Name: quantification of atherosclerosis in mice
Uploaded: 2019-06-12T15:00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Atherosclerosis in Mice at JoVE.com

Мы благодарим всех прошлых членов экспериментального подразделения сердечно-сосудистых исследований Герана К Ханссона, которые помогли разработать этот протокол на протяжении последней четверти века. Мы особенно признательны за вклад Антонино Николетти, Синхуа Чжоу, Анны-Карин Робертсон и Ингер Бодин. Эта работа была поддержана грантом проекта 06816 и поддержкой Linnaeus 349-2007-8703 от Шведского научного совета, а также грантами Шведского фонда сердца-лунга, Стокгольмского окружного совета, фонда профессора Нанны Сварц, Лоо и Ханса Остермена Фонд медицинских исследований, Научно-исследовательский фонд Каролинского института и Фонд гериатрических заболеваний Каролинского института.

<ol>
	<li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010.">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).</li><li>Gistera, A., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+atherosclerosis.">The immunology of atherosclerosis.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 368-380 (2017).</li><li>Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+atherosclerosis,+and+coronary+artery+disease.">Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease.</a> New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).</li><li>Williams, K. J., Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response-to-retention+hypothesis+of+early+atherogenesis.">The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).</li><li>Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+LDL+-+trigger+of+atherosclerosis+and+inflammation+in+the+arterial+intima.">Modified LDL - trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima.</a> Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).</li><li>Ruuth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+low-density+lipoprotein+particles+to+aggregate+depends+on+particle+lipidome,+is+modifiable,+and+associates+with+future+cardiovascular+deaths.">Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths.</a> European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).</li><li>Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+VCAM-1+and+ICAM-1+at+atherosclerosis-prone+sites+on+the+endothelium+in+the+ApoE-deficient+mouse.">Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).</li><li>Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+on+macrophages+that+mediates+uptake+and+degradation+of+acetylated+low+density+lipoprotein,+producing+massive+cholesterol+deposition.">Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).</li><li>Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+susceptibility+to+atherosclerosis+among+inbred+strains+of+mice.">Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice.</a> Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).</li><li>Russell, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+history+of+mouse+inbred+strains:+contributions+of+Clarence+Cook+Little.">Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little.</a> Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).</li><li>Waterston, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+comparative+analysis+of+the+mouse+genome.">Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.</a> Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).</li><li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-driven+immunometabolic+responses+in+atherosclerosis.">Lipid-driven immunometabolic responses in atherosclerosis.</a> Current Opinion in Lipidology. 29 (5), 375-380 (2018).</li><li>Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+atherosclerosis.">Mouse models of atherosclerosis.</a> Current Protocols in Immunology. Chapter 15, (2012).</li><li>Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hypercholesterolemia+and+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice+created+by+homologous+recombination+in+ES+cells.">Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells.</a> Cell. 71 (2), 343-353 (1992).</li><li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E.">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258 (5081), 468-471 (1992).</li><li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery.">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).</li><li>Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+xanthomatosis+and+atherosclerosis+in+cholesterol-fed+low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice.">Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).</li><li>Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-based+therapies+for+atherosclerosis.">T cell-based therapies for atherosclerosis.</a> Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).</li><li>Skalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subendothelial+retention+of+atherogenic+lipoproteins+in+early+atherosclerosis.">Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis.</a> Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).</li><li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+low+density+lipoprotein+receptor-binding+site+in+apolipoprotein+B100+and+the+modulation+of+its+binding+activity+by+the+carboxyl+terminus+in+familial+defective+apo-B100.">Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100.</a> Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).</li><li>Sanan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice+expressing+human+apolipoprotein+B-100+develop+complex+atherosclerotic+lesions+on+a+chow+diet:+no+accentuation+by+apolipoprotein(a).">Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).</li><li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+against+T-cell+epitopes+of+native+ApoB100+reduces+vascular+inflammation+and+disease+in+a+humanized+mouse+model+of+atherosclerosis.">Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis.</a> Journal of Internal Medicine. , (2017).</li><li>Johnson, J. L., Jackson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerotic+plaque+rupture+in+the+apolipoprotein+E+knockout+mouse.">Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse.</a> Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).</li><li>Calara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+plaque+rupture+and+secondary+thrombosis+in+apolipoprotein+E-deficient+and+LDL+receptor-deficient+mice.">Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice.</a> The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).</li><li>Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+infarction+mediated+by+endothelin+receptor+signaling+in+hypercholesterolemic+mice.">Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).</li><li>Daugherty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendation+on+Design,+Execution,+and+Reporting+of+Animal+Atherosclerosis+Studies:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), (2017).