Name: quantification of atherosclerosis in mice
Uploaded: 2019-06-12T15:00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Atherosclerosis in Mice at JoVE.com

Vi tackar alla tidigare medlemmar i Göran K Hanssons experimentella kardiovaskulära forskningsenhet som hjälpte till att utveckla detta protokoll under det senaste kvarts århundradet. Vi är särskilt tacksamma för bidragen från Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson och Inger Bodin. Detta arbete stöddes av projekt Grant 06816 och Linnéstöd 349-2007-8703 från Vetenskapsrådet, samt av bidrag från hjärt-Lungstiftelsen, Stockholms läns landsting, professor Nanna Svartz stiftelse, Loo och hans Osterman Stiftelsen för medicinsk forskning, Karolinska Institutets forskningsstiftelse och Stiftelsen för geriatriska sjukdomar vid Karolinska Institutet.

<ol>
	<li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010.">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).</li><li>Gistera, A., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+atherosclerosis.">The immunology of atherosclerosis.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 368-380 (2017).</li><li>Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+atherosclerosis,+and+coronary+artery+disease.">Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease.</a> New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).</li><li>Williams, K. J., Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response-to-retention+hypothesis+of+early+atherogenesis.">The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).</li><li>Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+LDL+-+trigger+of+atherosclerosis+and+inflammation+in+the+arterial+intima.">Modified LDL - trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima.</a> Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).</li><li>Ruuth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+low-density+lipoprotein+particles+to+aggregate+depends+on+particle+lipidome,+is+modifiable,+and+associates+with+future+cardiovascular+deaths.">Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths.</a> European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).</li><li>Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+VCAM-1+and+ICAM-1+at+atherosclerosis-prone+sites+on+the+endothelium+in+the+ApoE-deficient+mouse.">Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).</li><li>Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+on+macrophages+that+mediates+uptake+and+degradation+of+acetylated+low+density+lipoprotein,+producing+massive+cholesterol+deposition.">Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).</li><li>Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+susceptibility+to+atherosclerosis+among+inbred+strains+of+mice.">Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice.</a> Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).</li><li>Russell, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+history+of+mouse+inbred+strains:+contributions+of+Clarence+Cook+Little.">Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little.</a> Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).</li><li>Waterston, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+comparative+analysis+of+the+mouse+genome.">Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.</a> Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).</li><li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-driven+immunometabolic+responses+in+atherosclerosis.">Lipid-driven immunometabolic responses in atherosclerosis.</a> Current Opinion in Lipidology. 29 (5), 375-380 (2018).</li><li>Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+atherosclerosis.">Mouse models of atherosclerosis.</a> Current Protocols in Immunology. Chapter 15, (2012).</li><li>Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hypercholesterolemia+and+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice+created+by+homologous+recombination+in+ES+cells.">Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells.</a> Cell. 71 (2), 343-353 (1992).</li><li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E.">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258 (5081), 468-471 (1992).</li><li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery.">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).</li><li>Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+xanthomatosis+and+atherosclerosis+in+cholesterol-fed+low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice.">Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).</li><li>Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-based+therapies+for+atherosclerosis.">T cell-based therapies for atherosclerosis.</a> Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).</li><li>Skalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subendothelial+retention+of+atherogenic+lipoproteins+in+early+atherosclerosis.">Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis.</a> Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).</li><li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+low+density+lipoprotein+receptor-binding+site+in+apolipoprotein+B100+and+the+modulation+of+its+binding+activity+by+the+carboxyl+terminus+in+familial+defective+apo-B100.">Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100.</a> Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).</li><li>Sanan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice+expressing+human+apolipoprotein+B-100+develop+complex+atherosclerotic+lesions+on+a+chow+diet:+no+accentuation+by+apolipoprotein(a).">Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).</li><li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+against+T-cell+epitopes+of+native+ApoB100+reduces+vascular+inflammation+and+disease+in+a+humanized+mouse+model+of+atherosclerosis.">Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis.</a> Journal of Internal Medicine. , (2017).</li><li>Johnson, J. L., Jackson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerotic+plaque+rupture+in+the+apolipoprotein+E+knockout+mouse.">Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse.</a> Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).</li><li>Calara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+plaque+rupture+and+secondary+thrombosis+in+apolipoprotein+E-deficient+and+LDL+receptor-deficient+mice.">Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice.</a> The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).</li><li>Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+infarction+mediated+by+endothelin+receptor+signaling+in+hypercholesterolemic+mice.">Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).