Name: in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

نعرب عن امتناننا للدعم المالي من خلال DFG TRR 235 (ظهور الحياة، المشروع P15)، ومجلس البحوث الأوروبي (اتفاق المنحة رقم 694410 AEDNA)، وكلية الدراسات العليا الدولية للعلوم والهندسة في TUM IGSSE (المشروع رقم 9.05) . نشكر إي فالغنهاور على مساعدتها في إعداد العينات. نشكر أ. دوبين وم. شوارتز شيلينغ على مساعدتهما في نظام TX-TL والمناقشات المفيدة. نشكر ن. ب. هولاند على المناقشات المفيدة.

1. التعبير عن الببتيدات مثل الإيلاستين
<ol><li>اليوم الأول: إعداد ثقافة بداية واللوازم للتعبير الببتيد
	<ol>
<li>إعداد وقوارير ثقافة التعبير الأوتوكلاف (4 × 2.5 لتر) و 3 لتر من LB المتوسطة. ل1 لتر من LB المتوسطة، إضافة 25 غرام من مسحوق LB إلى 1 لتر من الماء النقي جدا.</li>
		<li>إعداد ثقافة كاتب مع 100 مل ...

<ol>
	<li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles.">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li><li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth.">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li><li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes.">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).</li><li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+macromolecules+by+lipid+vesicles+under+simulated+prebiotic+conditions.">Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions.</a> Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).</li><li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Template-Directed+RNA+Synthesis+Inside+Model+Protocells.">Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+growth+and+division+of+model+protocell+membranes.">Coupled growth and division of model protocell membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).</li><li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA.">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).</li><li>Chu, H. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+(ELP)+in+a+cell-free+protein+synthesis+system.">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li><li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Expression,+Aggregation,+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures.">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments.">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers.">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., M&#252;ckl, A., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+communication+between+bacteria+and+cell-free+gene+expression+systems+within+linear+chains+of+emulsion+droplets.">Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets.</a> Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).</li><li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0:+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution.">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+light+scattering:+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences.">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li></ol>

الإماهة الفيلم هو إجراء شائع لخلق الحويصلات يونيلاميلار الصغيرة. المصدر الرئيسي للفشل هو التعامل الخاطئ مع المواد المستخدمة في الإجراء.

في البداية، يتم إنتاج ELPs من قبل خلايا القولونية E. . العائد بعد تنقية ELP يمكن أن تختلف اختلافا كب...