</li><li>Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+atherosclerotic+lesions+in+mice.">Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice.</a> Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).</li><li>Purcell-Huynh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+high+levels+of+human+apolipoprotein+B+develop+severe+atherosclerotic+lesions+in+response+to+a+high-fat+diet.">Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet.</a> Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).</li><li>Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+treatment+reduces+atherosclerosis+in+apo+E+knockout+mice.">Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).</li><li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+of+Lymphocytes+in+Mouse+Atherosclerotic+Plaque.">Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).</li><li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta+signaling+in+T+cells+promotes+stabilization+of+atherosclerotic+plaques+through+an+interleukin-17-dependent+pathway.">Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway.</a> Science Translational Medicine. 5 (196), (2013).</li><li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Density+Lipoprotein-Reactive+T+Cells+Regulate+Plasma+Cholesterol+Levels+and+Development+of+Atherosclerosis+in+Humanized+Hypercholesterolemic+Mice.">Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice.</a> Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).</li><li>Daugherty, A., Whitman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+atherosclerosis+in+mice.">Quantification of atherosclerosis in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 209, 293-309 (2003).</li><li>Baglione, J., Smith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assay+for+mouse+atherosclerosis+in+the+aortic+root.">Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root.</a> Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).</li><li>Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gamma-irradiation+and+bone+marrow+transplantation+on+atherosclerosis+in+LDL+receptor-deficient+mice.">Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).</li><li>Naghavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+vulnerable+plaque+to+vulnerable+patient:+a+call+for+new+definitions+and+risk+assessment+strategies:+Part+I.">From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I.</a> Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).</li><li>Seijkens, T. T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CD40-Induced+TRAF6+Signaling+in+Macrophages+Reduces+Atherosclerosis.">Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Сердечно-сосудистые заболевания является основной причиной смерти в мире и новые профилактические измерения необходимы2. Мышиные модели заболевания обеспечивают комплексную платформу для исследования патофизиологии и экспериментального лечения13. Для такого подхода необходима количества надежного поражения. Однако методы количественной оценки различаются между лабораториями. Стандартизация и оптимизация были непрерывным процессом с 1980-х годов13,27,33,34. Корни аорты стали самым популярным местом количественной оценки экспериментального атеросклероза. Поперечные сечения бляшек позволяют сравнивать объем бляшек между группами. En лицо препараты благоприятствования для поражения количественной оценки в больших сегментах аорты. Метод en face визуализирует количество налета и позволяет количественно определить покрытие площади бляшки, но не учитывает толщину бляшек. Биологическая значимость наблюдаемых различий подтверждается согласованными результатами в разных местах сосудистого дерева. Оценка развития атеросклероза в разных местах направлена на устранение возможных специфических эффектов. Влияние пересаженных гематопоитических клеток на развитие атеросклероза можно оценить в гиперхолестеринемом Лдлере-/- химерах. Тем не менее, облучение всего тела влияет на процесс атеросклероза с конкретными эффектами сайта. Более заметные атеросклеротические поражения развиваются в корнях аорты, в то время как снижение развития поражения наблюдается в аортических арках35.
Важно отметить, что необходимо учитывать не только размер поражения при изучении экспериментального атеросклероза. Композиция из лежа также является ключевым параметром. Несколько особенностей бляшки были связаны с проявлениями заболевания у людей36. Серийное сечение корня аорты оставляет несколько участков, доступных для тщательного анализа состава бляшек. Разрыв бляшек у человека характеризуется тонкой волокнистой крышкой с несколькими гладкими мышечными клетками, редким содержанием коллагена и признаками воспаления в бляшках36. Хотя разрыв налета является редким событием в мышиных моделях атеросклероза, маркеры стабильности бляшки являются информативными для оценки. Переводные подходы могут подтвердить механистические выводы из моделей мыши и выявить важные особенности болезни человека31. Воспалительный статус атеросклеротических бляшек можно определить путем иммуногистохимии окрашивания VCAM-1, MHC класса II, макрофагов и лимфоцитов30. Некоторые протоколы используют продольные секции в корональной плоскости аортальной арки или брахиоцефалической артерии для измерения размера атеросклеротического поражения и состава37. Однако этот альтернативный метод оставляет лишь несколько разделов для анализа, что ограничивает его применение.
Первоначальным важным шагом в этом протоколе является способность эффективно собирать аорты. Координация рук и глаз под микроскопом требует практики и имеет решающее значение как для микрорассечения, так и для последующего закрепления аорты арки. Следующим важным шагом в этом протоколе является сбор серийных разделов из корня аорты. Восемьдесят последовательных разделов должны быть собраны для каждой мыши, которая требует как фокус и терпение. Методологическая квалификация может значительно ускорить описанные процессы. Тем не менее, атеросклеротическая оценка поражения по-прежнему занимает много времени. Новая технология, автоматизированная обработка и визуализация мелких животных могут способствовать количественной оценке экспериментального атеросклероза в будущем. Прогрессирование атеросклероза медленно и большинство экспериментальных протоколов в моделях мыши занять более четырех месяцев, чтобы завершить13. Поэтому аорты должны быть собраны оптимизированным способом в конечных точках исследования. Этот протокол обеспечивает всеобъемлющее руководство для сбора аорты эффективно и предлагаемой обработки готовит аорты для многоцелевого использования, включая поражения количественного поражения в корень аорты, аортальной арки, и брахиоцефалической артерии. Надеемся, что протокол может уменьшить экспериментальную изменчивость, повысить надежность результатов, и привести к выводам, которые проложат путь для новых методов лечения атеросклероза.

