Name: quantification of atherosclerosis in mice
Uploaded: 2019-06-12T15:00:00
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Wir danken allen ehemaligen Mitgliedern der experimentellen kardiovaskulären Forschungseinheit von Göran K Hansson, die im letzten Vierteljahrhundert an der Entwicklung dieses Protokolls mitgewirkt haben. Besonders dankbar sind wir für die Beiträge von Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson und Inger Bodin. Diese Arbeit wurde durch projektbezogene Zuschüsse 06816 und Linnaeus unterstützung 349-2007-8703 vom Schwedischen Forschungsrat und durch Zuschüsse der Schwedischen Herz-Lungen-Stiftung, des Stockholm County Council, der Professor Nanna Svartz Stiftung, Loo und Hans Osterman unterstützt. Foundation for Medical Research, Karolinska Institutet es Research Foundation and Foundation for Geriattric Diseases at Karolinska Institutet.

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind der Hauptkiller der Welt und neue präventive Messungen sind erforderlich2. Mausmodelle der Krankheit bieten eine umfassende Plattform für die Untersuchung der Pathophysiologie und experimentelle Behandlungen13. Eine zuverlässige Lesionengrößenquantifizierung ist für diesen Ansatz unerlässlich. Die Quantifizierungsmethoden unterscheiden sich jedoch von Labor zu Laboratorien. Standardisierung und Optimierung sind seit den 1980er Jahren ein kontinuierlicher Prozess13,27,33,34. Aortenwurzeln haben sich als die beliebteste Website zur Quantifizierung experimenteller Arteriosklerose herauskristallisiert. Querschnitte von Plaques ermöglichen den Vergleich des Plaquevolumens zwischen Gruppen. En-Face-Präparate werden für die Läsionsquantifizierung in größeren Segmenten der Aorta bevorzugt. Die En-Face-Methode visualisiert die Plaque-Menge und ermöglicht die Quantifizierung der Plaqueflächenabdeckung, berücksichtigt jedoch nicht die Plaquedicke. Die biologische Relevanz für beobachtete Unterschiede wird durch kohärente Ergebnisse an verschiedenen Stellen im Gefäßbaum untermauert. Die Bewertung der Entwicklung von Atherosklerose an verschiedenen Standorten befasst sich mit möglichen standortspezifischen Auswirkungen. Die Wirkung transplantierter hämatopoetischer Zellen auf die Entwicklung von Arteriosklerose kann bei hypercholesterolemmischen Ldlr-/- Chimären beurteilt werden. Die Ganzkörperbestrahlung wirkt sich jedoch auf den Arteriosklerose-Prozess mit standortspezifischen Wirkungen aus. In der Aortenwurzel werden prominentere atherosklerotische Läsionen entwickelt, während eine reduzierte Läsionsentwicklung in Aortenbögen beobachtet wird35.
Wichtig ist, dass nicht nur die Läsionsgröße in Studien zur experimentellen Arteriosklerose behandelt werden muss. Auch die Läsionszusammensetzung ist ein wichtiger Parameter. Mehrere Plaque-Merkmale wurden mit Manifestationen der Krankheit beim Menschen in Verbindung gebracht36. Serielle Schnitte der Aortenwurzel lassen mehrere Abschnitte für eine sorgfältige Analyse der Plaquezusammensetzung zur Verfügung. Plaquebruch beim Menschen ist durch eine dünne faserige Kappe mit wenigen glatten Muskelzellen, spärlichem Kollagengehalt und Entzündungszeichen in den Plaquesgekennzeichnet 36. Obwohl Plaquebruch ein seltenes Ereignis in Mausmodellen der Arteriosklerose ist, sind Marker für Plaquestabilität informativ zu bewerten. Translationale Ansätze könnten mechanistische Befunde aus Mausmodellen bestätigen und wichtige Merkmale menschlicher Krankheiten aufdecken31. Der entzündliche Status atherosklerotischer Plaques könnte durch immunhistochemische Färbung von VCAM-1, MHC-Klasse II, Makrophagen und Lymphozyten30bestimmt werden. Einige Protokolle verwenden Längsschnitte in der koronalen Ebene des Aortenbogens oder der brachiocephalen Arterie zur Messung der atherosklerotischen Läsionsgröße und Zusammensetzung37. Diese alternative Methode lässt jedoch nur wenige Abschnitte zu analysieren, was ihre Anwendungen einschränkt.
