><li>Daugherty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendation+on+Design,+Execution,+and+Reporting+of+Animal+Atherosclerosis+Studies:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), (2017).</li><li>Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+atherosclerotic+lesions+in+mice.">Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice.</a> Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).</li><li>Purcell-Huynh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+high+levels+of+human+apolipoprotein+B+develop+severe+atherosclerotic+lesions+in+response+to+a+high-fat+diet.">Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet.</a> Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).</li><li>Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+treatment+reduces+atherosclerosis+in+apo+E+knockout+mice.">Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).</li><li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+of+Lymphocytes+in+Mouse+Atherosclerotic+Plaque.">Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).</li><li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta+signaling+in+T+cells+promotes+stabilization+of+atherosclerotic+plaques+through+an+interleukin-17-dependent+pathway.">Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway.</a> Science Translational Medicine. 5 (196), (2013).</li><li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Density+Lipoprotein-Reactive+T+Cells+Regulate+Plasma+Cholesterol+Levels+and+Development+of+Atherosclerosis+in+Humanized+Hypercholesterolemic+Mice.">Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice.</a> Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).</li><li>Daugherty, A., Whitman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+atherosclerosis+in+mice.">Quantification of atherosclerosis in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 209, 293-309 (2003).</li><li>Baglione, J., Smith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assay+for+mouse+atherosclerosis+in+the+aortic+root.">Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root.</a> Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).</li><li>Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gamma-irradiation+and+bone+marrow+transplantation+on+atherosclerosis+in+LDL+receptor-deficient+mice.">Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).</li><li>Naghavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+vulnerable+plaque+to+vulnerable+patient:+a+call+for+new+definitions+and+risk+assessment+strategies:+Part+I.">From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I.</a> Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).</li><li>Seijkens, T. T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CD40-Induced+TRAF6+Signaling+in+Macrophages+Reduces+Atherosclerosis.">Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hart-en vaatziekten is de belangrijkste moordenaar in de wereld en nieuwe preventieve metingen zijn nodig2. Muismodellen van de ziekte bieden een uitgebreid platform voor onderzoek naar pathofysiologie en experimentele behandelingen13. Betrouwbare laesie grootte kwantificering is essentieel voor deze aanpak. De kwantificeringsmethoden verschillen echter tussen laboratoria. Standaardisatie en optimalisatie zijn een doorlopend proces sinds de jaren 198013,27,33,34. Aorta wortels zijn ontstaan als de meest populaire site om experimentele atherosclerose te kwantificeren. Dwarsdoorsneden van plaques maken vergelijking van plaque volume tussen groepen mogelijk. En gezicht preparaten zijn begunstigd voor laesie kwantificering in grotere segmenten van de aorta. De en gezichts methode visualiseert plaque hoeveelheid en maakt kwantificering van plaque gebied dekking mogelijk, maar neem geen plaque dikte in rekening. De biologische relevantie voor waargenomen verschillen wordt onderbouwd door coherente resultaten op verschillende locaties in de vaat boom. Evaluatie van atherosclerose ontwikkeling op verschillende locaties adressen mogelijke site specifieke effecten. Het effect van getransplanteerde hematopoietische cellen op atherosclerose ontwikkeling kan worden beoordeeld in hypercholesterolemic ldlr-/- chimeras. Echter, gehele lichaam bestraling beïnvloedt de atherosclerose proces met site specifieke effecten. Meer prominente atherosclerotische laesies worden ontwikkeld in de aorta wortel, terwijl de verminderde laesie ontwikkeling wordt waargenomen in aorta bogen35.