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти в мире с ишемической болезни сердца и инсульта приходится один из каждых четырех смертей1. Большинство случаев вызваны атеросклерозом, заболеванием, характеризующимся медленным накоплением липидных бляшек с признакамихронического воспаления в крупных и средних артериях 2. Болезнь обычно остается незамеченной в течение нескольких десятилетий, пока разрыв или эрозия бляшки вызывает артериальный тромбоз, который приводит к повреждению ишемической ткани.
Нормальная артерия состоит из интимального слоя с эндотелиальными клетками и редко распределенных гладких мышечных клеток, медиаслой с гладкими мышечнымиклетками и эластичным ламеллами, а также окружающего авантюрного слоя с рыхлой соединительной тканью 3. Интимное удержание ЛПНП компенсирует развитие атеросклероза4. Накопление и модификация липопротеинов приводят к агрегациии захвату в артериальной интиме 5. Воспалительная реакция вызывается захваченных и модифицированных липопротеинов6. Эндотелиальные клетки начинают выражать молекулы адгезии, такие как VCAM-1 на участках артериального дерева с турбулентным кровотоком, что приводит к набору циркулирующих моноцитов и других лейкоцитов7. Проникающие моноциты дифференцируются в макрофаги, которые поглощают липид с последующей трансформацией в клетки пены макрофагов8.
Атеросклероз изучался в моделях мышей с возрастающей частотой с середины 1980-х годов. C57BL/6 является наиболее часто используемым штаммом инбредных мышей для этих исследований, и он используется в качестве генетического фона для большинства генетически модифицированных штаммов9. Этот штамм был создан в 1920-х годов10, и его геном был опубликован в 2002году 11. Эксперименты в моделях мышей имеют несколько преимуществ: колонии размножаются быстро, корпус является пространственно-эффективным, а инбридинг снижает экспериментальную изменчивость. Модель также допускает генетические манипуляции, такие как целевые удаления генов и вставка трансгенов. Это привело к новому патофизиологическому пониманию болезни и новой терапии целей12.
Мышей дикого типа C57BL/6 естественно устойчивы к атеросклерозу. Они имеют большую часть циркулирующего холестерина в ЛПВП, и сложные атеросклеротические поражения не образуются даже при кормлении с высоким содержанием жира и высоким содержанием холестерина диеты13. Гиперхолестеринемические мыши, такие как Apoe-/- на c57BL/6-фон, поэтому используются в качестве экспериментальных моделей атеросклероза14,15. Отсутствие ApoE ухудшает печенок поглощения остатков липопротеинов и серьезно возмущает метаболизм липидов. В Apoe-/- мышей, циркулирующих холестерина в основном в частицах VLDL, и мышей развивать сложные атеросклеротические бляшки на регулярной диете чау.
Ldlr-/- мыши имитируют развитие атеросклероза видели у людей с семейной гиперхолестеринемии16. Ldlr-/- мышам нужна западная диета типа для развития атеросклероза17. Западная диета имитирует потребление пищи человеком и обычно содержит 0,15% холестерина. Рецептор ЛПНП распознает ApoB100 и ApoE и опосредует поглощение частиц ЛПНП через эндоцитоз. LdL рецепторы имеют основополагающее значение для печени очистки ЛПНП от кровообращения, в то время как выражение рецепторов ЛПНП в гематоподетические клетки не влияет на этот процесс. Это открывает возможность для трансплантации костного мозга клеток Лдлра в гиперхолестеринемический Ldlr-/- реципиенты и оценки развития атеросклероза. Химеры костного мозга обычно используются для изучения участия гематопоитических клеток в экспериментальном атеросклерозе. Однако трансплантация костного мозга может повлиять на размер и состав атеросклеротических бляшек, что делает интерпретацию результатов неоднозначной.
Различные варианты Apoe-/- и Ldlr-/- мышей с дополнительными генетическими изменениями были разработаны для изучения специфических процессов заболевания18. Одним из примеров является человек APOB100-трансгенных Ldlr-/- (HuBL) мышей, которые несут в полнометражный человеческий ген APOB100 19,20. Эти мыши развивают гиперхолестеринемию и атеросклероз на регулярной диете чау. Однако разработка сложных атеросклеротических бляшек занимает не менее шести месяцев, а в более коротких экспериментальных протоколах обычно используется западная диета21. Большая часть холестерина плазмы циркулирует в частицах ЛПНП, что дает huBL мышей более человека, как дислипидемический профиль липопротеинов по сравнению с Apoe-/- и Ldlr-/- мышей. HuBL мышей также позволяют исследования человека апоБ как аутоантиген22.
Мышиные модели атеросклероза развивают сложные атеросклеротические бляшки с общими особенностями болезни человека. Тем не менее, бляшки довольно устойчивы к разрыву с последующим инфарктом миокарда. Атеротромбоз только время от времени обнаружены и экспериментально сложной для оценки23,24,25. Разработаны специальные модели разрыва бляшек, но в экспериментальном поле отсутствует надежная и воспроизводимая модель для оценки стабилизирующих средств налета.
Количественная оценка атеросклероза была зарегистрирована во многих отношениях в литературе. Недавние усилия пытались стандартизировать экспериментальный дизайн, выполнение и отчетность исследований на животных26. Следователи имеют различные предпочтения и методы, адаптированные к их лабораториям. Большинство исследовательских проектов также уникальны таким образом, что они требуют некоторых изменений протокола. Из-за многофакторного характера заболевания оптимальный контроль варьируется в зависимости от проекта. Местные условия и отсутствие стандартизации могут вызывать наблюдаемые различия в развитии болезней, что препятствует развитию научно-исследовательской области. Различия в экспериментальной изменчивости также означают, что расчеты статистической мощности должны основываться на экспериментальных исследованиях в местных условиях.
