Name: in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

Vi anerkender taknemmeligt finansiel støtte gennem DFG TRR 235 (fremkomsten af Life, Project P15), det Europæiske Forskningsråd (tilskudsaftale nr. 694410 AEDNA) og TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (projekt nr. 9,05) . Vi takker E. Falgenhauer for hendes hjælp med prøveforberedelse. Vi takker A. Dupin og M. Schwarz-Schilling for deres hjælp med TX-TL systemet og nyttige diskussioner. Vi takker N. B. Holland for nyttige diskussioner.

1. ekspression af elastin-lignende polypeptider
<ol><li>Dag 1: forberedelse af en start kultur og forsyninger til peptidekspression
	<ol>
<li>Forbered og autoklave udtryks kultur kolber (4 x 2,5 L) og 3 liter lb medium. For 1 liter lb-medium tilsættes 25 g lb-pulver til 1 liter ultrarent vand.</li>
		<li>Forbered en start kultur med 100 ml lb-medium, 50 μl sterilfiltreret (0,22 μm filter) chloramphenicol opløsning (25 mg/ml i EtOH) og 50 μl sterilfiltreret (0,22 μm filter) carbenicillin opløsnin...

<ol>
	<li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles.">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li><li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth.">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li><li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes.">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).</li><li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+macromolecules+by+lipid+vesicles+under+simulated+prebiotic+conditions.">Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions.</a> Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).</li><li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Template-Directed+RNA+Synthesis+Inside+Model+Protocells.">Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+growth+and+division+of+model+protocell+membranes.">Coupled growth and division of model protocell membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).</li><li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA.">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).</li><li>Chu, H. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+(ELP)+in+a+cell-free+protein+synthesis+system.">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li><li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Expression,+Aggregation,+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures.">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments.">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers.">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., M&#252;ckl, A., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+communication+between+bacteria+and+cell-free+gene+expression+systems+within+linear+chains+of+emulsion+droplets.">Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets.</a> Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).</li><li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0:+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution.">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+light+scattering:+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences.">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li></ol>

Film rehydrering er en fælles procedure for oprettelse af små af vesikler. Den vigtigste kilde til fiasko er den forkerte håndtering af de materialer, der anvendes i proceduren.

I første omgang ELPs produceres af E. coli celler. Udbyttet efter ELP rensning kan variere betydeligt afhængigt af, hvor omhyggeligt protokollen er gennemført i løbet af sine afgørende skridt. Disse er den inverse temperatur cykling (I...