</li><li>Daugherty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendation+on+Design,+Execution,+and+Reporting+of+Animal+Atherosclerosis+Studies:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), (2017).</li><li>Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+atherosclerotic+lesions+in+mice.">Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice.</a> Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).</li><li>Purcell-Huynh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+high+levels+of+human+apolipoprotein+B+develop+severe+atherosclerotic+lesions+in+response+to+a+high-fat+diet.">Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet.</a> Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).</li><li>Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+treatment+reduces+atherosclerosis+in+apo+E+knockout+mice.">Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).</li><li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+of+Lymphocytes+in+Mouse+Atherosclerotic+Plaque.">Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).</li><li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta+signaling+in+T+cells+promotes+stabilization+of+atherosclerotic+plaques+through+an+interleukin-17-dependent+pathway.">Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway.</a> Science Translational Medicine. 5 (196), (2013).</li><li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Density+Lipoprotein-Reactive+T+Cells+Regulate+Plasma+Cholesterol+Levels+and+Development+of+Atherosclerosis+in+Humanized+Hypercholesterolemic+Mice.">Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice.</a> Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).</li><li>Daugherty, A., Whitman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+atherosclerosis+in+mice.">Quantification of atherosclerosis in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 209, 293-309 (2003).</li><li>Baglione, J., Smith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assay+for+mouse+atherosclerosis+in+the+aortic+root.">Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root.</a> Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).</li><li>Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gamma-irradiation+and+bone+marrow+transplantation+on+atherosclerosis+in+LDL+receptor-deficient+mice.">Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).</li><li>Naghavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+vulnerable+plaque+to+vulnerable+patient:+a+call+for+new+definitions+and+risk+assessment+strategies:+Part+I.">From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I.</a> Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).</li><li>Seijkens, T. T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CD40-Induced+TRAF6+Signaling+in+Macrophages+Reduces+Atherosclerosis.">Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Hjärt-kärlsjukdom är den främsta mördaren i världen och nya förebyggande mätningar behövs2. Musmodeller av sjukdomen ger en omfattande plattform för utredning av patofysiologi och experimentella behandlingar13. Kvantifiering av tillförlitlig lesionsstorlek är avgörande för denna metod. Kvantifieringsmetoderna skiljer sig dock åt mellan laboratorierna. Standardisering och optimering har varit en pågående process sedan 1980-talet13,27,33,34. Aorta rötter har dykt upp som den mest populära platsen för att kvantifiera experimentell åderförkalkning. Tvärsnitt av plack möjliggör jämförelse av plack volym mellan grupper. En Face preparat gynnas för lesion kvantifiering i större segment av aorta. En Face-metoden visualiserar plack kvantitet och möjliggör kvantifiering av plack område täckning, men inte ta plack tjocklek i konto. Den biologiska relevansen för observerade skillnader motiveras av sammanhängande resultat på olika platser i det vaskulära trädet. Utvärdera åderförkalkning utveckling på olika platser adresser möjliga platsspecifika effekter. Effekten av transplanterade hematopoietiska celler på åderförkalkning utveckling kan bedömas i hyperkolesterolemisk ldlr-/- chimärer. Men hela kroppen bestrålning påverkar åderförkalkning processen med platsspecifika effekter. Mer framträdande aterosklerotiska lesioner utvecklas i aorta roten, medan minskad lesion utveckling observeras i aorta Arches35.
Viktigt, inte bara lesion storlek behöver åtgärdas i studier av experimentell åderförkalkning. Lesion sammansättning är också en viktig parameter. Flera plack funktioner har förknippats med manifestationer av sjukdomen hos människor36. Seriell snittning av aorta roten lämnar flera sektioner tillgängliga för noggrann analys av plack sammansättning. Plack ruptur hos människor kännetecknas av en tunn fibrös mössa med få glatta muskelceller, glesa kollagen innehåll och tecken på inflammation i plack36. Även plack ruptur är en sällsynt händelse i musmodeller av åderförkalkning, markörer för plack stabilitet är informativa att utvärdera. Translationella tillvägagångssätt kan bekräfta mekanistiska resultat från musmodeller och avslöja viktiga egenskaper hos mänskliga sjukdomar31. Inflammatoriska status av aterosklerotiska plack kan bestämmas genom immunohistokemi färgning av VCAM-1, MHC klass II, makrofager, och lymfocyter30. Vissa protokoll använder längsgående sektioner i koronala planet i aortabågen eller brachiocephalic artär för att mäta aterosklerotisk lesion storlek och sammansättning37. Emellertid, denna alternativa metod lämnar endast få delar som ska analyseras, som begränsar dess applikationer.
Ett initialt kritiskt steg i detta protokoll är förmågan att skörda artärer effektivt. Hand-öga-koordination under mikroskopet kräver övning och är avgörande både för microdissection och den efterföljande fastlåsning av aortabågen. Nästa kritiska steg i detta protokoll är insamling av seriella sektioner från aorta roten. 80 sammanhängande avsnitt ska samlas in för varje mus, vilket kräver både fokus och tålamod. Metodiska färdigheter skulle kunna påskynda de beskrivna processerna avsevärt. Ändå, aterosklerotisk lesion kvantifiering är fortfarande en tidskrävande uppgift. Ny teknik, automatiserad hantering och smådjur avbildning kan underlätta kvantifiering av experimentell åderförkalkning i framtiden. Utvecklingen av åderförkalkning är långsam och de flesta experimentella protokoll i musmodeller tar mer än fyra månader att slutföra13. Därför måste artärer samlas in på ett optimerat sätt vid studieslut punkter. Detta protokoll ger en omfattande guide till skörd artärer effektivt och den föreslagna bearbetningen förbereder artärer för multi-purpose användning inklusive lesion kvantifiering i aorta roten, aortabågen, och brachiocephalic artär. Förhoppningsvis protokollet kan minska experimentell variation, förbättra tillförlitligheten i resultaten, och leda till resultat som kommer att bana väg för nya behandlingar mot åderförkalkning.

