Name: quantification of atherosclerosis in mice
Uploaded: 2019-06-12T15:00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Atherosclerosis in Mice at JoVE.com

Vi takker alle tidligere medlemmer av Göran K Hansson eksperimentelle kardiovaskulær forskning enhet som bidro til å utvikle denne protokollen i løpet av det siste kvartalet-tallet. Vi er spesielt takknemlige for bidragene fra Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson og Inger Bodin. Dette arbeidet ble støttet av prosjekt stipend 06816 og von Linné støtte 349-2007-8703 fra det svenske Forskningsrådet, og ved tilskudd fra det svenske Heart-Lung Foundation, Stockholm County Council, professor Nanna Svartz stiftelse, LoO og hans Osterman Stiftelsen for medisinsk forskning, Karolinska Institutet ' s Research Foundation og Foundation for alders medisinske sykdommer ved Karolinska Institutet.

<ol>
	<li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010.">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).</li><li>Gistera, A., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+atherosclerosis.">The immunology of atherosclerosis.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 368-380 (2017).</li><li>Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+atherosclerosis,+and+coronary+artery+disease.">Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease.</a> New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).</li><li>Williams, K. J., Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response-to-retention+hypothesis+of+early+atherogenesis.">The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).</li><li>Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+LDL+-+trigger+of+atherosclerosis+and+inflammation+in+the+arterial+intima.">Modified LDL - trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima.</a> Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).</li><li>Ruuth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+low-density+lipoprotein+particles+to+aggregate+depends+on+particle+lipidome,+is+modifiable,+and+associates+with+future+cardiovascular+deaths.">Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths.</a> European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).</li><li>Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+VCAM-1+and+ICAM-1+at+atherosclerosis-prone+sites+on+the+endothelium+in+the+ApoE-deficient+mouse.">Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).</li><li>Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+on+macrophages+that+mediates+uptake+and+degradation+of+acetylated+low+density+lipoprotein,+producing+massive+cholesterol+deposition.">Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).</li><li>Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+susceptibility+to+atherosclerosis+among+inbred+strains+of+mice.">Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice.</a> Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).</li><li>Russell, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+history+of+mouse+inbred+strains:+contributions+of+Clarence+Cook+Little.">Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little.</a> Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).</li><li>Waterston, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+comparative+analysis+of+the+mouse+genome.">Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.</a> Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).</li><li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-driven+immunometabolic+responses+in+atherosclerosis.">Lipid-driven immunometabolic responses in atherosclerosis.</a> Current Opinion in Lipidology. 29 (5), 375-380 (2018).</li><li>Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+atherosclerosis.">Mouse models of atherosclerosis.</a> Current Protocols in Immunology. Chapter 15, (2012).</li><li>Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hypercholesterolemia+and+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice+created+by+homologous+recombination+in+ES+cells.">Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells.</a> Cell. 71 (2), 343-353 (1992).</li><li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E.">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258 (5081), 468-471 (1992).</li><li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery.">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).</li><li>Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+xanthomatosis+and+atherosclerosis+in+cholesterol-fed+low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice.">Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).</li><li>Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-based+therapies+for+atherosclerosis.">T cell-based therapies for atherosclerosis.</a> Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).</li><li>Skalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subendothelial+retention+of+atherogenic+lipoproteins+in+early+atherosclerosis.">Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis.</a> Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).</li><li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+low+density+lipoprotein+receptor-binding+site+in+apolipoprotein+B100+and+the+modulation+of+its+binding+activity+by+the+carboxyl+terminus+in+familial+defective+apo-B100.">Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100.</a> Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).</li><li>Sanan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice+expressing+human+apolipoprotein+B-100+develop+complex+atherosclerotic+lesions+on+a+chow+diet:+no+accentuation+by+apolipoprotein(a).">Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).</li><li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+against+T-cell+epitopes+of+native+ApoB100+reduces+vascular+inflammation+and+disease+in+a+humanized+mouse+model+of+atherosclerosis.">Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis.</a> Journal of Internal Medicine. , (2017).</li><li>Johnson, J. L., Jackson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerotic+plaque+rupture+in+the+apolipoprotein+E+knockout+mouse.">Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse.</a> Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).</li><li>Calara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+plaque+rupture+and+secondary+thrombosis+in+apolipoprotein+E-deficient+and+LDL+receptor-deficient+mice.">Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice.</a> The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).</li><li>Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+infarction+mediated+by+endothelin+receptor+signaling+in+hypercholesterolemic+mice.">Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).