Ein erster wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist die Fähigkeit, Aortas effizient zu ernten. Die Hand-Augen-Koordination unter dem Mikroskop erfordert Übung und ist sowohl für die Mikrodissektion als auch für das anschließende Anheften des Aortenbogens von entscheidender Bedeutung. Der nächste wichtige Schritt in diesem Protokoll ist die Sammlung von seriellen Abschnitten aus dem Aortenstamm. Achtzig aufeinander folgende Abschnitte sollten für jede Maus gesammelt werden, was sowohl Konzentration als auch Geduld erfordert. Methodische Fähigkeiten könnten die beschriebenen Prozesse erheblich beschleunigen. Dennoch ist die atherosklerotische Läsionsquantifizierung immer noch eine zeitaufwändige Aufgabe. Neue Technologien, automatisierte handhabung und kleintierische Bildgebung könnten die Quantifizierung experimenteller Arteriosklerose in Zukunft erleichtern. Das Fortschreiten der Arteriosklerose ist langsam und die meisten experimentellen Protokolle in Mausmodellen dauern mehr als vier Monate, um13abzuschließen. Daher müssen Aortas an Studienendpunkten optimiert gesammelt werden. Dieses Protokoll bietet einen umfassenden Leitfaden für die effiziente Ernte von Aorten und die vorgeschlagene Verarbeitung bereitet Aortas für den mehrzweckbasierten Einsatz vor, einschließlich der Läsionsquantifizierung in Aortenwurzel, Aortenbogen und brachiocephaler Arterie. Hoffentlich kann das Protokoll die experimentelle Variabilität reduzieren, die Zuverlässigkeit der Ergebnisse erhöhen und zu Erkenntnissen führen, die den Weg für neue Behandlungen gegen Arteriosklerose ebnen.

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die Haupttodesursache in der Welt mit ischämischen Herzerkrankungen und Schlaganfall für einen von vier Todesfällen1. Die meisten Fälle werden durch Arteriosklerose verursacht, eine Krankheit, die durch eine langsame Ansammlung von lipidhaltigen Plaques mit Anzeichen einer chronischen Entzündung in großen und mittelgroßen Arterien gekennzeichnet ist2. Die Krankheit bleibt in der Regel über mehrere Jahrzehnte unbemerkt, bis ein Bruch oder eine Erosion der Plaque eine arterielle Thrombose hervorruft, die zu ischämischen Gewebeschäden führt.
Eine normale Arterie besteht aus einer Intimaschicht mit Endothelzellen und spärlich verteilten glatten Muskelzellen, einer Medienschicht mit glatten Muskelzellen und elastischen Lamellen und einer umgebenden Adventitialschicht mit losem Bindegewebe3. Eine intime Retention von LDL kompensiert die Entwicklung von Arteriosklerose4. Die Akkumulation und Modifikation von Lipoproteinen führt zur Aggregation und Einschließung innerhalb der arteriellen Intima5. Eine Entzündungsreaktion wird durch die gefangenen und modifizierten Lipoproteine6hervorgerufen. Endothelzellen beginnen, Adhäsionsmoleküle auszudrücken, wie VCAM-1 an Stellen im arteriellen Baum mit turbulentem Blutfluss, was zur Rekrutierung von zirkulierenden Monozyten und anderen Leukozyten führt7. Die infiltrierenden Monozyten differenzieren sich in Makrophagen, die Lipid mit der anschließenden Umwandlung in Makrophagenschaumzellen verschlingen8.
Atherosklerose wird seit Mitte der 1980er Jahre in Mausmodellen mit zunehmender Häufigkeit untersucht. C57BL/6 ist der am häufigsten verwendete Inzucht-Mausstamm für diese Studien, und es wird als genetischer Hintergrund für die Mehrheit der genetisch veränderten Stämme9verwendet. Dieser Stamm wurde in den 1920er Jahren gegründet10, und sein Genom wurde im Jahr 2002veröffentlicht 11. Experimente in Mausmodellen haben mehrere Vorteile: Die Kolonien vermehren sich schnell, das Gehäuse ist platzsparend, und Inzucht reduziert die experimentelle Variabilität. Das Modell ermöglicht auch genetische Manipulationen, wie gezielte Genlöschungen und das Einfügen von Transgenen. Dies hat zu einem neuen pathophysiologischenVerständnis der Krankheit und neuen Therapiezielen 12 geführt.