Skabelsen af syntetiske levende cellulære systemer er normalt gribes an fra to forskellige retninger. I top-down-metoden reduceres genomet af en bakterie til dens væsentlige bestanddele, hvilket i sidste ende fører til en minimal celle. I bottom-up-tilgangen samles kunstige celler de Novo fra molekylære komponenter eller cellulære delsystemer, som skal integreres funktionelt i et ensartet celle lignende system.
I de Novo-tilgangen opnås der sædvanligvis afskærmning af de nødvendige biokemiske komponenter ved hjælp af membraner fremstillet af phospholipider eller fedtsyrer1,2,3,4. Dette skyldes, at "moderne" cellemembraner hovedsageligt består af phospholipider, mens fedtsyrer betragtes som plausible kandidater af prebiotiske membran kabinetter5,6. For dannelsen af nye membraner eller for at lette membran vækst, skal amfifile byggeklodser leveres fra det udvendige7 eller ideelt gennem produktion i et membranøs rum ved hjælp af de tilsvarende anabolske processer4 ,8.
Mens lipid syntese er en relativt kompleks metabolisk proces, peptider kan produceres ganske let ved hjælp af celle-fri genekspression reaktioner9,10. Derfor, peptid membraner dannet af amfifile peptider repræsenterer et interessant alternativ til lipid membraner som kabinetter for kunstig celle efterligner, der er i stand til at vokse11.
Amphiphilic elastin-lignende di-Block copolymerer (ELPs) er en attraktiv klasse af peptider, som kan tjene som byggesten for sådanne membraner12. Den grundlæggende aminosyresekvens motiv af ELPs er (gagvp)n, hvor "a" kan være enhver aminosyre bortset fra prolin og "n" er antallet af motiv gentagelser13,14,15,16,17 . Elp'er er blevet oprettet med en hydrofobe blok, der hovedsagelig indeholder phenylalanin for a og en hydrofile blok, som hovedsagelig består af glutaminsyre11. Afhængigt af a-og Solution-parametrene, såsom pH-og saltkoncentration, udviser ELPs en såkaldt omvendt temperatur overgang ved temperatur Tt, hvor peptiderne gennemgår en fuldt reversibel faseovergang fra en hydrofile til hydrofobe Staten. Syntesen af peptider kan let implementeres inde vesikler ved hjælp af "TX-TL" bakteriel celle ekstrakt11,18,19,20,21, som giver alle nødvendige komponenter til koblede transskription og oversættelses reaktioner.
TX-TL-systemet blev indkapslet sammen, med DNA-skabelonen, der koder ELPs i ELP-vesikler, der udnytter dehydrering-rehydrering fra glasperler som en solid støtte. Dannelsen af vesikler sker gennem rehydrering af de tørrede peptider fra perlerne overflade11. Andre metoder22 til vesikel dannelse kan anvendes, som potentielt viser lavere polydispersitet og større vesikle størrelser (f. eks. Elektro dannelse, overførsel af emulsions fase eller mikrofluidics-baserede metoder). For at afprøve indkapsling metodens levedygtighed kan transkriptionen af den fluorogene aptamer dBroccoli23 alternativt anvendes11, hvilket er mindre komplekst end genekspression med TX-TL-systemet.
På grund af ekspression af membranen byggesten i vesiculo og deres efterfølgende inkorporering i membranen, begynder vesikler at vokse11. Membran inkorporering af ELPs kan påvises gennem en FRET analyse. Til dette formål er de Elp'er, der anvendes til dannelse af den oprindelige vesikle population, konjugeret med fluorescerende farvestoffer i lige store dele, som udgør et FRET pair. Ved ekspression af ikke-mærkede Elp'er i vesiculo og deres inkorporering i membranen, fortyndes de mærkede Elp'er i membranen, og derfor falder FRET-signalet11. Som en alsidig og almindelig metode til konjugering anvendes kobberkatalyseret Azid-alkyne cycloaddition. Ved brug af en stabiliserende ligand såsom tris (benzyltriazolylmethyl)-Amin kan reaktionen udføres i en vandig opløsning ved en fysiologisk pH-værdi uden hydrolyse af reactanter11, hvilket er passende for konjugering reaktioner involverer peptider.
Følgende protokol indeholder en detaljeret beskrivelse af forberedelsen til dyrkning af ELP-baserede peptidosomer. Udtrykket af peptider og vesikel dannelse ved hjælp af glasperler metode er beskrevet. Desuden er det beskrevet, hvordan man implementerer transkriptionen af den fluorogene dBroccoli aptamer og transskription-oversættelse reaktion for protein ekspression inde i ELP vesikler. Endelig er der fastsat en procedure for konjugering af Elp'er med fluorophorer, som kan bruges til at påvise vesikel vækst gennem en FRET-analyse11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3012-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>733-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN38.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6344.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4432.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P024.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Lucerna Technologies</td>
			<td>410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (&#946;-isopropyl thiogalactoside )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>82.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)</td>
			<td>Baseclick</td>
			<td>BCL-033-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>263.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH stripes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>549.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76180-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W290017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAPol reaction buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap Wipes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8655.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile-filtered (0.22 &#181;m filter)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>XH76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>MRE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth

Opdeling af biokemiske reaktioner er et centralt aspekt af syntetiske celler. Til dette formål tjener peptidbaserede reaktions segmenter som et attraktivt alternativ til Liposomer eller fedtsyre baserede vesikler. Eksternt eller inden for vesicles, peptider kan let udtrykkes og forenkle syntesen af membran prækursorer. Forudsat her er en protokol til oprettelse af vesikler med diametre på ~ 200 Nm baseret på amfifile elastin-lignende polypeptider (ELP) udnytte dehydrering-rehydrering fra glasperler. Også præsenteret er protokoller for bakteriel ELP udtryk og rensning via inverse temperatur cykling, samt deres kovalente funktionalisering med fluorescerende farvestoffer. Desuden beskriver denne rapport en protokol, der gør det muligt at transkriptionen af RNA-aptamer dBroccoli i ELP-vesikler som et mindre komplekst eksempel på en biokemisk reaktion. Endelig er der en protokol, som giver mulighed for vesiculo ekspression af fluorescerende proteiner og membran peptid, mens syntesen af sidstnævnte resulterer i vesikel vækst.

Vesikel produktion Figur 1 viser transmission Electron mikroskopi (tem) billeder af vesikler tilberedt med forskellige opsvulmende opløsninger og glasperler metode (Se også vogele et al.11). For prøven i figur 1ablev kun PBS anvendt som opsvulmende opløsning til at bevise dannelsen af vesikler og til at bestemme deres størrelse. Når TX-TL blev anvendt som opsvulmende opløsning (figur 1b</str...

Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

I Vesiculo-syntesen af Peptidmembranprækursorer til autonom vesikel vækst

Præsenteret her er protokoller til oprettelse af peptid-baserede små af vesikler i stand til vækst. For at lette vesiculo produktion af membranen peptid, disse vesikler er udstyret med en transskription-oversættelse system og peptid-kodning plasmid.