Belangrijk, niet alleen laesie grootte moet worden aangepakt in studies van experimentele atherosclerose. Samenstelling van de laesie is ook een belangrijke parameter. Verschillende plaque kenmerken zijn in verband gebracht met manifestaties van de ziekte bij de mens36. Seriële snijden van de aorta wortel laat verschillende secties beschikbaar voor zorgvuldige analyse van plaque samenstelling. Plaque ruptuur bij de mens wordt gekenmerkt door een dun vezelkapje met weinig gladde spiercellen, schaars collageengehalte en tekenen van ontsteking in de plaques36. Hoewel plaque ruptuur een zeldzaam voorval is in muizen modellen van atherosclerose, zijn markers voor plaque stabiliteit informatief om te evalueren. Translationele benaderingen kunnen mechanistische bevindingen van Muismodellen bevestigen en belangrijke kenmerken van de ziekte van de mens ontdekken31. Inflammatoire status van atherosclerotische plaques kan worden bepaald door immunohistochemie kleuring van VCAM-1, MHC klasse II, macrofagen, en lymfocyten30. Sommige protocollen gebruiken longitudinale secties in het coronale vlak van de aortaboog of de brachiocephalische slagader voor het meten van atherosclerotische laesie grootte en samenstelling37. Echter, deze alternatieve methode laat slechts enkele secties worden geanalyseerd, die de toepassingen beperkt.
Een eerste kritieke stap in dit protocol is de mogelijkheid om aorta's efficiënt te oogsten. Hand-oog coördinatie onder de Microscoop vereist praktijk en is cruciaal zowel voor de microdissectie en de daaropvolgende vastzetten van de aortaboog. De volgende kritieke stap in dit protocol is de verzameling van seriële secties van de aorta wortel. 80 opeenvolgende secties moeten worden verzameld voor elke muis, die zowel focus en geduld vereist. Methodologische vaardigheid kan de beschreven processen aanzienlijk versnellen. Niettemin, atherosclerotische laesie kwantificering is nog steeds een tijdrovende taak. Nieuwe technologie, geautomatiseerde hantering en beeldvorming bij kleine dieren kunnen de kwantificering van experimentele atherosclerose in de toekomst mogelijk maken. De progressie van atherosclerose is traag en de meeste experimentele protocollen in muismodellen duren meer dan vier maanden om13te voltooien. Daarom moeten aorta's worden verzameld op een geoptimaliseerde manier op eindpunten van de studie. Dit protocol biedt een uitgebreide handleiding om aorta's efficiënt te oogsten en de voorgestelde verwerking bereidt aorta's voor op multifunctioneel gebruik, waaronder de kwantificering van de laesie in aorta wortel, aortaboog en brachiocephalische slagader. Hopelijk kan het protocol verminderen experimentele variabiliteit, verbetering van de betrouwbaarheid van de resultaten, en leiden tot bevindingen die de weg zal effenen voor nieuwe behandelingen tegen atherosclerose.

Hart-en vaatziekten is de belangrijkste doodsoorzaak in de wereld met ischemische hartziekte en beroerte accounting voor een bij elke vier sterfgevallen1. De meeste gevallen worden veroorzaakt door atherosclerose, een ziekte die wordt gekenmerkt door een langzame ophoping van met vet beladen plaques met tekenen van chronische ontsteking in grote en middelgrote slagaders2. De ziekte blijft meestal onopgemerkt gedurende enkele decennia totdat een breuk of erosie van de plaque een arteriële trombose die leidt tot ischemische weefselschade uitlokken.
Een normale slagader bestaat uit een intima laag met endotheliale cellen en dun verdeelde gladde spiercellen, een medielaag met gladde spiercellen en elastische lamellen, en een omringende adventitiële laag met los bindweefsel3. Een intimale retentie van LDL offsets atherosclerose ontwikkeling4. Accumulatie en modificatie van lipoproteïnen leiden tot aggregatie en Entrapment binnen de arteriële intima5. Een ontstekingsreactie wordt opgeroepen door de gevangen en gemodificeerde lipoproteïnen6. Endotheelcellen beginnen met het uitdrukken van adhesiemoleculen, zoals VCAM-1 op plaatsen in de arteriële boom met turbulente doorbloeding, wat leidt tot rekrutering van circulerende monocyten en andere leukocyten7. De infiltrerende monocyten differentiëren in macrofagen die lipide met daaruit voortvloeiende transformatie naar macrofaag schuim cellen8.