Hjärt-kärlsjukdom är den främsta dödsorsaken i världen med ischemisk hjärtsjukdom och stroke redovisning för en av varje fyra dödsfall1. De flesta fall orsakas av åderförkalkning, en sjukdom som kännetecknas av en långsam ansamling av lipidbelastade plack med tecken på kronisk inflammation i stora och medelstora artärer2. Sjukdomen är oftast obemärkt under flera decennier tills en bristning eller erosion av plack framkallar en arteriell trombos som leder till ischemisk vävnadsskada.
En normal artär består av ett intima skikt med endotelceller och glest fördelade glatta muskelceller, ett media skikt med släta muskelceller och elastiska lamellerna, och en omgivande adventitial skikt med lös bindväv3. En intimial retention av LDL kompenserar åderförkalkning utveckling4. Ackumulering och modifiering av lipoproteiner leda till aggregering och Entrapment inom arteriell intima5. Ett inflammatoriskt svar framkallas av de fångade och modifierade Lipoproteinerna6. Endotelceller börjar uttrycka adhesionsmolekyler, såsom VCAM-1 på platser i arteriella träd med turbulent blodflöde, vilket leder till rekrytering av cirkulerande monocyter och andra leukocyter7. De ininfiltrerande monocyterna gör åtskillnad mellan in i makrofager det uppsluka lipid med efterföljande omformning till makrofag skumma celler8.
Åderförkalkning har studerats i musmodeller med ökande frekvens sedan mitten av 1980-talet. C57BL/6 är den mest använda inavlade mus stammen för dessa studier, och det används som genetisk bakgrund för de flesta genetiskt modifierade stammar9. Denna stam etablerades i 1920-talet10, och dess arvsmassa publicerades i 200211. Experiment i musmodeller har flera fördelar: kolonierna återger snabbt, bostäder är utrymmeseffektiva och inavel minskar experimentell variation. Modellen möjliggör också genetiska manipulationer, såsom riktade genborttagningar och införande av transgener. Detta har lett till ny patofysiologisk förståelse av sjukdomen och nya terapimål12.
Wild-Type C57BL/6 möss är naturligt resistenta mot åderförkalkning. De har de flesta av de cirkulerande kolesterolet i HDL, och komplexa aterosklerotiska lesioner bildas inte ens när matas en fettrik och hög-kolesterol diet13. Hyperkolesterolemiska möss, såsom APOE-/- på C57BL/6-bakgrunden, används därför som experimentella modeller av åderförkalkning14,15. Avsaknaden av ApoE försämrar hepatiska upptaget av rester lipoproteiner och kraftigt perturbs lipid metabolism. I APOE-/- möss, cirkulerande kolesterol är främst i VLDL partiklar, och möss utveckla komplexa aterosklerotiska plack på en regelbunden Chow diet.
Ldlr-/- möss imiterar utvecklingen av åderförkalkning ses hos människor med familjär hyperkolesterolemi16. Den ldlr-/- möss behöver en västerländsk typ diet för att utveckla åderförkalkning17. Västerländsk diet härmar mänskligt födointag och innehåller vanligtvis 0,15% kolesterol. LDL-receptorn känner igen ApoB100 och ApoE och förmedlar upptaget av LDL-partiklar genom endocytos. LDL-receptorer är grundläggande för leverclearance av LDL från cirkulationen, medan LDL-receptoruttryck i hematopoietiska celler inte påverkar denna process. Detta öppnar möjligheten för benmärgstransplantation av ldlr+/+ celler till hyperkolesterolemiska ldlr-/- mottagare och bedömning av åderförkalkning utveckling. Benmärgs chimärer har ofta använts för att studera deltagande av hematopoietiska celler i experimentell åderförkalkning. Benmärgstransplantation kan dock påverka storleken och sammansättningen av aterosklerotiska plack, vilket gör tolkningen av resultaten tvetydig.
Olika varianter av APOE-/- och ldlr-/- möss med ytterligare genetiska förändringar har utvecklats för att studera specifika processer av sjukdomen18. Ett exempel är human APOB100-transgena ldlr-/- (hubl) möss som bär den fullängds mänskliga APOB100 genen19,20. Dessa möss utveckla hyperkolesterolemi och åderförkalkning på en regelbunden Chow diet. Emellertid, utvecklingen av komplexa aterosklerotiska plack tar minst sex månader och kortare experimentella protokoll brukar använda västerländska diet21. En stor del av plasmakolesterolet cirkulerar i LDL-partiklar, vilket ger hubl möss en mer människoliknande dyslipidemi lipoprotein profil jämfört med APOE-/- och ldlr-/- möss. Hubl möss tillåter också studier av Human ApoB som autoantigenet22.
Mus modellerna av åderförkalkning utveckla komplexa aterosklerotiska plack med gemensamma egenskaper hos mänskliga sjukdomar. Emellertid, plack är ganska resistenta mot bristning med efterföljande hjärtinfarkt. Atherothrombosis är endast sporadiskt upptäcks och experimentellt utmanande att bedöma23,24,25. Särskilda modeller av plack ruptur har utvecklats, men försöksområdet saknar en tillförlitlig och reproducerbar modell för bedömning av plack stabiliserande medel.
Kvantifiering av åderförkalkning har rapporterats på många sätt i litteraturen. De senaste insatserna har försökt standardisera experimentell design, utförande och rapportering av djurstudier26. Utredarna har olika preferenser och tekniker anpassade till sina laboratorier. De flesta forskningsprojekt är också unika på ett sätt som kräver vissa protokoll ändringar. På grund av sjukdomens mångfaktoriella karaktär varierar de optimala kontrollerna mellan projekten. Lokala förhållanden och bristande standardisering kan orsaka observerade skillnader i sjukdomsutveckling, vilket hämmar framstegen inom forskningsområdet. Skillnader i experimentell variation innebär också att statistiska effektberäkningar måste baseras på pilotstudier under lokala förhållanden.