Количественная оценка атеросклероза рекомендуется в нескольких местах в сосудистом дереве. Этот протокол описывает, как получить результаты от корня аорты, аортальной арки, и брахиоцефалической артерии в одной мыши, в дополнение к оставляя остальную часть торакоабдоминальной аорты для других анализов. En лица препараты позволяют быстрой количественной оценки липидных нагруженные бляшки в аорты арки. Бремя болезни в брахиоцефалической артерии также может быть количественно, если образцы тщательно отображаются. Чем больше времени занимает поперечное сечение корня аорты оставляет несколько разделов, доступных для детальной оценки состава бляшек.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20066.296</td>
			<td>For fixation of sections for immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black electrical insulation tape (50 mm wide)</td>
			<td>Any specialized retailer</td>
			<td>-</td>
			<td>To create pinning beds for aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417C</td>
			<td>Benchtop microcentrifuge.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork board</td>
			<td>Any specialized retailer</td>
			<td>-</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 560</td>
			<td>For serial cryosectioning of aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For rinsing and preparation of solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DC480</td>
			<td>5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors (10 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td>For general dissection of organs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5 (11 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500341</td>
			<td>For microdissection of aorta.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% (v/v)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.290</td>
			<td>Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.8%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.310</td>
			<td>Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>9713.1000</td>
			<td>Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>-</td>
			<td>Image analysis software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris forceps (10 cm, curved, serrated)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15915-G</td>
			<td>Used as anatomical forceps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1096341011</td>
			<td>Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaiser&#39;s glycerol gelatine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1092420100</td>
			<td>Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM LB2</td>
			<td>For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>1820</td>
			<td>Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (17 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501751-G</td>
			<td>For general dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503376</td>
			<td>For pinning of aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td>Polypropylene microtubes with snaplock cap.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 3 needles, 23 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>300800</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 3 needles, 27 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>302200</td>
			<td>For perfusion of mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette 500 &#181;L, K3 EDTA</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1341.100</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette 500 &#181;L, Lithium Heparin</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1345.100</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien insect pins, 0.10 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>For pinning of aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625</td>
			<td>Not classified as a hazardous substance or mixture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) cryomount</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>45830</td>
			<td>For embedding tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td>Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100x20 mm)</td>
			<td>Any cell culture supplier</td>
			<td>-</td>
			<td>Proposed as a storage container for pinned aortas.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper (grade 1001)</td>
			<td>Munktell</td>
			<td>120006</td>
			<td>For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 &#181;m).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater RNA stabilization reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76106</td>
			<td>For stabilization of RNA in tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>A surface decontamination solution that destroys RNases on contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3 (13 cm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard scalpel blade #10</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500239</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>For dissection and en face documentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4261</td>
			<td>Not classified as a hazardous substance or mixture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>To collect aortic root sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps (15 cm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501741-G</td>
			<td>For general dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek cryomolds (10x10x5 mm)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4565</td>
			<td>For embedding aortic roots in OCT.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors (8 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503378</td>
			<td>For microdissection of aorta.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of atherosclerosis in mice