Atherosclerose is bestudeerd in muismodellen met toenemende frequentie sinds het midden van de jaren 1980. C57BL/6 is de meest gebruikte inteelt muis stam voor deze studies, en wordt gebruikt als de genetische achtergrond voor de meerderheid van de genetisch gemodificeerde stammen9. Deze stam werd opgericht in de jaren 192010, en haar genoom werd gepubliceerd in 200211. Experimenten in muismodellen hebben verschillende voordelen: de kolonies reproduceren snel, huisvesting is ruimtebesparend en inteelt vermindert de experimentele variabiliteit. Het model maakt ook genetische manipulaties mogelijk, zoals gerichte gendeleties en het inbrengen van transgenen. Dit heeft geleid tot een nieuw pathofysiologisch begrip van de ziekte en nieuwe therapie targets12.
Wild-type C57BL/6 muizen zijn van nature resistent tegen atherosclerose. Ze hebben het grootste deel van de circulerende cholesterol in HDL, en complexe atherosclerotische laesies worden niet gevormd, zelfs wanneer gevoed een hoog-vet en hoog-cholesterol dieet13. Hypercholesterolemic muizen, zoals ApoE-/- op de C57BL/6-achtergrond, worden daarom gebruikt als experimentele modellen van atherosclerose14,15. Het ontbreken van ApoE schaadt hepatische opname van restant lipoproteïnen en ernstig mensen lipide metabolisme. In ApoE-/- muizen is Circulerend cholesterol overwegend in VLDL-deeltjes en ontwikkelen de muizen complexe atherosclerotische plaques op een regulier Chow-dieet.
Ldlr-/- muizen nabootsen de ontwikkeling van atherosclerose gezien bij mensen met Familiaire hypercholesterolemie16. De ldlr-/- muizen hebben een westers dieet nodig om atherosclerose17te ontwikkelen. Westerse dieet bootst menselijke voedselinname en bevat meestal 0,15% cholesterol. De LDL-receptor herkent ApoB100 en ApoE en bemiddelt de opname van LDL-deeltjes via endocytose. LDL-receptoren zijn fundamenteel voor de klaring van de lever van LDL uit omloop, terwijl de LDL-receptor expressie in hematopoietische cellen dit proces niet beïnvloedt. Dit opent de mogelijkheid voor beenmergtransplantatie van ldlr+/+ cellen in hypercholesterolemic ldlr-/- ontvangers en beoordeling van atherosclerose ontwikkeling. Beenmerg chimeras zijn vaak gebruikt voor het bestuderen van de deelname van hematopoietische cellen in experimentele atherosclerose. Echter, beenmergtransplantatie kan invloed hebben op de grootte en de samenstelling van atherosclerotische plaques, waardoor interpretatie van de resultaten dubbelzinnig.
Verschillende varianten van ApoE-/- en ldlr-/- muizen met aanvullende genetische veranderingen zijn ontwikkeld om specifieke processen van de ziekte te bestuderen18. Een voorbeeld is de humane APOB100-transgene ldlr-/- (hubl) muizen die het menselijk APOB100 gen van de volledige lengte19,20dragen. Deze muizen ontwikkelen hypercholesterolemie en atherosclerose op een regelmatige Chow dieet. Echter, de ontwikkeling van complexe atherosclerotische plaques duurt ten minste zes maanden en kortere experimentele protocollen meestal gebruiken westerse dieet21. Een grote fractie van plasma cholesterol circuleert in LDL-deeltjes, wat hubl -muizen een meer mens-achtige dyslipidemische lipoproteïne-profiel geeft in vergelijking met ApoE-/- en ldlr-/- muizen. Hubl muizen laten ook studies van humaan apoB toe als een autoantigen22.
De Muismodellen van atherosclerose ontwikkelen complexe atherosclerotische plaques met gedeelde kenmerken van de menselijke ziekte. Echter, de plaques zijn vrij resistent tegen breuk met daaropvolgende myocardinfarct. Atherotrombose wordt slechts sporadisch gedetecteerd en experimenteel uitdagend om23,24,25te beoordelen. Er zijn speciale modellen van plaque ruptuur ontwikkeld, maar het experimentele veld mist een betrouwbaar en reproduceerbaar model voor de beoordeling van plaque-stabiliserend middelen.