Wildtyp C57BL/6 Mäuse sind natürlich resistent gegen Arteriosklerose. Sie haben den größten Teil des zirkulierenden Cholesterins in HDL, und komplexe atherosklerotische Läsionen werden nicht gebildet, selbst wenn eine fettreiche und cholesterinreiche Diät gefüttert13. Hypercholesterinemische Mäuse, wie Apoe-/- auf dem C57BL/6-Hintergrund, werden daher als experimentelle Modelle der Arteriosklerose14,15verwendet. Der Mangel an ApoE beeinträchtigt die Leberaufnahme von Restlipoproteinen und stört den Fettstoffwechsel stark. Bei Apoe-/- Mäusen wird das zirkulierende Cholesterin hauptsächlich in VLDL-Partikeln zirkuliert, und die Mäuse entwickeln komplexe atherosklerotische Plaques auf einer regelmäßigen Chow-Diät.
Ldlr-/- Mäuse imitieren die Entwicklung von Arteriosklerose beim Menschen mit familiärer Hypercholesterinämie16. Die Ldlr-/- Mäuse brauchen eine westliche Diät, um Art der Art von Art zu entwickeln17. Westliche Ernährung imitiert menschliche Nahrungsaufnahme und enthält in der Regel 0,15% Cholesterin. Der LDL-Rezeptor erkennt ApoB100 und ApoE und vermittelt die Aufnahme von LDL-Partikeln durch Endozytose. LDL-Rezeptoren sind von grundlegender Bedeutung für die Leberclearance von LDL aus der Zirkulation, während LDL-Rezeptor-Expression in hämatopoetischen Zellen diesen Prozess nicht beeinflusst. Dies eröffnet die Möglichkeit einer Knochenmarktransplantation von Ldlr+/+ Zellen in hypercholesterinem Ldlr-/- Empfänger und Bewertung der Entwicklung von Arteriosklerose. Knochenmark Chimären wurden häufig verwendet, um die Beteiligung von hämatopoetischen Zellen an experimenteller Arteriosklerose zu untersuchen. Die Knochenmarktransplantation könnte jedoch die Größe und Zusammensetzung atherosklerotischer Plaques beeinflussen, wodurch die Interpretation der Ergebnisse mehrdeutig wird.
Verschiedene Varianten von Apoe-/- und Ldlr-/- Mäusen mit zusätzlichen genetischen Veränderungen wurden entwickelt, um spezifische Prozesse der Krankheit zu untersuchen18. Ein Beispiel sind menschliche APOB100-transgene Ldlr-/- (HuBL) Mäuse, die das volle menschliche APOB100 Gen19,20tragen. Diese Mäuse entwickeln Hypercholesterinämie und Arteriosklerose auf einer regelmäßigen Chow-Diät. Jedoch, die Entwicklung von komplexen atherosklerotischen Plaques dauert mindestens sechs Monate und kürzere experimentelle Protokolle verwenden in der Regel westliche Ernährung21. Ein großer Teil des Plasmacholesterins zirkuliert in LDL-Partikeln, was HuBL-Mäusen ein menschlicheres dyslipidemisches Lipoproteinprofil im Vergleich zu Apoe-/- und Ldlr-/- Mäusen verleiht. HuBL-Mäuse erlauben auch Studien des menschlichen ApoB als Autoantigen22.
Die Mausmodelle der Arteriosklerose entwickeln komplexe atherosklerotische Plaques mit gemeinsamen Merkmalen menschlicher Krankheiten. Allerdings sind die Plaques ziemlich resistent gegen Bruch mit anschließendem Myokardinfarkt. Die Atherothrombose ist nur sporadisch nachgewiesen und experimentell anspruchsvoll, um23,24,25zu beurteilen. Spezielle Modelle von Plaquebruch wurden entwickelt, aber dem Versuchsfeld fehlt ein zuverlässiges und reproduzierbares Modell für die Beurteilung von Plaque-Stabilisierungsmitteln.
Quantifizierung der Arteriosklerose wurde in vielerlei Hinsicht in der Literatur berichtet. Jüngste Bemühungen haben versucht, experimentelles Design, Durchführung und Berichterstattung über Tierstudien zu standardisieren26. Die Ermittler haben unterschiedliche Vorlieben und Techniken, die an ihre Laboratorien angepasst sind. Die meisten Forschungsprojekte sind auch in einer Weise einzigartig, dass sie einige Protokolländerungen erfordern. Aufgrund der multifaktoriellen Natur der Krankheit variieren optimale Kontrollen von Projekt zu Projekt. Lokale Bedingungen und mangelnde Standardisierung können zu beobachteten Unterschieden in der Krankheitsentwicklung führen, was den Fortschritt des Forschungsbereichs behindert. Unterschiede in der experimentellen Variabilität bedeuten auch, dass statistische Leistungsberechnungen auf Pilotstudien unter lokalen Bedingungen basieren müssen.