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти в мире. Основной причиной в большинстве случаев является атеросклероз, который частично является хроническим воспалительным заболеванием. Экспериментальные исследования атеросклероза прояснили роль холестерина и воспаления в процессе заболевания. Это привело к успешным клиническим испытаниям с фармацевтическими агентами, которые уменьшают клинические проявления атеросклероза. Тщательные и хорошо контролируемые эксперименты в мышиных моделях болезни могут еще больше прояснить патогенез болезни, который не до конца понятен. Стандартизированный анализ поражения имеет важное значение для снижения экспериментальной изменчивости и повышения воспроизводимости. Определение размера поражения корня аорты, аортальной арки и брахиоцефалической артерии являются общими конечными точками в экспериментальном атеросклерозе. Этот протокол предоставляет техническое описание для оценки атеросклероза на всех этих участках в одной мыши. Протокол особенно полезен, когда материал ограничен, как это часто бывает при характеристике генетически модифицированных животных.

В моделях мыши атеросклероза наиболее заметные поражения, как правило, развиваются в корнях аорты и аорты арки. Этот протокол описывает количественную оценку атеросклероза в корнях аорты, аортальной арке и брахиоцефалической артерии в одной мыши. Измеримые поражения в грудной нисходящей аорты и брюшной аорты присутствуют только у животных с заранее болезни. В этом протоколе эти части не анализируются на атеросклеротические нагрузки, а сохраняются для последующего анализа уровней мРНК или других анализов. Серийные участки атеросклеротических поражений в корнях аорты обычно отображаются на графике с размером поражения на y-оси и расстоянием до синуса аорты на x-оси28. Истинные поперечные сечения имеют решающее значение для количественной оценки размера поражения. Косые секции могут переоценить размеры поражений и наклона только 20 "может переоценить абсолютную поверхность поражения на 15%29. Тем не менее, расчет доли поражения общей площади судна делает результат менее чувствительным к возможным различиям угла во время секции(рисунок 4A). Соответствующий статистический метод для выявления различий между группами, как правило, регулярный 2-путь анализа дисперсии (ANOVA). Затем послетесты Bonferroni проводятся для выявления различий на определенных уровнях. Наименее существенная разница Фишера может также использоваться в качестве последующего теста для ANOVA. Это снижает вероятность статистических ошибок типа II, но не учитывает несколько сравнений. Кроме того, это может быть иллюстративным для расчета площади под кривой или средний размер поражения на мышь и представить данные в точка участка для дальнейшей визуализации отдельных изменений в группах (Рисунок 4B).
Масло Red O - жирорастворимый ярко-красный диазокрас, который окрашивает нейтральные липиды. Полярные липиды в клеточных мембранах не окрашены. Масло Red O окрашивание может быть выполнено на свежих, замороженных или формалина фиксированной образцов, но не на парафина встроенных образцов из-за удаления липидов в процессе требуемой депарафинизации. Количественная оценка накопления поражений липидов может быть выполнена путем цветового порога положительной области oil Red O общей области поражения(рисунок 4C). Гематоксилин производит голубое окрашивание ядер клеток, что полезно визуализировать морфологию бляшек. Правые и левые коронарные артерии обычно расходятся с аортой около 250 мкм от аортальной синуса27, которые часто совпадают с наиболее заметными размерами поражения. Поперечные сечения из этого региона часто отображаются в качестве репрезентативных результатов(рисунок 4D).