Kwantificering van atherosclerose is gemeld op tal van manieren in de literatuur. Recente inspanningen hebben getracht het experimentele ontwerp, de uitvoering en de rapportering van dierproeven te standaardiseren26. Onderzoekers hebben verschillende voorkeuren en technieken aangepast aan hun laboratoria. De meeste onderzoeksprojecten zijn ook uniek op een manier dat ze een aantal protocol modificaties nodig hebben. Door de multifactoriële aard van de ziekte variëren optimale controles tussen projecten. Lokale omstandigheden en gebrek aan standaardisatie kunnen waargenomen verschillen in ziekte ontwikkeling veroorzaken, wat de vooruitgang van het onderzoeksveld belemmert. Verschillen in experimentele variabiliteit betekent ook dat statistische vermogens berekeningen moeten worden gebaseerd op pilotstudies onder lokale omstandigheden.
Kwantificering van atherosclerose wordt aanbevolen op verschillende locaties in de vasculaire boom. Dit protocol beschrijft hoe u resultaten verkrijgen van de aorta wortel, de aortaboog en de brachiocephalische slagader in één muis, naast het verlaten van de rest van de thoracoabdominale aortvoor andere analyses. En gezichts preparaten maken een snelle kwantificering van met vet beladen plaques in de aortaboog mogelijk. De ziektelast in de brachiocephalische slagader kan ook worden gekwantificeerd als de monsters zorgvuldig worden weergegeven. Hoe meer tijd de kruisingen van de aorta wortel doorkruisen, laat verschillende secties beschikbaar voor een gedetailleerde evaluatie van de plaque samenstelling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20066.296</td>
			<td>For fixation of sections for immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black electrical insulation tape (50 mm wide)</td>
			<td>Any specialized retailer</td>
			<td>-</td>
			<td>To create pinning beds for aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417C</td>
			<td>Benchtop microcentrifuge.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork board</td>
			<td>Any specialized retailer</td>
			<td>-</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 560</td>
			<td>For serial cryosectioning of aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For rinsing and preparation of solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DC480</td>
			<td>5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors (10 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td>For general dissection of organs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5 (11 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500341</td>
			<td>For microdissection of aorta.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% (v/v)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.290</td>
			<td>Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.8%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.310</td>
			<td>Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>9713.1000</td>
			<td>Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>-</td>
			<td>Image analysis software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris forceps (10 cm, curved, serrated)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15915-G</td>
			<td>Used as anatomical forceps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1096341011</td>
			<td>Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaiser&#39;s glycerol gelatine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1092420100</td>
			<td>Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM LB2</td>
			<td>For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>1820</td>
			<td>Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (17 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501751-G</td>
			<td>For general dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503376</td>
			<td>For pinning of aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td>Polypropylene microtubes with snaplock cap.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 3 needles, 23 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>300800</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 3 needles, 27 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>302200</td>
			<td>For perfusion of mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette 500 &#181;L, K3 EDTA</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1341.100</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette 500 &#181;L, Lithium Heparin</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1345.100</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien insect pins, 0.10 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>For pinning of aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625</td>
			<td>Not classified as a hazardous substance or mixture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) cryomount</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>45830</td>
			<td>For embedding tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td>Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100x20 mm)</td>
			<td>Any cell culture supplier</td>
			<td>-</td>
			<td>Proposed as a storage container for pinned aortas.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper (grade 1001)</td>
			<td>Munktell</td>
			<td>120006</td>
			<td>For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 &#181;m).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater RNA stabilization reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76106</td>
			<td>For stabilization of RNA in tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>A surface decontamination solution that destroys RNases on contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3 (13 cm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard scalpel blade #10</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500239</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>For dissection and en face documentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4261</td>
			<td>Not classified as a hazardous substance or mixture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>To collect aortic root sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps (15 cm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501741-G</td>
			<td>For general dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek cryomolds (10x10x5 mm)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4565</td>
			<td>For embedding aortic roots in OCT.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors (8 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503378</td>
			<td>For microdissection of aorta.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of atherosclerosis in mice

Hart-en vaatziekten is de belangrijkste doodsoorzaak in de wereld. De onderliggende oorzaak in de meeste gevallen is atherosclerose, die deel uitmaakt van een chronische ontstekingsziekte. Experimentele atherosclerose studies hebben de rol van cholesterol en ontstekingen in het ziekteproces opgehelderd. Dit heeft geleid tot succesvolle klinische proeven met farmaceutische agentia die klinische manifestaties van atherosclerose verminderen. Zorgvuldige en goed gecontroleerde experimenten in muismodellen van de ziekte kunnen verder opheldering van de pathogenese van de ziekte, die niet volledig wordt begrepen. Gestandaardiseerde laesie analyse is belangrijk om de experimentele variabiliteit te verminderen en de reproduceerbaarheid te verhogen. Het bepalen van de laesie grootte in aorta wortel, aortaboog, en brachiocephalische slagader zijn gemeenschappelijke eindpunten in experimentele atherosclerose. Dit protocol biedt een technische beschrijving voor de evaluatie van atherosclerose op al deze sites in een enkele muis. Het protocol is vooral nuttig wanneer het materiaal beperkt is, zoals vaak het geval is wanneer genetisch gemodificeerde dieren worden gekarakteriseerd.