Die Quantifizierung von Arteriosklerose wird an mehreren Stellen im Gefäßbaum empfohlen. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Ergebnisse aus der Aortenwurzel, dem Aortenbogen und der brachiocephalen Arterie in einer einzigen Maus erhält, zusätzlich zum Verlassen des Rests der thorakoabdominalen Aorta für andere Analysen. En-Gesichtspräparate ermöglichen eine schnelle Quantifizierung von lipidbeladenen Plaques im Aortenbogen. Die Krankheitsbelastung in der brachiocephalen Arterie kann auch quantifiziert werden, wenn die Proben sorgfältig dargestellt werden. Der zeitaufwändigere Querschnitt der Aortenwurzel lässt mehrere Abschnitte für eine detaillierte Bewertung der Plaquezusammensetzung zur Verfügung.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20066.296</td>
			<td>For fixation of sections for immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black electrical insulation tape (50 mm wide)</td>
			<td>Any specialized retailer</td>
			<td>-</td>
			<td>To create pinning beds for aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417C</td>
			<td>Benchtop microcentrifuge.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork board</td>
			<td>Any specialized retailer</td>
			<td>-</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 560</td>
			<td>For serial cryosectioning of aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For rinsing and preparation of solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DC480</td>
			<td>5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors (10 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td>For general dissection of organs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5 (11 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500341</td>
			<td>For microdissection of aorta.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% (v/v)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.290</td>
			<td>Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.8%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.310</td>
			<td>Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>9713.1000</td>
			<td>Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>-</td>
			<td>Image analysis software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris forceps (10 cm, curved, serrated)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15915-G</td>
			<td>Used as anatomical forceps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1096341011</td>
			<td>Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaiser&#39;s glycerol gelatine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1092420100</td>
			<td>Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM LB2</td>
			<td>For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>1820</td>
			<td>Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (17 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501751-G</td>
			<td>For general dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503376</td>
			<td>For pinning of aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td>Polypropylene microtubes with snaplock cap.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 3 needles, 23 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>300800</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 3 needles, 27 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>302200</td>
			<td>For perfusion of mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette 500 &#181;L, K3 EDTA</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1341.100</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette 500 &#181;L, Lithium Heparin</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1345.100</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien insect pins, 0.10 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>For pinning of aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625</td>
			<td>Not classified as a hazardous substance or mixture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) cryomount</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>45830</td>
			<td>For embedding tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td>Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100x20 mm)</td>
			<td>Any cell culture supplier</td>
			<td>-</td>
			<td>Proposed as a storage container for pinned aortas.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper (grade 1001)</td>
			<td>Munktell</td>
			<td>120006</td>
			<td>For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 &#181;m).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater RNA stabilization reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76106</td>
			<td>For stabilization of RNA in tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>A surface decontamination solution that destroys RNases on contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3 (13 cm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard scalpel blade #10</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500239</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>For dissection and en face documentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4261</td>
			<td>Not classified as a hazardous substance or mixture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>To collect aortic root sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps (15 cm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501741-G</td>
			<td>For general dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek cryomolds (10x10x5 mm)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4565</td>
			<td>For embedding aortic roots in OCT.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors (8 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503378</td>
			<td>For microdissection of aorta.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of atherosclerosis in mice

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die Haupttodesursache der Welt. Die zugrunde liegende Ursache ist in den meisten Fällen Arteriosklerose, die zum Teil eine chronische entzündliche Erkrankung ist. Experimentelle Atherosklerose-Studien haben die Rolle von Cholesterin und Entzündungen im Krankheitsprozess aufgeklärt. Dies hat zu erfolgreichen klinischen Studien mit pharmazeutischen Wirkstoffen geführt, die klinische Manifestationen von Arteriosklerose reduzieren. Sorgfältige und gut kontrollierte Experimente an Mausmodellen der Krankheit könnten die Pathogenese der Krankheit weiter aufklären, was nicht vollständig verstanden wird. Eine standardisierte Läsionsanalyse ist wichtig, um die experimentelle Variabilität zu reduzieren und die Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Die Bestimmung der Läsionsgröße in Aortenwurzel, Aortenbogen und brachiocephaler Arterie sind häufige Endpunkte bei experimenteller Arteriosklerose. Dieses Protokoll enthält eine technische Beschreibung für die Bewertung von Arteriosklerose an allen diesen Standorten in einer einzigen Maus. Das Protokoll ist besonders nützlich, wenn Material begrenzt ist, wie es häufig der Fall ist, wenn gentechnisch veränderte Tiere charakterisiert werden.