</li><li>Daugherty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendation+on+Design,+Execution,+and+Reporting+of+Animal+Atherosclerosis+Studies:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), (2017).</li><li>Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+atherosclerotic+lesions+in+mice.">Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice.</a> Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).</li><li>Purcell-Huynh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+high+levels+of+human+apolipoprotein+B+develop+severe+atherosclerotic+lesions+in+response+to+a+high-fat+diet.">Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet.</a> Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).</li><li>Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+treatment+reduces+atherosclerosis+in+apo+E+knockout+mice.">Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).</li><li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+of+Lymphocytes+in+Mouse+Atherosclerotic+Plaque.">Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).</li><li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta+signaling+in+T+cells+promotes+stabilization+of+atherosclerotic+plaques+through+an+interleukin-17-dependent+pathway.">Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway.</a> Science Translational Medicine. 5 (196), (2013).</li><li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Density+Lipoprotein-Reactive+T+Cells+Regulate+Plasma+Cholesterol+Levels+and+Development+of+Atherosclerosis+in+Humanized+Hypercholesterolemic+Mice.">Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice.</a> Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).</li><li>Daugherty, A., Whitman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+atherosclerosis+in+mice.">Quantification of atherosclerosis in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 209, 293-309 (2003).</li><li>Baglione, J., Smith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assay+for+mouse+atherosclerosis+in+the+aortic+root.">Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root.</a> Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).</li><li>Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gamma-irradiation+and+bone+marrow+transplantation+on+atherosclerosis+in+LDL+receptor-deficient+mice.">Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).</li><li>Naghavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+vulnerable+plaque+to+vulnerable+patient:+a+call+for+new+definitions+and+risk+assessment+strategies:+Part+I.">From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I.</a> Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).</li><li>Seijkens, T. T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CD40-Induced+TRAF6+Signaling+in+Macrophages+Reduces+Atherosclerosis.">Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Kardiovaskulær sykdom er den viktigste morderen i verden og nye forebyggende målinger er nødvendig2. Mouse modeller av sykdommen gir en omfattende plattform for etterforskning av patofysiologi og eksperimentelle behandlinger13. Kvantifisering av pålitelig lesjon er viktig for denne tilnærmingen. Kvantifisering metoder varierer imidlertid mellom laboratorier. Standardisering og optimering ha blitt en igangværende forarbeide siden det 1980 '13,27,33,34. Aorta røtter har dukket opp som det mest populære området for å kvantifisere eksperimentelle aterosklerose. Tverrsnitt av plaketter gjør det mulig å sammenligne plakk volum mellom grupper. En ansikt preparater foretrekkes for lesjon kvantifisering i større segmenter av aorta. Den en ansikts metode visualiserer plakk kvantitet og muliggjør kvantifisering av plakk området dekning, men ikke ta plakk tykkelse i betraktning. Den biologiske relevansen for observerte forskjeller er dokumentert av sammenhengende resultater på forskjellige steder i det vaskulære treet. Vurderer aterosklerose utvikling på ulike steder adresser mulig områdespesifikke effekter. Effekten av transplantert blodkreft celler på aterosklerose utvikling kan vurderes i hypercholesterolemic Ldlr-/- chimeras. Men, hele kroppen bestråling påvirker aterosklerose prosessen med området spesifikke effekter. Mer fremtredende aterosklerotiske lesjoner er utviklet i aorta roten, mens redusert lesjon utvikling er observert i aorta buer35.
Viktigere, ikke bare lesjon størrelse må tas opp i studier av eksperimentell aterosklerose. Sammensetning av lesjon er også en nøkkel parameter. Flere plakk funksjoner har blitt assosiert med manifestasjoner av sykdommen hos mennesker36. Seriell snitting av aorta roten etterlater flere seksjoner tilgjengelig for nøye analyse av plakk sammensetning. Plakk brudd hos mennesker er preget av en tynn fiber lue med få glatte muskelceller, sparsom kollagen innhold og tegn på betennelse i plaketter36. Selv om plakk brudd er en sjelden hendelse i musemodeller av aterosklerose, markører for plakk stabilitet er informative å evaluere. Translational tilnærminger kan bekrefte mekanistisk funn fra musemodeller og avdekke viktige trekk ved menneskelig sykdom31. Inflammatorisk status aterosklerotiske plaketter kan bestemmes ved immunhistokjemi farging av VCAM-1, MHC klasse II, makrofager, og lymfocytter30. Noen protokoller bruker langsgående seksjoner i koronale planet av aorta buen eller truncus brachiocephalicus arterien for måling aterosklerotiske lesjon størrelse og sammensetning37. Imidlertid, denne alternativ metoden blader bare få avdelinger å bli analysert, hvilke rammer dens søknadene.
En innledende kritisk skritt i denne protokollen er evnen til å høste aortas effektivt. Hånd-øye-koordinasjon under mikroskopet krever praksis og er avgjørende både for microdissection og den påfølgende låsing av aorta buen. Det neste kritiske trinnet i denne protokollen er samlingen av serielle seksjoner fra aorta roten. 80 påfølgende seksjoner skal samles for hver mus, som krever både fokus og tålmodighet. Metodisk kompetanse kan øke hastigheten på de beskrevne prosessene betraktelig. Likevel er aterosklerotiske lesjon kvantifisering fortsatt en tidkrevende oppgave. Ny teknologi, automatisert håndtering, og små dyr Imaging kan forenkle kvantifisering av eksperimentelle aterosklerose i fremtiden. Progresjon av aterosklerose er langsom og mest eksperimentelle protokoller i musemodeller ta mer enn fire måneder å fullføre13. Derfor må aortas samles på en optimalisert måte ved studie endepunkter. Denne protokollen gir en omfattende guide for å høste aortas effektivt og den foreslåtte behandlingen forbereder aortas for multi-purpose bruk inkludert lesjon kvantifisering i aorta rot, aorta Arch, og truncus brachiocephalicus arterien. Forhåpentligvis protokollen kan redusere eksperimentell variasjon, forbedre påliteligheten av resultater, og føre til funn som vil bane vei for nye behandlinger mot aterosklerose.