In muizen modellen van atherosclerose de meest prominente laesies hebben de neiging om te ontwikkelen in de aorta wortel en aortaboog. Dit protocol beschrijft de kwantificering van atherosclerose in de aorta wortel, de aortaboog en de brachiocephalische slagader in één muis. Meetbare laesies in thoracale afdalend aorta en abdominale aorta zijn alleen aanwezig bij dieren met voorschot ziekte. In dit protocol, deze onderdelen worden niet geanalyseerd voor atherosclerotische belasting, maar opgeslagen voor latere analyse van mRNA niveaus of andere analyses. Seriële secties van atherosclerotische laesies in de aorta wortel worden meestal weergegeven in een grafiek met laesie grootte op de y-as en de afstand tot de aorta sinus op de x-as28. Echte dwarsdoorsneden zijn cruciaal voor de kwantificering van de laesie grootte. Schuine secties kunnen de laesie groottes overschatten en een kanteling van slechts 20 ° kan het absolute laesie oppervlak overschatten met 15%29. Het berekenen van de laesie Fractie van het totale vaargebied maakt het resultaat echter minder gevoelig voor mogelijke hoek verschillen tijdens het snijden (figuur 4a). Een geschikte statistische methode voor het opsporen van verschillen tussen groepen is gewoonlijk een reguliere 2-weg variantie-analyse (ANOVA). De post-tests van bonferroni worden vervolgens uitgevoerd om verschillen op bepaalde niveaus op te sporen. Het minst significante verschil van Fisher Investments Europe kan ook worden gebruikt als vervolg test voor ANOVA. Het vermindert de waarschijnlijkheid van type II statistische fouten, maar geen rekening voor meerdere vergelijkingen. Daarnaast kan het illustratief zijn om het gebied onder de curve of de gemiddelde laesie grootte per muis te berekenen en de gegevens in een puntplot te presenteren om de individuele variatie binnen de groepen verder te visualiseren (figuur 4b).