Bei Mausmodellen der Arteriosklerose entwickeln sich die prominentesten Läsionen in der Aortenwurzel und im Aortenbogen. Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung von Arteriosklerose in der Aortenwurzel, dem Aortenbogen und der brachiocephalen Arterie in einer einzigen Maus. Messbare Läsionen in thorakal absteigender Aorta und Bauchaorta sind nur bei Tieren mit Vorerkrankungen vorhanden. In diesem Protokoll werden diese Teile nicht auf atherosklerotische Belastung analysiert, sondern für die nachfolgende Analyse von mRNA-Spiegeln oder anderen Analysen gespeichert. Serielle Abschnitte atherosklerotischer Läsionen in der Aortenwurzel werden in der Regel in einem Diagramm mit Läsionsgröße auf der y-Achse und Abstand zur Aortensinus auf der x-Achse28angezeigt. Echte Querschnitte sind entscheidend für die Quantifizierung der Läsionsgröße. Schräge Abschnitte können Läsionsgrößen überschätzen und eine Neigung von nur 20° könnte die absolute Läsionsfläche um 15%29überschätzen. Die Berechnung des Läsionsanteils der gesamten Gefäßfläche macht das Ergebnis jedoch weniger empfindlich gegenüber möglichen Winkelunterschieden während der Schnitte (Abbildung 4A). Eine geeignete statistische Methode zum Erkennen von Unterschieden zwischen Gruppen ist in der Regel eine regelmäßige 2-Wege-Analyse der Varianz (ANOVA). Bonferroni-Nachtests werden dann durchgeführt, um Unterschiede auf bestimmten Ebenen zu erkennen. Fishers geringster Unterschied könnte auch als Folgetest zu ANOVA verwendet werden. Es verringert die Wahrscheinlichkeit statistischer Fehler des Typs II, berücksichtigt jedoch nicht mehrere Vergleiche. Darüber hinaus könnte es veranschaulichend sein, die Fläche unter der Kurve oder die durchschnittliche Läsionsgröße pro Maus zu berechnen und die Daten in einem Punktdiagramm darzustellen, um die individuelle Variation innerhalb der Gruppen weiter zu visualisieren (Abbildung 4B).
Oil Red O ist ein fettlöslicher, leuchtend roter Diazofarbstoff, der neutrale Lipide färbt. Polare Lipide in Zellmembranen sind nicht gefärbt. Ölrote O Färbung kann auf frischen, gefrorenen oder formalinfixierten Proben durchgeführt werden, aber nicht auf Paraffin-eingebetteten Proben aufgrund der Entfernung von Lipiden in der erforderlichen Deparaffinierung Prozess. Eine Quantifizierung der lesionalen Lipidakkumulation könnte durch Farbschwellen der Ölrot O-positiven Fläche der gesamten Läsionsfläche durchgeführt werden (Abbildung 4C). Hämatoxylin produziert eine blaue Färbung von Zellkernen, die hilfreich ist, um Plaquemorphologie zu visualisieren. Die rechten und linken Herzkranzgefäße weichen in der Regel von der Aorta um 250 m von der Aortensinus27ab, die oft mit den prominentesten Läsionsgrößen zusammenfallen. Querschnitte aus dieser Region werden häufig als repräsentative Ergebnisse angezeigt (Abbildung 4D).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig4.jpg"> Abbildung 4: Atherosklerotische Läsionen in der Aortenwurzel. (A) Achtundzwanzig Wochen alte männliche Knochenmarkchimäre gefüttert westliche Ernährung für acht Wochen wurden ausgewertet, um die Wirkung von Smad7-mangelhafte T-Zellen auf die Entwicklung der Arteriosklerose zu bestimmen. Experimentelle Ldlr-/- Chimären erhielten Cd4-Cre+Smad7fl/fl Knochenmark und Kontrollen erhielten Cd4-Cre+Smad7fl/+ Knochenmark. Die Grafik zeigt die Quantifizierung des atherosklerotischen Läsionsbereichs aus acht aufeinanderfolgenden Abschnitten, 100 - 800 m aus der Aortensinus, die als Läsionsfraktion der gesamten Gefäßoberfläche dargestellt wird (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n=6, Cd4-Cre+Smad7fl/fl/Ldlr-/- n = 9, 2-Wege ANOVA mit Bonferronis Post-Test, Diagramm zeigt mittelwertige SEM, Klammern geben Signifikanzniveau für Dehnungsvergleich an). (B) Das kombinierte Punktdiagramm und Balkendiagramm zeigt den mittleren atherosklerotischen Läsionsbereich aus