Hjerte-og karsykdommer er den viktigste dødsårsaken i verden med iskemisk hjertesykdom og hjerneslag regnskap for en i hver fire dødsfall1. De fleste tilfellene er forårsaket av aterosklerose, en sykdom preget av en langsom oppbygging av lipid-Laden plaketter med tegn på kronisk betennelse i store-og mellom store arterier2. Sykdommen er vanligvis ubemerket over flere ti år før et brudd eller erosjon av plakk utløser en arteriell trombose som fører til iskemisk vev skade.
En normal arterie består av et intima lag med endothelial celler og tynt distribuerte glatte muskelceller, et medium lag med glatte muskelceller og elastisk Lamellae, og en omkringliggende adventitial lag med løs bindevev3. En intimal oppbevaring av LDL forskyvninger aterosklerose utvikling4. Akkumulering og modifisering av lipoproteiner fører til aggregering og fast i arteriell intima5. En inflammatorisk reaksjon er fremkalt av fanget og modifisert lipoproteiner6. Endothelial celler begynner å uttrykke vedheft molekyler, for eksempel VCAM-1 på områder i arteriell treet med turbulent blodstrøm, fører til rekruttering av sirkulerende monocytter og andre leukocytter7. Den infiltrere monocytter differensiere til makrofager som sluker lipid med påfølgende transformasjon til macrophage skumceller8.
Åreforkalkning har blitt studert i mus modeller med økende frekvens siden midten av 1980-tallet. C57BL/6 er den mest brukte innavlet musen belastning for disse studiene, og det er brukt som genetisk bakgrunn for flertallet av genetisk modifiserte stammer9. Denne stammen ble etablert i 1920-tallet10, og dens Genova ble utgitt i 200211. Eksperimenter i musemodeller har flere fordeler: koloniene reproduserer raskt, boliger er plassbesparende, og innavl reduserer eksperimentell variasjon. Modellen gir også mulighet for genetisk manipulasjoner, slik som målrettede gen slettinger og innsetting av transgenes. Dette har ført til ny patofysiologiske forståelse av sykdommen og nye behandlingsmål12.
Wild-type C57BL/6 mus er naturlig motstandsdyktig mot aterosklerose. De har det meste av sirkulerende kolesterol i HDL, og komplekse aterosklerotiske lesjoner er ikke dannet selv når matet en høy-fett og høy-kolesterol diett13. Hypercholesterolemic mus, for eksempel Apoe-/- på C57BL/6-bakgrunn, blir derfor brukt som eksperimentelle modeller av aterosklerose14,15. Mangelen på ApoE svekker hepatic opptak av rest lipoproteiner og alvorlig perturbs lipid metabolisme. I Apoe-/- mus, sirkulerende kolesterol er overveiende i VLDL partikler, og musene utvikle komplekse aterosklerotiske plaketter på en vanlig Chow diett.
Ldlr-/- mus etterligne utviklingen av aterosklerose sett hos mennesker med familiær hyperkolesterolemi16. Den Ldlr-/- mus trenger en vestlig type Diet å utvikle aterosklerose17. Vestlig kosthold etterligner menneskelig matinntak og vanligvis inneholder 0,15% kolesterol. LDL-reseptoren gjenkjenner ApoB100 og ApoE og formidler opptak av LDL-partikler gjennom endocytose. LDL-reseptorer er grunnleggende for leveren clearance av LDL fra sirkulasjon, mens LDL reseptor uttrykk i blodkreft celler påvirker ikke denne prosessen. Dette åpner muligheten for benmarg transplantasjon av Ldlr+/+ celler til hypercholesterolemic Ldlr-/- mottakere og vurdering av aterosklerose utvikling. Benmarg chimeras har ofte blitt brukt til å studere deltakelse av blodkreft celler i eksperimentell aterosklerose. Men, benmarg transplantasjon kan påvirke størrelsen og sammensetningen av aterosklerotiske plaketter, noe som gjør tolkning av resultatene tvetydig.
Ulike varianter av Apoe-/- og Ldlr-/- mus med flere genetiske endringer er utviklet for å studere spesifikke prosesser av sykdommen18. Et eksempel er humant APOB100-transgene Ldlr-/- (HuBL) mus som bærer full-length humant APOB100 gen19,20. Disse musene utvikle hyperkolesterolemi og aterosklerose på en vanlig Chow diett. Imidlertid tar utviklingen av komplekse aterosklerotiske plaketter minst seks måneder og kortere eksperimentelle protokoller vanligvis bruker vestlig kosthold21. En stor brøkdel av plasma kolesterol sirkulerer i LDL partikler, noe som gir HuBL mus en mer menneskelig-lignende dyslipidemic lipoprotein profil i forhold til Apoe-/- og Ldlr-/- mus. HuBL mus også tillate studier av menneskelig apoB som en autoantigen22.
Musen modeller av aterosklerose utvikle komplekse aterosklerotiske plaketter med fellestrekk ved menneskelig sykdom. Men plakk er ganske motstandsdyktig mot brudd med påfølgende hjerteinfarkt. Atherothrombosis er bare sporadisk oppdaget og eksperimentelt utfordrende å vurdere23,24,25. Spesielle modeller av plakk brudd har blitt utviklet, men det eksperimentelle feltet mangler en pålitelig og reproduserbar modell for vurdering av plakk stabiliserende agenter.
Kvantifisering av aterosklerose har blitt rapportert på mange måter i litteraturen. Nylige anstrengelser har forsøkt å standardisere eksperimentell design, utførelse og rapportering av dyrestudier26. Etterforskerne har ulike preferanser og teknikker tilpasset sine laboratorier. De fleste forskningsprosjekter er også unike på en måte som de krever noen protokoll modifikasjoner. På grunn av sykdoms multifaktoriell natur, varierer optimale kontroller mellom prosjekter. Lokale forhold og mangel på standardisering kan forårsake observerte forskjeller i sykdomsutvikling, som hemmer fremskritt av forskningen feltet. Forskjeller i eksperimentell variasjon betyr også at statistiske kraft beregninger må baseres på forsøks studier under lokale forhold.