Kvantifiering av åderförkalkning rekommenderas på flera ställen i kärl trädet. Detta protokoll beskriver hur man får resultat från aorta roten, aortabågen, och brachiocephalic artären i en enda mus, förutom att lämna resten av thoracoabdominella aorta för andra analyser. En Face preparat möjliggör snabb kvantifiering av lipidbelastade plack i aortabågen. Sjukdomsbördan i brachiocephalic artären kan också kvantifieras om proverna är noggrant visas. Ju mer tidskrävande tvärsnittning av aorta roten lämnar flera sektioner tillgängliga för detaljerad utvärdering av plack sammansättning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20066.296</td>
			<td>For fixation of sections for immunohistochemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black electrical insulation tape (50 mm wide)</td>
			<td>Any specialized retailer</td>
			<td>-</td>
			<td>To create pinning beds for aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417C</td>
			<td>Benchtop microcentrifuge.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork board</td>
			<td>Any specialized retailer</td>
			<td>-</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 560</td>
			<td>For serial cryosectioning of aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For rinsing and preparation of solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DC480</td>
			<td>5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors (10 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td>For general dissection of organs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5 (11 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500341</td>
			<td>For microdissection of aorta.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% (v/v)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.290</td>
			<td>Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.8%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.310</td>
			<td>Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>9713.1000</td>
			<td>Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>-</td>
			<td>Image analysis software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris forceps (10 cm, curved, serrated)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15915-G</td>
			<td>Used as anatomical forceps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1096341011</td>
			<td>Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaiser&#39;s glycerol gelatine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1092420100</td>
			<td>Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM LB2</td>
			<td>For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>1820</td>
			<td>Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (17 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501751-G</td>
			<td>For general dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503376</td>
			<td>For pinning of aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td>Polypropylene microtubes with snaplock cap.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 3 needles, 23 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>300800</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 3 needles, 27 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>302200</td>
			<td>For perfusion of mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette 500 &#181;L, K3 EDTA</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1341.100</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette 500 &#181;L, Lithium Heparin</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1345.100</td>
			<td>For blood collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien insect pins, 0.10 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>For pinning of aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625</td>
			<td>Not classified as a hazardous substance or mixture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) cryomount</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>45830</td>
			<td>For embedding tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td>Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100x20 mm)</td>
			<td>Any cell culture supplier</td>
			<td>-</td>
			<td>Proposed as a storage container for pinned aortas.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper (grade 1001)</td>
			<td>Munktell</td>
			<td>120006</td>
			<td>For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 &#181;m).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater RNA stabilization reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76106</td>
			<td>For stabilization of RNA in tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>A surface decontamination solution that destroys RNases on contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3 (13 cm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard scalpel blade #10</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500239</td>
			<td>For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>For dissection and en face documentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4261</td>
			<td>Not classified as a hazardous substance or mixture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>To collect aortic root sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps (15 cm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501741-G</td>
			<td>For general dissection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek cryomolds (10x10x5 mm)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4565</td>
			<td>For embedding aortic roots in OCT.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors (8 cm, straight)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503378</td>
			<td>For microdissection of aorta.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of atherosclerosis in mice