den Aortenwurzelabschnitten (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n=6, Cd4-Cre+Smad7fl/fl/ Ldlr-/- n = 9, Student es t-test) (C) Anteil des Öls Roter O-befleckter Bereich in den Läsionen (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n = 4, Cd4-Cre+Smad7fl/fl /Ldlr-/- n = 6, Student es t-test, ns=non-significant) (B-C) Punkte stellen einzelne Mäuse dar und Balken zeigen den Mittelwert von SEM. (D) Repräsentative Mikrographien, die Ölrot-O-Färbung zeigen (in rot Farbe) von neutralen Lipiden in der Aortenwurzel 300 m aus Aortensinus (50x Vergrößerung), Scale bar = 500 'm. *p - 0,05, ***p - 0,001. Diese Zahl wurde von Gistera et al.31geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Öl Red O könnte für die Färbung von en face vorbereiteten Aortas verwendet werden, aber dieses Protokoll verwendet Sudan IV, ein weiterer bequemer fettlöslicher Diazofarbstoff. Sudan IV visualisiert atherosklerotische Plaques in orange-roter Farbe deutlich, indem es Lipide, Triglyceride und Lipoproteine färbt. Das Entfernen des dunklen Hintergrunds in repräsentativen Bildern der en face aortenäsischen Bögen könnte die visuelle Darstellung verbessern (Abbildung 5A). Normalerweise wird die Läsionsgröße in Gruppen verteilt, was statistische Tests mit dem T-Test des Schülers zwischen Gruppen ermöglicht. Ein Punktdiagramm, das sowohl einzelne Mäuse als auch den Mittelwert zeigt, der zwischen Gruppen verglichen wird, ist eine informative Möglichkeit, die Ergebnisse anzuzeigen (Abbildung 5B-C). Da die Variation innerhalb von Gruppen in der Regel zwischen den Positionen im Gefäßbaum unterschiedlich ist, sind in der Regel separate Leistungsberechnungen erforderlich. Unnötige Abweichungen können durch Methodenkompetenz und Protokollstandardisierung vermieden werden. Die Erlangung statistisch signifikanter Ergebnisse ist wichtig, aber die biologische Relevanz für einen beobachteten Unterschied muss immer auch berücksichtigt werden.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig5.jpg"> Abbildung 5: Atherosklerotische Läsionen in Aortenbogen und brachiocephaler Arterie. (A) Repräsentative En-Face-Mikroskope von Aortenbögen mit lipidhaltigen Plaques, die mit Sudan IV (in orange Farbe) von 20 Wochen alten Mäusen gefärbt sind, fütterten die westliche Ernährung für zehn Wochen, zusammen visualisiert. Skala bar = 2 mm. Menschliche APOB100-transgene Ldlr-/- (HuBL) Mäuse wurden als Kontrollen verwendet und die experimentelle Gruppe bestand aus TCR-transgenen Mäusen mit LDL-reaktiven T-Zellen (BT1) gekreuzt zu HuBL-Mäusen. (B) Atherosklerotische Läsionen im Aortenbogen (HuBL n = 10, BT1xHuBL n = 12; Schüler t-test). (C) Atherosklerotische Läsionen in der brachiocephalen Arterie (HuBL n = 8, BT1xHuBL n = 9, Student es t-test). (B-C) Punkte stellen einzelne Mäuse dar, Balken zeigen den Mittelwert "SEM. *p - 0,05" an. Diese Zahl wurde von Gistera et al.32geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Alternative Organisation von Folien für serielle Abschnitte der Aortenwurzel. Eine vereinfachte systematische Folienorganisation für die Sammlung von Abschnitten aus der Aortenwurzel. Die Sammlung ermöglicht Oil Red O Färbung für Lipide und Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz Färbung. Spezielle Dias für Picrosirius rote Färbung von Kollagen werden weggelassen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/2019-JoVE-Figure-S1.eps">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Quantification of Atherosclerosis in Mice

Murine Modelle der Arteriosklerose sind nützliche Werkzeuge, um pathogene Pfade auf molekularer Ebene zu untersuchen, erfordern aber eine standardisierte Quantifizierung der Läsionsentwicklung. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Bestimmung der Läsionsgröße in den hauptartiellen Gefäßen, einschließlich der Aortenwurzel, des Aortenbogens und der brachiocephalen Arterie.