Kvantifisering av aterosklerose er anbefalt på flere steder i det vaskulære treet. Denne protokollen beskriver hvordan du får resultater fra aorta roten, aorta buen, og truncus brachiocephalicus arterien i en enkelt mus, i tillegg til å forlate resten av thoracoabdominal aorta for andre analyser. En ansikt preparater tillate rask kvantifisering av lipid-Laden plaketter i aorta buen. Sykdoms byrde i truncus brachiocephalicus arterien kan også kvantifisert hvis prøvene er nøye vist. Jo mer tidkrevende kryss-snitting av aorta roten etterlater flere seksjoner tilgjengelig for detaljert evaluering av plakk sammensetning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20066.296</td>
			<td>For fixation of sections for immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black electrical insulation tape (50 mm wide)</td>
			<td>Any specialized retailer</td>
			<td>-</td>
			<td>To create pinning beds for aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417C</td>
			<td>Benchtop microcentrifuge.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork board</td>
			<td>Any specialized retailer</td>
			<td>-</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 560</td>
			<td>For serial cryosectioning of aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For rinsing and preparation of solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DC480</td>
			<td>5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors (10 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td>For general dissection of organs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5 (11 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500341</td>
			<td>For microdissection of aorta.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% (v/v)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.290</td>
			<td>Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.8%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.310</td>
			<td>Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>9713.1000</td>
			<td>Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>-</td>
			<td>Image analysis software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris forceps (10 cm, curved, serrated)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15915-G</td>
			<td>Used as anatomical forceps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1096341011</td>
			<td>Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaiser&#39;s glycerol gelatine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1092420100</td>
			<td>Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM LB2</td>
			<td>For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>1820</td>
			<td>Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (17 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501751-G</td>
			<td>For general dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503376</td>
			<td>For pinning of aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td>Polypropylene microtubes with snaplock cap.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 3 needles, 23 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>300800</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 3 needles, 27 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>302200</td>
			<td>For perfusion of mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette 500 &#181;L, K3 EDTA</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1341.100</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette 500 &#181;L, Lithium Heparin</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1345.100</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien insect pins, 0.10 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>For pinning of aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625</td>
			<td>Not classified as a hazardous substance or mixture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) cryomount</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>45830</td>
			<td>For embedding tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td>Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100x20 mm)</td>
			<td>Any cell culture supplier</td>
			<td>-</td>
			<td>Proposed as a storage container for pinned aortas.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper (grade 1001)</td>
			<td>Munktell</td>
			<td>120006</td>
			<td>For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 &#181;m).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater RNA stabilization reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76106</td>
			<td>For stabilization of RNA in tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>A surface decontamination solution that destroys RNases on contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3 (13 cm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard scalpel blade #10</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500239</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>For dissection and en face documentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4261</td>
			<td>Not classified as a hazardous substance or mixture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>To collect aortic root sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps (15 cm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501741-G</td>
			<td>For general dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek cryomolds (10x10x5 mm)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4565</td>
			<td>For embedding aortic roots in OCT.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors (8 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503378</td>
			<td>For microdissection of aorta.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of atherosclerosis in mice