Hjärt-kärlsjukdom är den främsta dödsorsaken i världen. Den bakomliggande orsaken i de flesta fall är åderförkalkning, som delvis är en kronisk inflammatorisk sjukdom. Experimentella studier av åderförkalkning har belyst betydelsen av kolesterol och inflammation i sjukdomsprocessen. Detta har lett till framgångsrika kliniska prövningar med farmaceutiska agenter som minskar kliniska manifestationer av åderförkalkning. Noggranna och välkontrollerade experiment i musmodeller av sjukdomen kan ytterligare belysa patogenesen av sjukdomen, som inte är helt klarlagd. Standardiserad lesionsanalys är viktigt för att minska experimentell variation och öka reproducerbarheten. Bestämma lesion storlek i aorta roten, aortabågen, och brachiocephalic artär är vanliga endpoints i experimentell åderförkalkning. Detta protokoll ger en teknisk beskrivning för utvärdering av åderförkalkning på alla dessa platser i en enda mus. Protokollet är särskilt användbart när materialet är begränsat, vilket ofta är fallet när genetiskt modifierade djur karaktäriseras.

I musmodeller av åderförkalkning de mest framträdande lesioner tenderar att utvecklas i aorta roten och aortabågen. Detta protokoll beskriver kvantifiering av åderförkalkning i aorta roten, aortabågen, och brachiocephalic artär i en enda mus. Mätbara lesioner i bröstkorg fallande aorta och bukaorta är endast närvarande hos djur med förskott sjukdom. I detta protokoll, dessa delar är inte analyseras för aterosklerotisk börda, men sparas för efterföljande analys av mRNA nivåer eller andra analyser. Seriella avsnitt av aterosklerotiska lesioner i aorta roten är vanligtvis visas i ett diagram med lesion storlek på y-axeln och avståndet till aorta sinus på x-axeln28. True tvärsnitt är avgörande för kvantifiering av lesionsstorlek. Sneda sektioner kan överskatta lesionstorlekar och en tippning av endast 20 ° kan överskatta den absoluta lesionsytan med 15%29. Beräkningen av lesionfraktionen av den totala fartygs arealen gör dock att resultatet blir mindre känsligt för möjliga vinkel skillnader under snittning (figur 4a). En lämplig statistisk metod för att upptäcka skillnader mellan grupper är vanligtvis en vanlig 2-vägs analys av varians (ANOVA). Bonferroni efter tester utförs sedan för att upptäcka skillnader på vissa nivåer. Fisher ' s minst signifikanta skillnaden kan också användas som ett uppföljnings test till ANOVA. Det minskar sannolikheten för statistiska fel i typ II, men tar inte hänsyn till flera jämförelser. Dessutom kan det vara belysande att beräkna arean under kurvan eller den genomsnittliga lesionsstorleken per mus och presentera data i en punktkomplott för att ytterligare visualisera enskilda variationer inom grupperna (figur 4b).
Oil Red O är ett fettlösligt ljust rött Diazo färgämne, som fläckar neutrala lipider. Polära lipider i cellmembran är inte färgade. Olja röd O färgning kan utföras på färska, frysta eller formalin-fasta prover, men inte på paraffin-inbäddade prover på grund av avlägsnande av lipider i den nödvändiga avparaffinering process. En kvantifiering av lesionell lipidackumulering kan utföras genom att färg tröskel hålls i det Olröda O-positiva området för total lesionsareal (figur 4c). Hematoxylin ger en Blåfärgning av cellkärnor, vilket är till hjälp för att visualisera plack morfologi. Höger och vänster kranskärl avviker vanligtvis från aorta runt 250 μm från aorta sinus27, som ofta sammanfaller med de mest framträdande lesion storlekar. Tvärsnitt från denna region visas ofta som representativa resultat (figur 4D).