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig4.jpg"> Рисунок 4: Атеросклеротические поражения в корнях аорты. (A) Двадцать восемь недель мужчины химер костного мозга кормили западной диеты в течение восьми недель были оценены, чтобы определить влияние Smad7-дефицитНыхТ-клеток на развитие атеросклероза. Экспериментальные Ldlr-/- химеры получили Cd4-Cre ssmad7fl/fl костного мозга и контроля получил Cd4-Cre smad7fl / " костный мозг. На графике показана количественная оценка области атеросклеротического поражения из восьми последовательных секций, 100 - 800 мкм от аортального синуса, отображаемого как часть поражения общей поверхности судна (Cd4-CreиSmad7fl/'/Ldlr-/- n'6, Cd4-CreиSmad7 fl/fl/Ldlr-/- n No 9, 2-путь ANOVA с послетестом Bonferroni, график показывает среднее ЗНАЧЕНИЕ SEM, скобки указывают уровень значимости для сравнения напряжения). (B) Комбинированный точка сюжета и бар график показывает среднее атеросклеротическое поражения области из аорты корневых разделов (Cd4-Cre smad7fl //Ldlr-/- n'6, Cd4-Cre sSmad7fl/fl/ Ldlr-/- n no 9, Студенческий т-тест) (C) Фракция нефти Красный O-окрашенные области в поражениях (Cd4-Cressmad7fl /Ldlr-/- n No 4, Cd4-CresSmad7fl/fl /Ldlr-/- n No 6, Студенческий т-тест, нс-не-значительный) (B-C) Точки представляют отдельные мыши и бары показывают среднее значение ЗСЭМ. (D) Представитель микрографов, показывающих масло Red O окрашивания (в красном цвет) нейтральных липидов в корень аорты 300 мкм от синуса аорты (50x увеличение), Шкала бар 500 мкм. Эта цифра была изменена от Гистере и др.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Масло Red O может быть использован для окрашивания ан лицо подготовлены аорты, но этот протокол использует Судан IV, другой удобный жирорастворимый диазо краситель. Судан IV четко визуализирует атеросклеротические бляшки оранжево-красного цвета путем окрашивания липидов, триглицеридов и липопротеинов. Удаление темного фона в репрезентативных изображениях аортических арок en face может повысить визуальный дисплей(рисунок 5A). Обычно размер поражения обычно распределяется по группам, что позволяет проводить статистическое тестирование с помощью t-test студента между группами. Точка сюжет, который показывает, как отдельных мышей и среднее, которое сравнивается между группами, является информативным способом для отображения результатов(рисунок 5B-C). Поскольку вариации в группах, как правило, различны между местами в сосудистом дереве, обычно необходимы отдельные расчеты мощности. Ненужных изменений можно избежать путем повышения квалификации метода и стандартизации протокола. Получение статистически значимых результатов имеет важное значение, но биологическая значимость наблюдаемой разницы всегда должна быть рассмотрена также.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig5.jpg"> Рисунок 5: Атеросклеротические поражения в аортальной арке и брахиоцефалической артерии. (A) Представитель ан лицо микрографов аорты арки с липидными нагруженные бляшки окрашенных Судан IV (в оранжевом цвете) от 20 недель мышей кормили западной диеты в течение десяти недель, визуализированные вместе. Шкала бар 2 мм. Человек APOB100-трансгенных Ldlr-/- (HuBL) мышей были использованы в качестве контроля и экспериментальной группы состояла из TCR-трансгенных мышей с ЛПНП-реактивных Т-клеток (BT1) перекресток к huBL мышей. (B) Атеросклеротические поражения в аортированной арке (HuBL n 10, BT1xHuBL n 12; Студенческий t-тест). (C) Атеросклеротические поражения в брахиоцефалической артерии (HuBL N No 8, BT1xHuBL n No 9, Студент т-тест). (B-C) Точки представляют отдельных мышей, бары показывают среднее (SEM. Эта цифра была изменена от Гистере и др.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Дополнительная рисунок 1: Альтернативная организация слайдов для серийных секций корня аорты. Упрощенная систематическая организация слайдов для сбора секций из корня аорты. Коллекция позволяет масло Красный O окрашивания для липидов и иммуногистохимии или иммунофлуоресцентного окрашивания. Выделенные слайды для Picrosirius красный окрашивание коллагена опущены. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/2019-JoVE-Figure-S1.eps">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Atherosclerosis in Mice at JoVE.com