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

I vores protokol bruger vi filmrehydrering fra små glasperler til at danne reaktionsrum lavet af peptider. I eksperimenter drager vi fordel af protokollens enkelhed og robusthed. Den største fordel ved denne teknik er evnen til at indarbejde selv følsomme prøver, såsom den anvendte rå celle ekstrakt.Kontakt med organiske opløsningsmidler vil påvirke prøven betydeligt. For at starte denne procedure skal du bruge en centrifugalvakuumkoncentrator til at koncentrere ELP-opløsningen til 1,1 millimolar. Bland 200 mikroliter af denne koncentrerede opløsning med 1, 250 mikroliter af en 2 til en chloroform og methanol blanding.Vortex løsningen til at blande grundigt. Dernæst tilsættes 1,5 gram sfæriske glasperler til en ti milliliter rund bundkolbe. Elp- og kloroform methanolopløsningen tilsættes den runde bundkolbe, og ryst forsigtigt for at blande den.Kolben forbindes med en roterende fordamper. Hastigheden justeres til 150 omdr./min., og trykket reguleres til 20.000 pascal i ca. fire minutter, indtil væsken fordampes ved stuetemperatur. Det er vigtigt at være forsigtig, når du bruger den roterende fordamper på grund af mulig kogende retardering.Derefter skal aluminiumsfolien løsnet ombrydes omkring åbningen af den runde bundkolbe for at forhindre tab af glasperler og anbringe kolben i en ekssiccator i mindst en time for at sikre, at den resterende kloroform og methanol fordampes. For et enkelt eksperiment blandes 100 mg peptiddækket glasperler med 60 mikroliter af en hævelseopløsning. Inkuber denne prøve ved 25 grader Celsius i fem minutter.Brug en bordplade centrifuge til centrifuge prøverne hurtigt og sediment glasperlerne. Brug derefter en pipette til at indsamle supernatanten, som indeholder vesiklerne. Bland først 100 mikroliter af det forrensede plasmid-DNA med 100 mikroliter af enten Roti-Phenol, chloroform eller isoamylalkohol i et mikrocentrifugerør for at muliggøre bedre faseadskillelse.Inverter forsigtigt røret op til seks gange og centrifugeres ved 16,000 gange g og stuetemperatur i fem minutter. Derefter tilsættes 200 mikroliter chloroform til den øverste fase, og invertere røret op til seks gange. Prøven centrifugeres ved 16,000 gange g og rumtemperatur i fem minutter.Efter dette, pipette supernatant til et separat rør og tilsæt 10 mikroliter af tre molar natriumacetat til ethanol nedbør. Tilsæt en milliliter kold ethanol ved 80 grader Celsius og opbevar prøven ved 80 grader Celsius i en time. Dernæst centrifuge prøven ved 16, 000 gange g og fire grader Celsius i 15 minutter.Dekantere supernatant og tilsæt en milliliter kold 70% ethanol ved 20 grader Celsius. Centrifuge ved 16, 000 gange g og fire grader Celsius i fem minutter. Fjern derefter væsken ved pipettering, pas på ikke at forstyrre DNA-pellet.Prøven opbevares ved stuetemperatur i ca. 15 minutter for at fordampe den resterende ethanol. Derefter tilsættes ultra rent vand til prøven for at justere prøvekoncentrationen til ca. 300 nanomolar, som måles ved absorption ved 260 nanometer. For at forberede transskriptions-oversættelse reaktion, følg den forberedte rå celle udvinding og reaktion buffer på is.For en 60 mikroliter reaktion mix, tilsæt plasma DNA til 37,5 mikroliter af reaktion buffer, tilsæt 28,7 mikroliter af rå celle ekstrakt og fyld med ultra rent vand til et endeligt volumen på 58,8 mikroliter. Lige før reaktionen starter, tilsættes 1,2 mikroliter af T7RNA polymerase opløsning, og pipette op og ned for at blande. Inkuber prøven og en hævelsesopløsning ved 29 grader Celsius under forsøgets varighed, som typisk er fire til otte timer.Transmission elektron mikroskopi billeder af vesikler viser, at forskellige hævelse løsninger, såsom TX / TL eller endda kun PBS kan bruges til at danne vesicles. For begge løsninger er størrelsesbestemmelse et ligetil skridt. Dynamisk lysspredning viser, at vesikler, der er fremstillet uden glasperlerne, resulterer i en diameter på 134 nanometer med en polydispersitet på 25%Når der anvendes glasperler, resulterer diameteren i 168 nanometer med en polydispersitet på 21%Fluorescensintensiteten af to fluorescerende proteiner, som udtrykkes inde i ELP-vesiklerne, måles derefter ved hjælp af en fluorescensplade.Det er vigtigt at bemærke, at efter vesicle dannelse, indholdet af vesiklerne og den ydre opløsning er de samme, således antibiotika Kanamycin tilsættes til den udvendige opløsning til at undertrykke protein udtryk. Som en kontrol, Er Kanamycin også føjet til hævelse opløsning, i hvilket tilfælde protein udtryk inde i vesicle er undertrykt. Dette indikerer, at Kanamycin ikke diffuse gennem membranen, og undertrykker interne udtryk konstant, hele tiden.FRET-analysen udføres derefter for at demonstrere ELP-inkorporering i membranen. Ved udtryk for membranen ELPs, yderligere peptider indarbejde i membranen, hvilket øger den gennemsnitlige afstand mellem FRET par, og som resulterer i en stigning i donor signal. Den præsenterede teknik kan bruges til at producere simple reaktionsbeholdere eller til at skabe kunstige celler med peptidbaserede membraner.Indholdet indeni kan vælges efter behov. Ved at bruge disse peptid vesicles, kan vi nu se frem på mere komplekse syntese reaktioner i dem.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

Guld Nanostar Syntese med en Silver Seed medierede væksthæmning Metode

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Dyrkning af humane neurale stamceller i en 3-dimensionel selvsamlende peptid Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation og indvinding af β-celle Sfæroider Fra Step-vækst PEG-peptid hydrogeler

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddobbeltlaget Vesikel Generation Brug Mikrofluid højtryksspuler

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Analyse af Tubular Membrane Networks i hjertemyocytter fra Atria og hjertekamre

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence resonansenergioverførsel at studere konformationsændringer i Membranproteiner udtrykkes i pattedyrceller

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelektrolyt kompleks for heparinbindende område osteogent vækstfaktor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Syntese af monocyt-targeting peptid Amphiphile Micelles til billeddannelse af åreforkalkning

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Dyrkning pattedyrsceller i tre-dimensionelle peptid stilladser

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...