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig4.jpg"> Figur 4: aterosklerotiska lesioner i aorta roten. (A) tjugoåtta veckor gamla manliga benmärg chimärer matas västerländsk kost under åtta veckor utvärderades för att fastställa effekten av Smad7-bristfällig T-celler på åderförkalkning utveckling. Experimentell ldlr-/- chimärer fått CD4-CRE+Smad7fl/fl benmärg och kontroller fått CD4-CRE+Smad7fl/+ benmärg. Grafen visar kvantifiering av aterosklerotisk lesion område från åtta på varandra följande avsnitt, 100-800 μm från aorta sinus visas som lesion fraktion av totala kärlet yta (Cd4-CRE+Smad7fl/+/ldlr-/- n = 6, Cd4-CRE+Smad7fl/fl/ldlr-/- n = 9, 2-vägs ANOVA med Bonferroni ' s post test, diagram visar medelvärdet ± SEM, hängslen indikerar signifikansnivå för stam jämförelse). (B) den kombinerade dot Plot och stapeldiagram visar medelvärdet aterosklerotisk lesion området från aorta roten avsnitt (Cd4-CRE+Smad7fl/+/ldlr-/- n = 6, Cd4-CRE+Smad7fl/fl/ Ldlr-/- n = 9, Students t-test) (C) fraktion av oljerött O-färgat område i lesioner (Cd4-CRE+Smad7fl/+/ldlr-/- n = 4, Cd4-CRE+Smad7fl/fl /Ldlr-/- n = 6, Students t-test, ns = icke-signifikanta) (B-C) prickar representerar enskilda möss och staplar visar medelvärdet ± SEM.D) representativa mikrografer som visar oljeröd O-färgning (i rött färg) av neutrala lipider i aorta roten 300 μm från aorta sinus (50x förstoring), Scale bar = 500 μm. *p ≤ 0,05, * * *p ≤ 0,001. Denna siffra har modifierats från Gisterå et al.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Olja röd O kan användas för färgning av en Face beredda aortas, men detta protokoll använder Sudan IV, en annan lämplig fettlösliga Diazo färgämne. Sudan IV visualiserar tydligt aterosklerotiska plack i en orange-röd färg genom färgning av lipider, triglycerider och lipoproteiner. Ta bort den mörka bakgrunden i representativa bilder av en Face aorta valv kan förbättra den visuella displayen (figur 5a). Vanligtvis fördelas lesionsstorlek normalt inom grupper, vilket möjliggör statistisk testning med Students t-test mellan grupper. En punktplot som visar både enskilda möss och medelvärdet, som jämförs mellan grupper, är ett informativt sätt att visa resultaten (Figur 5b-C). Eftersom variationen inom grupper vanligtvis skiljer sig mellan olika platser i det vaskulära trädet, behövs vanligtvis separata kraft beräkningar. Onödig variation kan undvikas genom metodkunskaper och protokoll standardisering. Att få statistiskt signifikanta resultat är viktigt, men den biologiska relevansen för en observerad skillnad måste alltid beaktas.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig5.jpg"> Figur 5: aterosklerotiska lesioner i aortabågen och brachiocephalic artär. (A) representativa en Face mikrografer av aorta valv med lipid-lastade plack färgade med Sudan IV (i orange färg) från 20 veckor gamla möss matas västerländsk kost i tio veckor, visualiseras tillsammans. Skalbar = 2 mm. Human APOB100-transgena ldlr-/- (hubl) möss användes som kontroller och den experimentella gruppen bestod av TCR-transgena möss med LDL-reaktiva T-celler (filen Bt1) som korsavlade till hubl -möss. (B) aterosklerotiska lesioner i aortabågen (Hubl n = BT1xHuBL n = 12; Students t-test). (C) aterosklerotiska lesioner i brachiocephalic artären (hubl n = 8, BT1xHuBL n = 9, Students t-test). (B-C) Prickar representerar enskilda möss, staplar visar medelvärdet ± SEM. *p ≤ 0,05. Denna siffra har modifierats från Gisterå et al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Kompletterande figur 1: alternativ organisation av diabilder för seriella delar av aorta roten. En förenklad systematisk bild organisation för insamling av sektioner från aorta roten. Samlingen möjliggör olja röd O färgning för lipider och immunohistokemi eller immunofluorescensfärgning. Dedikerade diabilder för Picrosirius rödfärgning av kollagen utelämnas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/2019-JoVE-Figure-S1.eps">Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Atherosclerosis in Mice at JoVE.com