Oil Red O is een in vet oplosbare heldere rode diazoverbinding-kleurstof, die neutrale lipiden vlekken. Polaire lipiden in celmembranen zijn niet bevlekt. Olie rode O-kleuring kan worden uitgevoerd op verse, bevroren of formaline-vaste monsters, maar niet op paraffine-ingesloten monsters als gevolg van het verwijderen van lipiden in het vereiste deparaffinisatie proces. Een kwantificering van lesional lipide accumulatie kan worden uitgevoerd door kleur drempelmethode de olie rood O positief gebied van totale laesie gebied (figuur 4c). Hematoxylin produceert een blauwe kleuring van celkernen, wat nuttig is om plaque morfologie te visualiseren. De rechter en linker coronaire slagaders afwijken meestal van de aorta rond 250 μm van de aorta sinus27, die vaak samenvallen met de meest prominente laesie maten. Dwarsdoorsneden uit deze regio worden vaak weergegeven als representatieve resultaten (figuur 4D).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig4.jpg"> Figuur 4: atherosclerotische laesies in de aorta wortel. (A) achtentwintig weken oude mannelijke beenmerg chimeras gevoed westerse dieet voor acht weken werden geëvalueerd om te bepalen van het effect van Smad7-deficiënte T cellen op atherosclerose ontwikkeling. Experimentele ldlr-/- chimeras kregen CD4-CRE+Smad7FL/FL beenmerg en controles ontvangen CD4-CRE+Smad7FL/+ beenmerg. De grafiek toont kwantificering van atherosclerotische laesie gebied van acht opeenvolgende secties, 100-800 μm van de aorta sinus weergegeven als laesie Fractie van het totale oppervlak van het vat (Cd4-CRE+Smad7FL/+/ldlr-/- n = 6, Cd4-CRE+Smad7FL/FL/ldlr-/- n = 9, 2-weg ANOVA met bonferroni post test, grafiek toont gemiddelde ± SEM, accolades geven significantieniveau aan voor stam vergelijking). B) het gecombineerde dot-plot en staafdiagram toont het gemiddelde atherosclerotische laesie gebied van de aorta wortel secties (CD4-CRE+Smad7FL/+/ldlr-/- n = 6, Cd4-CRE+Smad7FL/FL/ Ldlr-/- n = 9, student t-toets) (C) Fractie van olie rood O-gekleurd gebied in de laesies (CD4-CRE+Smad7FL/+/ldlr-/- n = 4, Cd4-CRE+Smad7FL/FL /Ldlr-/- n = 6, student t-toets, NS = niet-significant) (B-C) stippen vertegenwoordigen individuele muizen en staven tonen gemiddelde ± SEM.D) representatieve micro grafieken met olie rode O-kleuring (in rood kleur) van neutrale lipiden in de aorta wortel 300 μm van aorta sinus (50x vergroting), schaalbalk = 500 μm. *p ≤ 0,05, * * *p ≤ 0,001. Dit cijfer is gewijzigd van Gisterå et al.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Oil Red O kan worden gebruikt voor het verven van en gezicht bereide aorta's, maar dit protocol maakt gebruik van Soedan IV, een andere handige vetoplosbare diazoverbinding-kleurstof. Soedan IV visualiseert duidelijk atherosclerotische plaques in een oranje-rode kleur door kleuring lipiden, triglyceriden, en lipoproteïnen. Het verwijderen van de donkere achtergrond in representatieve beelden van de en gezicht aorta bogen kan de visuele weergave verbeteren (figuur 5a). De grootte van de laesie wordt gewoonlijk binnen groepen verdeeld, waardoor statistische tests met de t-toets van de student tussen groepen mogelijk zijn. Een puntplot dat zowel individuele muizen als het gemiddelde weergeeft, wat wordt vergeleken tussen groepen, is een informatieve manier om de resultaten weer te geven (Figuur 5b-C). Aangezien de variatie binnen groepen typisch verschilt tussen locaties in de vaat boom, zijn er meestal aparte vermogens berekeningen nodig. Onnodige variatie kan worden vermeden door methode vaardigheid en protocol standaardisatie. Het verkrijgen van statistisch significante resultaten is belangrijk, maar de biologische relevantie voor een waargenomen verschil moet altijd ook worden overwogen.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig5.jpg"> Figuur 5: atherosclerotische laesies in aortaboog en brachiocephalische slagader. A) representatieve en gezicht micro grafieken van aorta bogen met met vet beladen plaques die gekleurd zijn met Soedan IV (in oranje kleur) van 20 weken oude muizen voedden een westers dieet gedurende tien weken, samen gevisualiseerd. Schaalbalk = 2 mm. humane APOB100-transgene ldlr-/- (hubl) muizen werden gebruikt als controles en de experimentele groep bestond uit TCR-transgene muizen met LDL-reactieve T-cellen (BT1) gefokt tot hubl muizen. B) atherosclerotische laesies in de aortaboog (hubl n = 10, BT1xHuBL n = 12; Student t-toets). C) atherosclerotische laesies in de brachiocephalische slagader (hubl n = 8, BT1xHuBL n = 9, student t-toets). (B-C) Stippen vertegenwoordigen individuele muizen, staven tonen gemiddelde ± SEM. *p ≤ 0,05. Dit cijfer is gewijzigd van Gisterå et al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Aanvullend figuur 1: alternatieve organisatie van dia's voor seriële secties van de aorta wortel. Een vereenvoudigde systematische dia organisatie voor het verzamelen van secties uit de aorta wortel. De collectie maakt olie rood O kleuring voor lipiden en Immunohistochemie of immunofluorescentie kleuring mogelijk. Speciale dia's voor Picrosirius rode kleuring van collageen worden weggelaten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/2019-JoVE-Figure-S1.eps">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Atherosclerosis in Mice at JoVE.com

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Murine modellen van atherosclerose zijn nuttige instrumenten om te onderzoeken van pathogene trajecten op moleculair niveau, maar vereisen gestandaardiseerde kwantificering van de ontwikkeling van de laesie. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te bepalen van de laesie grootte in de grote arteriële vaten, met inbegrip van de aorta wortel, aortaboog, en brachiocephalische slagader.