Kardiovaskulær sykdom er den viktigste dødsårsaken i verden. Den underliggende årsaken i de fleste tilfeller er aterosklerose, som er delvis en kronisk inflammatorisk sykdom. Eksperimentell aterosklerose studier har belyst rollen som kolesterol og betennelser i sykdomsprosessen. Dette har ført til vellykkede kliniske studier med farmasøytiske agenter som reduserer kliniske manifestasjoner av aterosklerose. Forsiktig og godt kontrollerte eksperimenter i musemodeller av sykdommen kunne ytterligere belyse patogenesen av sykdommen, som ikke er fullt ut forstått. Standardisert analyse av lesjon er viktig for å redusere eksperimentell variasjon og øke reproduserbarhet. Bestemme lesjon størrelse i aorta rot, aorta bue, og truncus brachiocephalicus arterien er vanlige endepunkter i eksperimentell aterosklerose. Denne protokollen gir en teknisk beskrivelse for evaluering av aterosklerose på alle disse områdene i en enkelt mus. Protokollen er spesielt nyttig når materialet er begrenset, som ofte er tilfelle når genmodifiserte dyr blir karakterisert.

I musen modeller av aterosklerose de mest prominente lesjoner har en tendens til å utvikle seg i aorta roten og aorta buen. Denne protokollen beskriver kvantifisering av aterosklerose i aorta roten, aorta buen, og truncus brachiocephalicus arterien i en enkelt mus. Målbare lesjoner i bryst nedadgående aorta og abdominal aorta er bare til stede hos dyr med forhånd sykdom. I denne protokollen, disse delene er ikke analysert for aterosklerotiske byrde, men lagret for senere analyse av mRNA nivåer eller andre analyser. Serielle deler av aterosklerotiske lesjoner i aorta roten er vanligvis vises i en graf med lesjon størrelse på y-aksen og avstand til aorta sinus på x-aksen28. Avrette krysset-avdelinger er avgjørende for leksjonen størrelse kvantifisering. Skrå seksjoner kan overvurdere lesjon størrelser og en vippe på bare 20 ° kan overvurdere den absolutte lesjon overflaten med 15%29. Hvis du beregner lesjon brøkdel av det totale fartøy arealet, blir resultatet mindre følsomt for mulige vinkel forskjeller under snitting (figur 4a). En hensiktsmessig statistisk metode for å oppdage forskjeller mellom grupper er vanligvis en vanlig 2-veis analyse av varians (ANOVA). Bonferroni etter tester blir deretter utført for å oppdage forskjeller på visse nivåer. Fisher ' s minst signifikante forskjell kan også brukes som en oppfølgings test til ANOVA. Det reduserer sannsynligheten for type II statistiske feil, men ikke konto for flere sammenligninger. I tillegg kan det være illustrerende å beregne området under kurven eller gjennomsnittlig lesjon størrelse per mus og presentere data i en prikk tomten å ytterligere visualisere individuell variasjon innenfor gruppene (figur 4b).
Olje rød O er et fettløselig rødt diazopapir fargestoff, som flekker nøytrale lipider. Polar lipider i cellemembraner er ikke flekkete. Olje rød O farging kan utføres på ferske, frosne eller formalin prøver, men ikke på parafin-embedded prøver på grunn av fjerning av lipider i den nødvendige deparaffinization prosessen. En kvantifisering av lesional lipid akkumulering kunne utføres av farge terskelverdi olje røde O positive området totalt lesjon området (figur 4c). Hematoksylin produserer en blå farging av cellekjerner, som er nyttig å visualisere plakk morfologi. Høyre og venstre koronar arterier vanligvis avvike fra aorta rundt 250 μm fra aorta sinus27, som ofte sammenfaller med de mest fremtredende lesjon størrelser. Tverrsnitt fra denne regionen vises ofte som representative resultater (figur 4d).