Quantifizierung von Atherosklerose bei Mäusen

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die Haupttodesursache. Mausmodelle sind nützliche Werkzeuge für die Untersuchung dieser Krankheit und unser Protokoll kann verwendet werden, um Arteriosklerose bei Mäusen zu quantifizieren. Mit diesem Protokoll kann die Läsionsgröße an drei Gefäßstellen gemessen werden.Die Aortenwurzel, der Aortenbogen und die brachiocephale Arterie. Die Quantifizierung von Arteriosklerose bei Mäusen kann eine mühsame Aufgabe sein. Wir haben detaillierte Schritte vorgelegt, von denen wir hoffen, dass sie den Prozess beschleunigen können.Einige dieser Schritte sind schwer schriftlich zu beschreiben. Wir hoffen, dass dieses Video Ihnen helfen wird, eine robuste atherosklerotische Läsionsgrößenanalyse zu erhalten. Nach der Ernte eines Mausherzes nach Standardprotokollen, legen Sie das Herz auf ein Korkbett, ventrale Seite nach oben unter einem Sezieren Mikroskop und verwenden Sie eine Nadel, um das Herz an den Korken durch die Spitze zu fixieren.Halten Sie die Basis des Herzens mit anatomischen Zangen, verwenden Sie ein Skalpell in einem 20-Grad-Winkel kauadtinförmig in der sagittalen Ebene gehalten, und 20 Grad cranially in der transversalen Ebene, um die apikalen zwei Drittel des Herzens zu schneiden. Die Aortenwurzel und die Basis des Herzens in eine optimale Schnitttemperatur-Verbindung oder OCT einbetten und das Herz vorsichtig mit der Zange drücken, um die Aortenwurzel mit Verbindung zu füllen und Luftblasen zu entfernen. Übertragen Sie die Probe auf den Boden eines mit OCT gefüllten Kryomolds mit der Aortenwurzel senkrecht zur Bodenoberfläche und frieren Sie die Verbindung auf Trockeneis ein.Dann die Gewebeprobe in einem Gefrierbeutel bei minus 80 Grad Celsius bis zum Kryosektionen aufbewahren. Um ein Pinning-Bett für die En-Face-Analyse vorzubereiten, falten Sie ein Segment von Paraffin-Wachsfolie acht mal, um eine flache 25 x 25 mm Oberfläche zu machen und wickeln Sie schwarze elektrische Isolationsband um den Film, um einen dunklen Hintergrund für die Aorta zu machen. Legen Sie ein Etikett auf die Rückseite des Anheftenbettes und notieren Sie die Maus-Identifikationsnummer mit einem Bleistift.Übertragen Sie den Aortenbogen auf das Pinning-Bett und fügen Sie dem Gewebe einen Tropfen PBS hinzu. Reinigen Sie die Aorta mit hilfe eines Stereomikroskops vom verbleibenden periadventitialen Fettgewebe und verwenden Sie Vannas Schere und Dumont-Zangen, um das gesamte umgebende Fettgewebe sanft abzuschälen, ohne die Aorta zu manipulieren oder zu beschädigen. Als nächstes führen Sie die Vannas-Schere in das aortenhafte Lumen ein, um die Intimoberfläche freizulegen.Beginnen Sie, die äußere Krümmung des aufsteigenden Bogens in distaler Richtung zu schneiden, die Zweige, einschließlich der brachiocephalen Arterie, weiter zu schneiden und den dorsalen Teil der absteigenden Brustregion zu schonen. Um die Intimfläche anzuzeigen, schneiden Sie die kleinere Krümmung auf und falten Sie die Aorta. Mit einem Mikro-Castroviejo-Nadelhalter den offenen Bogen zum Pinning-Bett mit dem stumpfen Ende der Minuten-Insektenstifte sichern, ohne die Probe zu dehnen, und biegen Sie die Stifte sanft von der Probe weg, während das Gewebe an Ort und Stelle gehalten wird.Dann den gepinnten Bogen verdeckt in einer Petrischale von PBS bei vier Grad Celsius aufbewahren. Für sudanesische IV Färbung, spülen Sie das Exemplar für fünf Minuten in einer Petrischale von 70%Ethanol mit dem Bogen nach unten, bevor Sie das Exemplar auf eine Schale von Sudan IV Arbeitslösung für sieben Minuten übertragen. Am Ende der Inkubation spülen Sie die Probe mit zwei dreiminütigen Wärten in 80% Ethanol ab, um die