Kwantificering van atherosclerose bij muizen

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Hart- en vaatziekten is wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. Muismodellen zijn nuttige hulpmiddelen voor het bestuderen van deze ziekte en ons protocol kan worden gebruikt om atherosclerose bij muizen te kwantificeren. Met behulp van dit protocol kan de grootte van de laesie worden gemeten op drie vasculaire locaties.De aortawortel, de aortaboog en de brachiocephalic slagader. De kwantificering van atherosclerose bij muizen kan een vervelende taak zijn. We hebben gedetailleerde stappen gegeven waarvan we hopen dat ze het proces kunnen versnellen.Sommige van deze stappen zijn moeilijk schriftelijk te beschrijven. We hopen dat deze video u zal helpen bij het verkrijgen van robuuste atherosclerotische laesiegrootteanalyse. Na het oogsten van een muis hart volgens de standaard protocollen, plaats het hart op een kurkbed, ventrale kant onder een ontleden microscoop en gebruik een naald om het hart vast te stellen aan de kurk door de top.Houd de basis van het hart met anatomische tangen, gebruik een scalpel gehouden in een hoek van 20 graden caudally in het sagittale vlak, en 20 graden cranially in het transversale vlak, weg te snijden de apicale twee derde van het hart. Sluit de aortawortel en de basis van het hart in een optimale snijtemperatuur verbinding, of OCT, en knijp zachtjes het hart met de tangen om de aortawortel te vullen met verbinding en om eventuele luchtbellen te verwijderen. Breng het monster naar de bodem van een cryomold gevuld met LGO met de aortawortel loodrecht op het onderste oppervlak en vries de verbinding op droogijs.Bewaar vervolgens het weefselmonster in een diepvrieszak bij min 80 graden Celsius tot cryosectioning. Om een pinning bed voor en gezichtsanalyse voor te bereiden, vouw een segment van paraffinewasfilm acht keer om een vlak oppervlak van 25 bij 25 mm te maken en zwarte elektrische isolatietape rond de film te wikkelen om een donkere achtergrond voor de aorta te maken. Plaats een label op de achterkant van de pinning bed en gebruik een loden potlood om de muis identificatienummer op te nemen.Breng de aortaboog naar de pinning bed en voeg een druppel PBS aan het weefsel. Met behulp van een stereomicroscoop reinigt u de aorta van het resterende periadventitial vetweefsel en gebruikt u Vannas-scharenschaar en Dumont om alle omringende vetweefsel voorzichtig weg te pellen zonder de aorta te manipuleren of te beschadigen. Introduceer vervolgens de Schaar Vannas in het aortalumen om het intimale oppervlak bloot te leggen.Begin met het snijden van de buitenste kromming van de opgaande boog in de distale richting, en blijf de takken opensnijden, inclusief de brachiocephalische slagader en spaar het dorsale deel van het dalende thoracale gebied. Om het intimale oppervlak weer te geven, opengesneden de mindere kromming en vouw de aorta open. Met behulp van een micro Castroviejo naaldhouder, zet de open boog aan de pinning bed met het stompe uiteinde van minuten insect pinnen zonder het uitrekken van het monster, voorzichtig buigen van de pinnen uit de buurt van het monster als het weefsel wordt gehouden op zijn plaats.Bewaar vervolgens de vastgemaakte boog met het gezicht naar beneden in een petrischaaltje PBS op vier graden Celsius. Voor Sudan IV kleuring, spoel het monster gedurende vijf minuten in een petrischaaltje van 70%-ethanol met de boog naar beneden, voordat u het exemplaar gedurende zeven minuten overzet naar een schotel van Sudan IV werkoplossing. Aan het einde van de incubatie spoelt u het monster met twee wasbeurten van drie minuten in 80% ethanol om het normale intimale oppervlak te ontvlekken, gevolgd