عادة ما يتم الاقتراب من إنشاء النظم الخلوية الحية الاصطناعية من اتجاهين مختلفين. في الطريقة من أعلى إلى أسفل ، يتم تقليل جينوم البكتيريا إلى مكوناته الأساسية ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى الحد الأدنى من الخلية. في النهج من أسفل إلى أعلى، يتم تجميع الخلايا الاصطناعية دي نوفو من المكونات الجزيئية أو النظم الفرعية الخلوية، والتي تحتاج إلى دمجها وظيفيا في نظام ثابت مثل الخلية.
في نهج دي نوفو، وعادة ما يتحقق تجزئة المكونات البيوكيميائية اللازمة باستخدام الأغشية المصنوعة من الدهون الفوسفاتية أو الأحماض الدهنية1،2،3،4. وذلك لأن أغشية الخلايا "الحديثة" تتكون أساسا من الدهون الفوسفاتية، في حين تعتبر الأحماض الدهنية المرشحين معقولة من حاويات غشاء بريبيوتيك5،6. لتشكيل أغشية جديدة أو لتسهيل نمو الغشاء، يجب توفير كتل البناء amphiphilic من الخارج7 أو من الناحية المثالية من خلال الإنتاج داخل مقصورة membranous باستخدام عمليات الابتنائية المقابلة4 ،8.
في حين أن تخليق الدهون هو عملية التمثيل الغذائي معقدة نسبيا، يمكن أن تنتج الببتيدات بسهولة جدا باستخدام ردود الفعل التعبير الجيني خالية من الخلايا9،10. وبالتالي، فإن أغشية الببتيد التي شكلتها الببتيدات amphiphilic تمثل بديلا للاهتمام للأغشية الدهنية كما مرفقات لتقليد الخلايا الاصطناعية التي هي قادرة على النمو11.
البوليمرات المركبة التي تشبه الإيلاستين أمفيفيليك (ELPs) هي فئة جذابة من الببتيدات، والتي يمكن أن تكون بمثابة لبنة البناء لمثل هذه الأغشية12. عزر تسلسل الأحماض الأمينية الأساسية من ELPs هو (GaGVP)ن، حيث "أ" يمكن أن يكون أي حمض أميني باستثناء برولين و "ن" هو عدد من عزر يكرر13،14،15،16،17 . وقد تم إنشاء ELPs مع كتلة الكارهة للماء التي تحتوي أساسا فينيلألانين لكتلة وhydrophilic تتألف أساسا من حمض الجلوتاميك11. اعتمادا على المعلمات والحل، مثل درجة الحموضة وتركيز الملح، ELPs تظهر ما يسمى انتقال درجة الحرارة العكسية في درجة الحرارة TT، حيث تخضع الببتيدات للانتقال مرحلة قابلة للعكس تماما من الماء إلى الكاره للماء الدوله. يمكن تنفيذ تركيب الببتيدات بسهولة داخل الحويصلات باستخدام "TX-TL" استخراج الخلايا البكتيرية11،18،19،20،21،الذي يوفر جميع المكونات اللازمة لردود الفعل النسخ والترجمة المقترنة.
تم تغليف نظام TX-TL معا، مع قالب الحمض النووي ترميز ELPs في الحويصلات ELP باستخدام الجفاف الإماهة من الخرز الزجاجي كدعم قوي. تشكيل الحويصلات يحدث من خلال الإماهة من الببتيدات المجففة من سطح حبة11. ويمكن استخدام أساليب أخرى22 لتكوين الحويصلات، والتي يحتمل أن تظهر أقل تشتت وأحجام الحويصلة أكبر (على سبيل المثال، تشكيل الكهربائية، نقل مرحلة مستحلب، أو الأساليب القائمة على microfluidics). لاختبار صلاحية طريقة التغليف، يمكن استخدام نسخ من dBroccoli aptamer الفلورية23 بدلاً منذلك 11، وهو أقل تعقيداً من التعبير الجيني مع نظام TX-TL.
بسبب التعبير عن كتل بناء الغشاء في vesiculo وتأسيسها في وقت لاحق في الغشاء ، تبدأ الحويصلات في النمو11. ويمكن إثبات دمج غشاء ELPs من خلال فحص افري. ولهذه الغاية، تترافق الـ ELPs المستخدمة في تكوين مجموعة الحويصلات الأولية مع الأصباغ الفلورية بحصص متساوية تشكل زوجاً من الـ FRET. عند التعبير عن ELPs غير المسمى في vesiculo ودمجها في الغشاء ، يتم تخفيف ELPs المسمى في الغشاء وبالتالي فإن إشارة FRET تنخفض11. كطريقة متعددة الاستخدامات وشائعة للاقتران، يتم استخدام النحاس المحفز ة أزيد-ألكين سيكلوكسيدو. مع استخدام الرباط استقرار مثل تريس (البنزلتريازولميثيل) أمين، يمكن أن يتم رد الفعل في محلول مائي في درجة الحموضة الفسيولوجية دون تحلل التحلل من المتفاعلين11، وهو مناسب لتفاعلات الاقتران التي تنطوي على الببتيدات.
ويقدم البروتوكول التالي وصفاً مفصلاً للإعداد لزراعة الببتيدوسومات القائمة على ELP. يتم وصف التعبير عن الببتيدات وتشكيل الحويصلة باستخدام طريقة الخرز الزجاجي. وعلاوة على ذلك، يتم وصف كيفية تنفيذ نسخ من البروكلي الفلورية aptamer ورد الفعل النسخ الترجمة للتعبير عن البروتين داخل الحويصلات ELP. وأخيرا، شريطة هو إجراء لاقتران ELPs مع الفلوروفور، والتي يمكن استخدامها لإثبات نمو الحويصلة من خلال فحص فريت11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3012-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>733-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN38.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6344.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4432.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P024.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Lucerna Technologies</td>
			<td>410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (&#946;-isopropyl thiogalactoside )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>82.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)</td>
			<td>Baseclick</td>
			<td>BCL-033-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>263.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH stripes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>549.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76180-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W290017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAPol reaction buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap Wipes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8655.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile-filtered (0.22 &#181;m filter)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>XH76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>MRE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth

تجزئة التفاعلات البيوكيميائية هو جانب مركزي من الخلايا الاصطناعية. ولهذا الغرض، تعمل مقصورات التفاعل القائمة على الببتيد كبديل جذاب للدهون أو الحويصلات القائمة على الأحماض الدهنية. خارجيا أو داخل الحويصلات، يمكن التعبير عن الببتيدات بسهولة وتبسيط توليف السلائف الغشاء. كما هو منصوص عليه هنا بروتوكول لإنشاء الحويصلات بأقطار تبلغ حوالي 200 نانومتر استناداً إلى الببتيدات الشبيهة بالإيلاستين (ELP) باستخدام الإماهة من الخرز الزجاجي. كما تقدم بروتوكولات للتعبير ELP البكتيرية وتنقية عن طريق ركوب الدراجات في درجة الحرارة العكسية، فضلا عن وظيفية covalent مع الأصباغ الفلورية. وعلاوة على ذلك، يصف هذا التقرير بروتوكولا ً للتمكين من نسخ الحمض النووي الريبي aptamer dBroccoli داخل الحويصلات ELP كمثال أقل تعقيداً لتفاعل كيميائي حيوي. وأخيرا، يتم توفير بروتوكول، والذي يسمح في التعبير vesiculo من البروتينات الفلورية والببتيد الغشاء، في حين أن توليف هذا الأخير يؤدي إلى نمو الحويصلة.