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Murina modeller av åderförkalkning är användbara verktyg för att undersöka patogena vägar på molekylär nivå, men kräver standardiserad kvantifiering av lesion utveckling. Detta protokoll beskriver en optimerad metod för att bestämma lesion storlek i de stora arteriella fartyg inklusive aorta roten, aortabågen, och brachiocephalic artär.

Kvantifiering av åderförkalkning hos möss

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Hjärt-kärlsjukdom är den främsta dödsorsaken globalt. Musmodeller är användbara verktyg för att studera denna sjukdom och vårt protokoll kan användas för att kvantifiera åderförkalkning hos möss. Med hjälp av detta protokoll kan lesionsstorlek mätas på tre vaskulära platser.Aortaroten, aortabågen och den brachiocephaliska artären. Kvantifieringen av åderförkalkning hos möss kan vara en tråkig uppgift. Vi har tillhandahållit detaljerade steg som vi hoppas kan påskynda processen.Några av dessa steg är svåra att beskriva skriftligen. Vi hoppas att denna video kommer att hjälpa dig att erhålla robust aterosklerotisk lesion storlek analys. Efter skörd en mus hjärta enligt standardprotokoll, placera hjärtat på en kork säng, ventrala sidan upp under en dissekera mikroskop och använda en nål för att fixa hjärtat till korken genom spetsen.Hålla basen av hjärtat med anatomiska tlyck, använd en skalpell som hålls i en 20 graders vinkel caudally i sagittal planet, och 20 grader kranialt i det tvärgående planet, att skära bort den apikala två tredjedelar av hjärtat. Bädda in aortaroten och basen av hjärtat i optimal skärtemperaturförening, eller OCT, och försiktigt pressa hjärtat med tlyktorna för att fylla aortaroten med förening och för att ta bort eventuella luftbubblor. Överför exemplaret till botten av en kryosen fylld med OCT med aortaroten vinkelrätt mot bottenytan och frys föreningen på torris.Förvara sedan vävnadsprovet i en fryspåse vid minus 80 grader Celsius tills kryosektionering. För att förbereda en fästbädd för en face analys, vik ett segment av paraffin vax film åtta gånger för att göra en platt 25 av 25 mm yta och linda svart elektrisk isolering tejp runt filmen för att göra en mörk bakgrund för aorta. Placera en etikett på baksidan av fästsängen och använd en blyertspenna för att registrera musidentifieringsnumret.Överför aortabågen till fästbädden och lägg till en droppe PBS till vävnaden. Med hjälp av ett stereomikroskop, rengör aorta från den återstående periadventitiella fettvävnaden och använd Vannas sax och Dumont-forceps för att försiktigt skala bort all omgivande fettvävnad utan att manipulera eller skada aorta. Därefter introducerar Vannas saxen i aortalumen för att exponera den skrämmande ytan.Börja skära den yttre krökningen av den stigande bågen i den distala riktningen, fortsätter att skära upp grenarna, inklusive den brachiocephalic artären och skona dorsala delen av fallande bröst regionen. För att visa den skrämmande ytan, skär upp den mindre krökningen och vik upp aorta. Med hjälp av en micro Castroviejo nålhållare, säkra den öppna bågen till pinning sängen med den trubbiga änden av minuten insektsstift utan att sträcka ut provet, försiktigt böja stiften bort från provet som vävnaden hålls på plats.Förvara sedan den fästa bågen facedown i en petriskål av PBS i fyra grader Celsius. För Sudan IV färgning, skölj exemplaret i fem minuter i en Petri-skålen av 70%etanol med bågen vänd nedåt, innan du överför exemplaret till en maträtt av Sudan IV arbetslösning i sju minuter. I slutet av inkubationen skölj provet med två treminuterstvättar i 80%etanol för att avbeta den normala intimalytan, följt av en slutsköljning i PBS innan