door een laatste spoeling in PBS voordat het weefsel terugkeert naar de oorspronkelijke petrischaal.Dan verwerven micrografen onder een stereo microscoop aangesloten op een digitale camera op een 10X vergroting, het verkrijgen van beelden van de gespelde boog ondergedompeld in PBS, met behulp van kleine metalen gewichten aan de pinning bed te houden aan de onderkant van de petrischaal. Om cryosections van de ingebedde aortawortel te verkrijgen, stelt u de cryostattemperatuur op min 20 graden Celsius en de sectiedikte op 10 micrometer. Monteer het OCT-blok met de aortawortel op de monsterhouder met het ventriculaire weefsel naar buiten gericht.Beveilig de positionering met een aantal extra OCT indien nodig. De aortawortel moet nu loodrecht op het mes worden geplaatst. Verzamel de eerste controlesecties met hartspierweefsel op gewone microscoopdia's en controleer de progressie door het weefsel om de 200 micrometer onder een lichtmicroscoop.Wanneer de eerste aorta cusp verschijnt, kantel het monster naar het punt nul cusp om de sectie vlak uit te lijnen met de twee andere cusps en tellen elke 10 micrometer sectie die wordt gesneden vanaf punt nul verder. Begin met het verzamelen van secties voor analyse vanaf 90 micrometer en verder volgens de geplande dia, tot 800 micrometer van punt nul is bereikt. Het berekenen van de laesiefractie van het totale vatgebied van de aortawortel maakt de gegevens minder gevoelig voor mogelijke hoekverschillen tijdens het sectioneren.Bovendien kan het illustratief zijn om het gebied onder de curve of de atherotolaesiegrootte per muis te berekenen en de gegevens in een stipplot te presenteren om individuele variaties binnen groepen verder te visualiseren. Lesional lipide accumulatie kan worden gekwantificeerd door kleur thresholding olie rode O positieve gebieden van de totale laesie gebied. De rechter en linker kransslagaders meestal afwijken van de aorta ongeveer 250 micrometer van de aorta sinus die vaak samenvalt met de meest prominente laesie maten.Het verwijderen van de donkere achtergrond in representatieve afbeeldingen van de aortabogen van het gezicht kan het visuele display verbeteren. De laesiegrootte wordt meestal meestal verdeeld binnen groepen, waardoor statistische analyse met behulp van student t-test tussen groepen. We raden aan om met wat testmateriaal te oefenen totdat je voldoende vaardigheden hebt verkregen voor het verwerken van je experimentele monsters.Als de laesiegrootte tussen groepen verschilt, moet u het mechanisme bepalen, omdat een laesiesamenstellingsanalyse meestal de volgende stap is om na te streven.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³HV68 Infection in Mice

Meting van γHV68 infectie in Muizen

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Uitputting en reconstitutie van macrofagen in Muizen

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Meten Lokaal Anafylaxie in Muizen

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoog</sup&gt; T cellen in immunodeficiënte muizen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive bemonstering van Mucosal voering vloeistof voor de kwantificering van In Vivo bovenste luchtwegen immuun-bemiddelaar niveaus

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Kwantificering van antilichaam-afhankelijke versterking van het Zika-Virus in primaire menselijke cellen

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Isolatie en kwantificering van het Zikavirus van meerdere organen in een muis

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

Kwantificering van drie DNA-laesies door massaspectrometrie en beoordeling van de niveaus in weefsels van muizen die worden blootgesteld aan omgevings fijne deeltjes