إنتاج الحويصلات ويبين الشكل 1 صورة مجهرية إلكترونية للإرسال (TEM) لمن الحويصلات المعدة باستخدام حلول مختلفة للتورم وطريقة الخرز الزجاجي (انظر أيضاً Vogele et al.11). بالنسبة للعينة في الشكل 1A، تم استخدام PBS فقط كحل تورم لإثبات تشكيل الحويصلا?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

في فيسيكولو التوليف من السلائف غشاء الببتيد لنمو الحويصلة المستقلة

تقدم هنا بروتوكولات لإنشاء الحويصلات أحادية اللاميلار الصغيرة القائمة على الببتيد قادرة على النمو. لتسهيل في إنتاج vesiculo من الببتيد الغشاء، وقد تم تجهيز هذه الحويصلات مع نظام ترجمة النسخ وبلازميد الببتيد ترميز.

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

في بروتوكول لدينا، ونحن نستخدم إعادة ترطيب الفيلم من الخرز الزجاجي الصغيرة لتشكيل أجزاء رد فعل مصنوعة من الببتيدات. في التجارب، نستفيد من بساطة البروتوكول ومدى صموده. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على دمج حتى عينات حساسة، مثل استخراج الخلايا الخام المستخدمة.سوف الاتصال مع المذيبات العضوية تؤثر بشكل كبير على العينة. لبدء هذا الإجراء، استخدم مكثف فراغ الطرد المركزي لتركيز حل ELP إلى 1.1 ملليمولار. مزيج 200 ميكرولترات من هذا الحل المركز مع 1، 250 ميكرولترات من اثنين إلى واحد من كلوروفورم والميثانول خليط.دوامة الحل لخلط شامل. بعد ذلك، أضف 1.5 جرام من الخرز الزجاجي الكروي إلى قارورة قاعية مستديرة لمدة عشرة ملليلتر. إضافة ELP والميثانول الكلوروفورم حل إلى قارورة أسفل الجولة، ويهز بلطف لخلط.قم بتوصيل القارورة بمبخر دوار. ضبط السرعة إلى 150 دورة في الدقيقة وتنظيم الضغط إلى 20،000 باسكال لمدة أربع دقائق تقريبا، حتى يتبخر السائل في درجة حرارة الغرفة. من المهم أن نكون حذرين عند استخدام المبخر الدوار بسبب التخلف الغليان المحتمل.بعد هذا، التفاف فضفاضة رقائق الألومنيوم حول فتح قارورة أسفل مستديرة لمنع فقدان الخرز الزجاجي ووضع القارورة في مجفف لمدة ساعة واحدة على الأقل، لضمان أن يتم تبخر الكلوروفورم والميثانول المتبقية. لتجربة واحدة، مزيج 100 ملليغرام من الخرز الزجاجي الببتيد غطت مع 60 ميكرولترات من محلول تورم. احتضان هذه العينة في 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.استخدام الطاردة المركزية الجدول الأعلى للطرد المركزي العينات بسرعة ورواسب الخرز الزجاجي. ثم استخدام ماصة لجمع نابيرانت، الذي يحتوي على الفحوى. أولا، مزيج 100 ميكرولترات من الحمض النووي البلازميد قبل تنقية مع 100 ميكرولترات إما روتي الفينول، الكلوروفورم، أو الكحول الأيزوميل في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير لتمكين فصل المرحلة أفضل.عكس بلطف أنبوب يصل إلى ست مرات والطرد المركزي في 16،000 مرات ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم، إضافة 200 ميكرولترات من الكلوروفورم إلى المرحلة العليا، وعكس أنبوب تصل إلى ست مرات. الطرد المركزي العينة في 16، 000 مرة ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.بعد هذا، الماصات المابس إلى أنبوب منفصل وإضافة 10 ميكرولترات من ثلاثة خلات الصوديوم الضرس لهطول الأمطار الإيثانول. أضف ملليلتر واحد من الإيثانول البارد عند 80 درجة مئوية ويخزن العينة عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، الطرد المركزي العينة في 16،000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.decant المابير وإضافة ملليلتر واحد من الايثانول الباردة 70٪ في 20 درجة مئوية. جهاز طرد مركزي في 16،000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم، وإزالة السائل عن طريق الأنابيب، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه الحمض النووي.