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig4.jpg"> Figur 4: aterosklerotiske lesjoner i aorta roten. (A) tjuefire uker gamle mannlige benmarg chimeras matet vestlig kosthold for åtte uker ble evaluert for å fastslå effekten av Smad7-mangelfull T-celler på aterosklerose utvikling. Eksperimentell Ldlr-/- chimeras mottatt Cd4-grobunn+Smad7fl/fl benmarg og kontroller mottatt Cd4-grobunn+Smad7fl/+ benmarg. Grafen viser kvantifisering av aterosklerotiske lesjon området fra åtte påfølgende seksjoner, 100-800 μm fra aorta sinus vises som lesjon brøkdel av totale fartøy overflaten (Cd4-grobunn+Smad7fl/+/Ldlr-/- n = 6, Cd4-grobunn+Smad7fl/fl/Ldlr-/- n = 9, 2-veis Anova med Bonferroni ' s post test, graf viser bety ± SEM, bukseseler indikere betydning nivå for stamme sammenligning). (B) den kombinerte prikken plot og søylediagram viser gjennomsnittlig aterosklerotiske lesjon området fra aorta roten seksjoner (Cd4-grobunn+Smad7fl/+/Ldlr-/- n = 6, Cd4-grobunn+Smad7fl/fl/ Ldlr-/- n = 9, student t-test) (C) brøkdel av olje rød O-beiset området i lesjoner (Cd4-grobunn+Smad7fl/+/Ldlr-/- n = 4, Cd4-grobunn+Smad7fl/fl /Ldlr-/- n = 6, student t-test, NS = ikke-signifikante) (B-C) prikker representerer individuelle mus og barer viser bety ± SEM. (D) representative micrographs viser olje rød O farging (i rødt farge) av nøytrale lipider i aorta roten 300 μm fra aorta sinus (50x forstørrelse), Scale bar = 500 μm. *p ≤ 0,05, * * *p ≤ 0,001. Dette tallet har blitt modifisert fra Gisterå et al.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Olje Red O kan brukes til farging av en ansikt forberedt aortas, men denne protokollen bruker Sudan IV, en annen praktisk fettløselige diazopapir fargestoff. Sudan IV klart visualiserer aterosklerotiske plaketter i en oransje-rød farge ved farging lipider, triglyserider, og lipoproteiner. Fjerne den mørke bakgrunnen i representative bilder av en ansikt aorta buene kan forsterke den visuelle skjermen (figur 5a). Vanligvis er lesjon størrelse normalt fordelt i grupper, slik at statistisk testing med student t-test mellom grupper. Et prikk plott som viser både individuelle mus og gjennomsnittet, som sammenlignes mellom grupper, er en informativ måte å vise resultatene på (figur 5B-C). Siden variasjonen i grupper vanligvis er forskjellig mellom steder i det vaskulære treet, er det vanligvis behov for separate kraft beregninger. Unødvendig variasjon kan unngås ved metode ferdighet og protokoll standardisering. Innhenting av statistisk signifikante resultater er viktig, men den biologiske relevansen for en observert forskjell må alltid vurderes også.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig5.jpg"> Figur 5: aterosklerotiske lesjoner i aorta buen og truncus brachiocephalicus arterien. (A) representant no ansikt micrographs av aorta buer med lipid-Laden plaketter beiset med Sudan IV (i oransje farge) fra 20 uker gamle mus matet vestlig diett i ti uker, visualisere sammen. Skala bar = 2 mm. Human APOB100-transgene Ldlr-/- (HuBL) mus ble brukt som kontroller og den eksperimentelle gruppen besto av TCR-transgene mus med LDL-reaktive T celler (BT1) crossbred til HuBL mus. (B) aterosklerotiske lesjoner i aorta buen (HuBL n = 10, BT1xHuBL n = 12; Student t-test). (C) aterosklerotiske lesjoner i truncus brachiocephalicus arterien (HuBL n = 8, BT1xHuBL n = 9, student t-test). (B-C) Prikker representerer individuelle mus, barer viser bety ± SEM. *p ≤ 0,05. Dette tallet er blitt modifisert fra Gisterå et al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Supplerende figur 1: alternativ organisering av lysbilder for serielle deler av aorta roten. En forenklet systematisk lysbilde organisering for samling av seksjoner fra aorta roten. Kolleksjonen muliggjør olje rød O farging for lipider og immunhistokjemi eller immunofluorescence farging. Dedikerte lysbilder for Picrosirius røde flekker av kollagen er utelatt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/2019-JoVE-Figure-S1.eps">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Atherosclerosis in Mice at JoVE.com