normale Intimoberfläche zu entfärben, gefolgt von einer endgültigen Spülung in PBS, bevor das Gewebe in seine ursprüngliche Petrischale zurückgebracht wird.Dann erhalten Sie Mikrographen unter einem Stereomikroskop, das mit einer Digitalkamera bei einer 10-fachen Vergrößerung verbunden ist, und erhalten Sie Bilder des in PBS getauchten gepinnten Bogens, indem Sie kleine Metallgewichte verwenden, um das Pinnbett an der Unterseite der Petrischale zu halten. Um Kryosections der eingebetteten Aortenwurzel zu erhalten, stellen Sie die Kryostattemperatur auf minus 20 Grad Celsius und die Schnittdicke auf 10 Mikrometer ein. Montieren Sie den OCT-Block, der die Aortenwurzel auf dem Probenhalter enthält, wobei das ventrikuläre Gewebe nach außen gerichtet ist.Sichern Sie die Positionierung bei Bedarf mit einem zusätzlichen OCT. Die Aortenwurzel sollte nun senkrecht zur Messerklinge positioniert werden. Sammeln Sie die ersten Kontrollabschnitte mit Herzmuskelgewebe auf gewöhnlichen Mikroskop-Dias und überprüfen Sie alle 200 Mikrometer unter einem Lichtmikroskop das Fortschreiten durch das Gewebe.Wenn die erste Aortenspitze erscheint, neigen Sie die Probe in Richtung der Punkt-Null-Spitze, um die Schnittebene an den beiden anderen Spitzen auszurichten, und zählen Sie jeden 10-Mikrometer-Abschnitt, der von Punkt Null abgeschnitten wird. Beginnen Sie mit dem Sammeln von Abschnitten für die Analyse ab 90 Mikrometern und nach dem geplanten Dia, bis 800 Mikrometer von Punkt Null erreicht sind. Die Berechnung des Läsionsanteils der gesamten Gefäßfläche der Aortenwurzel macht die Daten weniger empfindlich gegenüber möglichen Winkelunterschieden während des Schnitts.Darüber hinaus könnte es veranschaulichend sein, die Fläche unter der Kurve oder die Atherotoläsionsgröße pro Maus zu berechnen und die Daten in einem Punktdiagramm darzustellen, um einzelne Variationen innerhalb von Gruppen weiter zu visualisieren. Lesionale Lipidakkumulation kann durch Farbschwellen Öl rot O positive Bereiche der gesamten Läsionsfläche quantifiziert werden. Die rechten und linken Herzkranzgefäße weichen in der Regel um 250 Mikrometer von der Aorta von der Aortensinus ab, die oft mit den prominentesten Läsionsgrößen übereinstimmt.Das Entfernen des dunklen Hintergrunds in repräsentativen Bildern der en face aortenäsischen Bögen kann die visuelle Darstellung verbessern. Die Läsionsgröße ist in der Regel innerhalb von Gruppen verteilt, sodass statistische Analysen mithilfe des T-Tests von Student zwischen Gruppen möglich sind. Wir empfehlen Ihnen, mit einigem Testmaterial zu üben, bis Sie ausreichende Fähigkeiten für die Verarbeitung Ihrer experimentellen Proben erworben haben.Wenn die Läsionsgröße zwischen Gruppen unterschiedlich ist, sollten Sie den Mechanismus bestimmen, da eine Läsionszusammensetzungsanalyse in der Regel der nächste Schritt ist.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³HV68 Infection in Mice

Die Messung der γHV68 Infektion bei Mäusen

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Mess Lokale Anaphylaxie bei Mäusen

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Charakterisierung der Thymus-abhängig und Thymus-unabhängige Immunglobulin Isotype Antworten bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Quantifizierung der Antikörper-abhängige Verstärkung der Zika-Virus in primären humanen Zellen

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Isolierung und Quantifizierung des Zika-Virus aus mehreren Organen in einer Maus

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

Quantifizierung von drei DNA-Mäsionen durch Massenspektrometrie und Bewertung ihrer Niveaus in den Themen von Mäusen, die der zämatten Feinstaub ausgesetzt sind