تخزين العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة تقريبا لتتبخر الإيثانول المتبقية. بعد ذلك، إضافة المياه النقية جدا إلى العينة لضبط تركيز العينة إلى ما يقرب من 300 نانومولار، والذي يقاس من خلال امتصاص في 260 نانومتر. لإعداد رد فعل ترجمة النسخ، اتبع استخراج الخلية الخام المعدة و المخزن المؤقت للتفاعل على الجليد.لمزيج تفاعل 60 ميكرولتر، إضافة الحمض النووي البلازما إلى 37.5 ميكرولترات من العازلة رد فعل، إضافة 28.7 ميكرولترات من استخراج الخلايا الخام وملء مع المياه النقية جدا إلى حجم النهائي من 58.8 ميكرولترات. الحق قبل أن يبدأ التفاعل، إضافة 1.2 ميكرولترات من حل البوليميراز T7RNA، وماصة صعودا وهبوطا لخلط. احتضان العينة ومحلول تورم عند 29 درجة مئوية طوال مدة التجربة ، والتي عادة ما تكون من أربع إلى ثماني ساعات.تظهر صور التصوير المجهري للإلكترونات من الـ"إنسيلت" (مجهرية) من الـ"إنسيل" أن حلول التورم المختلفة، مثل TX/TL أو حتى PBS فقط يمكن استخدامها لتشكيل أوعية. وبالنسبة لكلا الحلين، فإن تحديد الحجم هو خطوة مباشرة إلى الأمام. يظهر تشتت الضوء الديناميكي أن الفُيصلات التي تم إعدادها بدون طريقة الخرز الزجاجي ينتج عنها قطر 134 نانومتر، مع تعدد التخصصات من 25٪ عندما يتم استخدام الخرز الزجاجي، يؤدي القطر في 168 نانومتر، مع تعدد 21٪ كثافة الفلوريسنس من اثنين من البروتينات الفلورية، والتي يتم التعبير عنها داخل vesicles ELP، ثم يتم قياس باستخدام قارئ لوحة الفلوريسين.من المهم أن نلاحظ أنه بعد تشكيل الفحوى ، فإن محتويات الفحوى والحل الخارجي هي نفسها ، وبالتالي ، يضاف المضاد الحيوي Kanamycin إلى الحل الخارجي لقمع التعبير البروتيني. كتحكم، يتم إضافة كاناميسين أيضا إلى حل تورم، وفي هذه الحالة يتم قمع التعبير البروتين داخل من الفينة. وهذا يدل على أن كاناميسين لا ينتشر من خلال الغشاء، ويقمع التعبير الداخلي باستمرار، في كل وقت.ثم يتم إجراء فحص فريت لإثبات دمج ELP في الغشاء. عند التعبير عن ELPs الغشاء، الببتيدات إضافية دمج في الغشاء، مما يزيد من متوسط المسافة بين أزواج فريت، والذي يؤدي إلى زيادة إشارة المانحة. ويمكن استخدام هذه التقنية المقدمة لإنتاج حاويات رد فعل بسيطة أو لإنشاء خلايا اصطناعية مع أغشية تعتمد على الببتيد.يمكن اختيار المحتوى داخل حسب الحاجة. باستخدام هذه الفاتيد vesicles، يمكننا الآن نتطلع إلى الأمام على تفاعلات التوليف أكثر تعقيدا داخلها.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

محوار النمو الإمتداد : إن Mechanotransduction من نمو الخلايا العصبية

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

الذهب Nanostar التجميعي مع أسلوب بذور فضة النمو وساطة

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

زراعة خلايا العصبية السلف في هيدروجيل 3 الابعاد الذاتي تجميع الببتيد

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

جيل واسترداد خلايا β الأجسام الشبه الكروية من الهلاميات المائية PEG-الببتيد الخطوة النمو

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

الدهون طبقة ثنائية الحويصلة انشاء طريق ميكروفلويديك النفث

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

تحليل غشاء أنبوبي الشبكات في القلب Myocytes من أتريا والبطينات

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

نقل التلألؤ الرنين الطاقة لدراسة التغييرات بتكوين جزئي في غشاء البروتينات أعرب في خلايا الثدييات

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

مجمع متضاعف الكتروليتي للهيبارين ربط تسليم عظمية عامل نمو المجال

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

توليف لاستهداف الوحيدات في المذيلات أمفيفيلي الببتيد للتصوير من تصلب الشرايين

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

استزراع خلايا الثدييات في السقالات ببتيد ثلاثي الأبعاد

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...