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Моринмодели атеросклероза являются полезными инструментами для исследования патогенных путей на молекулярном уровне, но требуют стандартизированной количественной оценки развития поражения. Этот протокол описывает оптимизированный метод для определения размера поражения в основных артериальных сосудов, включая корень аорты, аортальной арки, и брахиоцефалической артерии.

Количественная оценка атеросклероза у мышей

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти во всем мире. Мыши модели являются полезными инструментами для изучения этого заболевания и наш протокол может быть использован для количественной оценки атеросклероза у мышей. Используя этот протокол, размер поражения может быть измерен в трех сосудистых местах.Корень аорты, арку аорты и брахиоцефалическую артерию. Количественная оценка атеросклероза у мышей может быть утомительной задачей. Мы представили подробные шаги, которые, как мы надеемся, могут ускорить этот процесс.Некоторые из этих шагов трудно описать в письменной форме. Мы надеемся, что это видео поможет вам в получении надежного анализа размера атеросклеротических поражений. После сбора сердца мыши в соответствии со стандартными протоколами, поместите сердце на пробковую кровать, брюшной стороне под рассечение микроскопа и использовать иглу, чтобы исправить сердце пробки через вершину.Удерживая основание сердца анатомическими типсами, используйте скальпель, удерживаемый под углом 20 градусов в сагиттаальной плоскости, и 20 градусов черепно-мозговой в поперечной плоскости, чтобы отрезать апикал две трети сердца. Вставлять корень аорты и основание сердца в оптимальное соединение температуры резки, или OCT, и осторожно сжать сердце с типсами, чтобы заполнить корень аорты с соединением и удалить любые пузырьки воздуха. Перенесите образец на дно криомольда, наполненного OCT с корнем аорты перпендикулярно нижней поверхности и заморозить соединение на сухом льду.Затем храните образец ткани в морозильной камере при температуре минус 80 градусов по Цельсию до криозирования. Чтобы подготовить закрепление кровати для анализа лица, сложите сегмент парафиновой восковой пленки восемь раз, чтобы сделать плоскую поверхность 25 на 25 мм и оберните черную электрическую изоляционные ленты вокруг пленки, чтобы сделать темный фон для аорты. Поместите этикетку на задней стороне зажатой кровати и используйте карандаш для записи идентификационного номера мыши.Перенесите арку аорты на закрепление кровати и добавьте каплю PBS в ткань. Используя стерео микроскоп, очистить аорту от оставшихся периаддентиальной жировой ткани и использовать Ножницы Vannas и Dumont типсы, чтобы аккуратно очистить все окружающие жировой ткани без манипулирования или повреждения аорты. Затем ввеми ножницы Vannas в аортальный люмен, чтобы разоблачить интимную поверхность.Начните резать внешнюю кривизну восходящей арки в дистальной направлении, продолжая разрезать ветви, в том числе брахиоцефалической артерии и щадя спинной части нисходящей грудной области. Чтобы отобразить интимную поверхность, разрежьте меньшую кривизну и сложите аорту. Используя микро Castroviejo держатель иглы, обеспечить открытую арку к зажатой кровати с тупым концом minuten насекомых булавки без растяжения образца, мягко изгиб булавки от образца, как ткань проводится на месте.Затем храните закрепленную арку лицом вниз в чашке Петри PBS при четырех градусах по Цельсию. Для Судана IV окрашивания, промыть образец в течение пяти минут в чашке Петри 70%этанола с аркой лицом вниз, прежде чем передать образец блюдо Судана IV рабочий раствор в течение семи минут. В конце инкубации, промыть образец с двумя трехминутными моет в 80%этанола, чтобы де-пятно нормальной интимальной поверхности, а затем окончательное полоскание в PBS, прежде чем вернуть ткань в исходное блюдо Петри.