vävnaden återförs till sin ursprungliga petriskål.Sedan förvärva mikrografer under en stereo mikroskop ansluten till en digitalkamera vid en 10X förstoring, få bilder av den fästa bågen nedsänkt i PBS, med hjälp av små metallvikter för att hålla pinning sängen till botten av Petri skålen. För att erhålla kryosektioner av den inbäddade aortaroten, ställ in kryostattemperaturen på minus 20 grader Celsius och sektionstjocklek på 10 mikrometer. Montera ULT-blocket som innehåller aortaroten på preparathållaren med ventrikelvävnaden vänd utåt.Säkra placeringen med ytterligare ytterligare OCT om det behövs. Aortaroten ska nu placeras vinkelrätt mot knivbladet. Samla in de inledande kontrollsektionerna som innehåller hjärtmuskelvävnad på vanliga mikroskopbilder, kontrollera progressionen genom vävnaden var 200 mikrometer under ett ljusmikroskop.När den första aorta cusp visas, luta exemplaret mot punkt noll cusp att anpassa avsnittet planet med de två andra cusps och räkna varje 10 mikrometer avsnitt som skärs från punkt noll och framåt. Börja samla in sektioner för analys från 90 mikrometer och framåt enligt den planerade bilden, tills 800 mikrometer från punkt noll har uppnåtts. Beräkning av lesionsfraktionen av aortarotens totala kärlarea gör att uppgifterna blir mindre känsliga för möjliga vinkelskillnader under snittningen.Dessutom skulle det kunna vara belysande att beräkna området under kurvan eller atheroto lesion storlek per mus och presentera data i en punkt tomt att ytterligare visualisera enskilda variationer inom grupper. Lesional lipid ackumulering kan kvantifieras genom färg thresholding olja röda O positiva områden av den totala lesion område. Höger och vänster födans artärer avviker vanligtvis från stora stora delar omkring 250 mikrometer från aorta sinus som ofta sammanfaller med de mest framträdande lesion storlekar.Ta bort den mörka bakgrunden i representativa bilder av en face aortabågar kan förbättra den visuella displayen. Lesionsstorleken är normalt normalt fördelad inom grupper, vilket möjliggör statistisk analys med hjälp av Students t-test mellan grupper. Vi rekommenderar att öva med lite testmaterial tills du har fått tillräckliga färdigheter för bearbetning av dina experimentella prover.Om lesionsstorleken är olika mellan grupper, bör du bestämma mekanismen, som en lesion sammansättning analys är vanligtvis nästa steg att fullfölja.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³HV68 Infection in Mice

Mätning av γHV68 infektion hos möss

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Utarmning och Beredning av makrofager i möss

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Mätning Lokala Anafylaxi i möss

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion av murina tarminflammation med adoptiv överföring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hög</sup&gt; T-celler i möss med immunbrist

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur av makrofag kolonistimulerande faktor Differentierad Human Monocyte-härledda makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Icke-invasiv provtagning av slemhinna slemhinnan vätska för kvantifiering av In Vivo övre luftvägarna immun-medlare nivåer

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakterisering av Thymus-beroende och oberoende av Thymus immunglobulin isotypen Svaren hos möss använder Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Kvantifiering av antikroppsberoende förbättring av zikaviruset i primära mänskliga celler

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Isolering och kvantifiering av zikavirus från flera organ i en mus

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...