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Murine modeller av åreforkalkning er nyttige verktøy for å undersøke patogene trasé på en molekylær nivå, men krever standardisert kvantifisering av lesjon utvikling. Denne protokollen beskriver en optimalisert metode for å bestemme lesjon størrelse i store arteriell fartøy, inkludert aorta roten, aorta buen, og truncus brachiocephalicus arterien.

Kvantifisering av åreforkalkning i mus

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Kardiovaskulær sykdom er den viktigste dødsårsaken globalt. Musemodeller er nyttige verktøy for å studere denne sykdommen, og vår protokoll kan brukes til å kvantifisere aterosklerose hos mus. Ved hjelp av denne protokollen kan lesjonsstørrelsen måles på tre vaskulære steder.Aortaroten, aortabuen og brachiocephalic arterien. Kvantifiseringen av aterosklerose hos mus kan være en kjedelig oppgave. Vi har gitt detaljerte skritt som vi håper kan fremskynde prosessen.Noen av disse trinnene er vanskelige å beskrive skriftlig. Vi håper at denne videoen vil hjelpe deg med å oppnå robust aterosklerotisk lesjonstørrelsesanalyse. Etter høsting av et musehjerte i henhold til standardprotokoller, legg hjertet på en korkseng, ventral side opp under et dissekerende mikroskop og bruk en nål for å fikse hjertet til korken gjennom topppunktet.Holder bunnen av hjertet med anatomiske tang, bruk en skalpell holdt i en 20 graders vinkel caudally i sagittalplanet, og 20 grader kranielt i tverrgående plan, for å kutte bort de apical to tredjedeler av hjertet. Bygg inn aortaroten og bunnen av hjertet i optimal skjæretemperaturforbindelse, eller OCT, og klem forsiktig hjertet med tangene for å fylle aortaroten med sammensatt og fjerne eventuelle luftbobler. Overfør prøven til bunnen av en kryomolert fylt med OCT med aortaroten vinkelrett på bunnoverflaten og frys forbindelsen på tørris.Oppbevar deretter vevsprøven i en frysepose ved minus 80 grader Celsius til kryoseksjon. For å forberede en pinning seng for en ansiktsanalyse, brett et segment av parafin voks film åtte ganger for å lage en flat 25 med 25 mm overflate og vikle svart elektrisk isolasjon tape rundt filmen for å lage en mørk bakgrunn for aorta. Plasser en etikett på baksiden av festesengen, og bruk en blyblyant til å registrere musens identifikasjonsnummer.Overfør aortabuen til festesengen og legg til en dråpe PBS til vevet. Bruk et stereomikroskop til å rense aorta fra det gjenværende periadventitialdiponielle fettvevet og bruk Vannas-saks og Dumont-tang til å forsiktig skrelle bort alt det omkringliggende fettvevet uten å manipulere eller skade aorta. Deretter introduserer Vannas saks i aorta lumen for å eksponere intimal overflate.Begynn å kutte den ytre krumningen av den stigende buen i distal retning, fortsett å kutte åpne grenene, inkludert brachiocephalic arterien og sparre den dorsale delen av den synkende thoraxregionen. For å vise den intimale overflaten, kutt åpne den mindre krumningen og brett åpne aorta. Bruk en mikro Castroviejo nålholder, fest den åpne buen til festesengen med den stumpe enden av minuten insektpinner uten å strekke prøven, forsiktig bøye pinnene bort fra prøven som vevet holdes på plass.Oppbevar deretter den festede buen med forsiden ned i en petriskål med PBS ved fire grader Celsius. For Sudan IV farging, skyll prøven i fem minutter i en petriskål på 70% etanol med buen vendt ned, før du overfører prøven til en tallerken med Sudan IV arbeidsløsning i syv minutter. På slutten av inkubasjonen, skyll prøven med to tre minutters vasker i 80% etanol for å de-flekke den normale intimaloverflaten, etterfulgt av en endelig skylling