Затем приобрети микрографы под стерео микроскопом, подключенным к цифровой камере при увеличении 10X, получая изображения закрепленной арки, погруженной в PBS, используя небольшие металлические веса, чтобы держать закрепление кровати на дне чашки Петри. Чтобы получить криозекции встроенного корня аорты, установите температуру криостата до минус 20 градусов по Цельсию, а толщину сечения до 10 микрометров. Намонтировать блок OCT, содержащий корень аорты на держателе образца с желудочковой тканью, обращенной наружу.При необходимости закрекрете позиционирование дополнительными OCT. Корень аорты теперь должен быть расположен перпендикулярно лезвию ножа. Соберите начальные контрольные секции, содержащие сердечную мышечную ткань на обычных слайдах микроскопа, проверяя прогрессию через ткани каждые 200 микрометров под легким микроскопом.Когда появится первый аортический cusp, наклоните образец к точке нулевой cusp, чтобы выровнять плоскость раздела с двумя другими cusps и рассчитывать каждые 10 микрометровый раздел, который вырезан из точки нуля года. Начните собирать секции для анализа с 90 микрометров и далее в соответствии с запланированной горкой, пока не будет достигнуто 800 микрометров от нулевой точки. Расчет доли поражения общей площади сосуда корня аорты делает данные менее чувствительными к возможным различиям в углах при разделе.Кроме того, это может быть иллюстративным для расчета области под кривой или размер поражения атерото на мышь и представить данные в точку участка для дальнейшей визуализации отдельных вариаций в группах. Поражение липидного накопления может быть количественно по цвету пороговых нефти красный O положительные области общей области поражения. Правые и левые коронарные артерии обычно расходятся с аортой около 250 микрометров от аортальной пазухи, которая часто совпадает с наиболее заметными размерами поражения.Удаление темного фона в репрезентативных изображениях аортических арок en face может улучшить визуальный дисплей. Размер поражения, как правило, обычно распределяется между группами, что позволяет статистический анализ с использованием студента t-тест между группами. Мы рекомендуем практиковать с некоторыми тестовым материалом, пока вы не получили достаточные навыки для обработки экспериментальных образцов.Если размер поражения отличается между группами, вы должны определить механизм, как анализ состава поражения, как правило, следующий шаг, чтобы продолжить.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³HV68 Infection in Mice

Измерение γHV68 инфекции у мышей

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Истощение и разведения макрофагов у мышей

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Измерение Местные Анафилаксия у мышей

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Индукционная мышиных воспаление кишечника с помощью приемных передачи эффекторных CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Высокая</sup&gt; Т-клеток в иммунодефицитных мышей

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Культура макрофагальный колониестимулирующий фактор Дифференцированный человеческого моноцитов макрофаги

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Неинвазивный выборки слизистую жидкость для количественной оценки в Vivo иммунной посредника уровня верхних дыхательных путей

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Характеристика тимус зависимых и тимус независимые иммуноглобулина изотипа ответов в мышей, используя энзим соединенный Assay иммуносорбента

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Количественное определение антител зависимых повышение Зика вируса в первичных клеток человека

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Изоляция и количественная оценка вируса Зика из нескольких органов в мыши

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

Количественное определение трех поражений ДНК с помощью масс-спектрометрии и оценки их уровней в тканях мышей, подвергшихся воздействию мелких твердых частиц