i PBS før du returnerer vevet til sin opprinnelige petriskål.Deretter skaffe mikrografer under et stereomikroskop koblet til et digitalt kamera på en 10X forstørrelse, få bilder av den festede buen nedsenket i PBS, ved hjelp av små metallvekter for å holde festesengen til bunnen av petriskålen. For å oppnå kryoseksjoner av den innebygde aortaroten, sett kryostattemperaturen til minus 20 grader Celsius og seksjonstykkelsen til 10 mikrometer. Monter OCT-blokken som inneholder aortaroten på prøveholderen med ventrikulært vev vendt utover.Sikre posisjoneringen med litt ekstra OCT om nødvendig. Aortaroten skal nå plasseres vinkelrett på knivbladet. Samle de første kontrollseksjonene som inneholder hjertemuskelvev på vanlige mikroskoplyser, og kontroller fremdriften gjennom vevet hver 200 mikrometer under et lett mikroskop.Når den første aorta cusp vises, vipp prøven mot punktet null cusp for å justere seksjonsplanet med de to andre cusps og telle hver 10 mikrometer seksjon som er kuttet fra punkt null og utover. Begynn å samle seksjoner for analyse fra 90 mikrometer og videre i henhold til lysbildet som er planlagt, til 800 mikrometer fra punkt null er nådd. Beregning av lesjonsfraksjonen av det totale karområdet til aortaroten gjør dataene mindre følsomme for mulige vinkelforskjeller under snitting.I tillegg kan det være illustrerende å beregne området under kurven eller aterotolesjonsstørrelsen per mus og presentere dataene i et punktplott for å visualisere individuelle variasjoner i grupper ytterligere. Lesional lipid akkumulering kan kvantifiseres ved fargetersklering olje rød O positive områder av det totale lesjonsområdet. Høyre og venstre koronararterier avviker vanligvis fra aorta rundt 250 mikrometer fra aorta sinus som ofte sammenfaller med de mest fremtredende lesjonsstørrelsene.Fjerne den mørke bakgrunnen i representative bilder av en ansikts aorta buer kan forbedre den visuelle skjermen. Lesjonsstørrelsen fordeles vanligvis vanligvis i grupper, slik at statistisk analyse ved hjelp av Studentens t-test mellom grupper. Vi vil anbefale å øve med noe testmateriale til du har fått tilstrekkelige ferdigheter til å behandle eksperimentelle prøver.Hvis lesjonsstørrelsen er forskjellig mellom grupper, bør du bestemme mekanismen, da en lesjonssammensetningsanalyse vanligvis er neste skritt å forfølge.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³HV68 Infection in Mice

Måling av γHV68 Infeksjon i Mus

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Nedbryting og Rekonstituering av makrofager i Mus

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Måle Lokale anafylaksi i Mus

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induksjon av murine tarmbetennelse etter adoptiv overføring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høy</sup&gt; T-celler i immundefekte mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur av makrofag-kolonistimulerende faktor Differensiert Humant Monocyte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasiv prøvetaking slimhinnene slimhinnen væske for kvantifisering av In Vivo øvre luftveier immun-megler nivåer

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakteristikk av Thymus avhengig og uavhengig av Thymus immunglobulin Isotype svar i mus med enzym knyttet Immunosorbent analysen

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Kvantifisering av antistoff avhengige forsterkning av Zika viruset i primære menneskelige celler

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Isolering og kvantifisering av Zika virus fra flere organer i en mus

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...