Name: in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

Wij erkennen financiële steun via de DFG TRR 235 (opkomst van Life, project P15), de Europese Onderzoeksraad (subsidieovereenkomst nr. 694410 AEDNA) en de TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (project nr. 9,05) . Wij danken E. Falgenhauer voor haar hulp met monstervoorbereiding. We bedanken A. Dupin en M. Schwarz-Schilling voor hun hulp bij het TX-TL-systeem en nuttige discussies. Wij danken N. B. Holland voor nuttige discussies.

1. expressie van Elastin-achtige polypeptiden
<ol><li>Dag 1: voorbereiding van een starter cultuur en benodigdheden voor Peptide expressie
	<ol>
<li>Bereiding en autoclaaf expressie kweek kolven (4 x 2,5 L) en 3 L LB medium. Voeg voor 1 L LB medium 25 g LB poeder toe aan 1 L ultrazuiver water.</li>
		<li>Bereid een starter cultuur met 100 mL LB medium, 50 μL steriel-gefilterd (0,22 μm filter) chlooramfenicol oplossing (25 mg/mL in EtOH), en 50 μL steriel-gefilterd (0,22 μm filter) carbenicillin opl...

<ol>
	<li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles.">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li><li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth.">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li><li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes.">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).</li><li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+macromolecules+by+lipid+vesicles+under+simulated+prebiotic+conditions.">Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions.</a> Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).</li><li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Template-Directed+RNA+Synthesis+Inside+Model+Protocells.">Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+growth+and+division+of+model+protocell+membranes.">Coupled growth and division of model protocell membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).</li><li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA.">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).</li><li>Chu, H. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+(ELP)+in+a+cell-free+protein+synthesis+system.">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li><li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Expression,+Aggregation,+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures.">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments.">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers.">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., M&#252;ckl, A., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+communication+between+bacteria+and+cell-free+gene+expression+systems+within+linear+chains+of+emulsion+droplets.">Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets.</a> Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).</li><li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0:+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution.">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+light+scattering:+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences.">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li></ol>

Film rehydratie is een veelgebruikte procedure voor het maken van kleine unilamellaire blaasjes. De belangrijkste bron van falen is de verkeerde omgang met de materialen die in de procedure worden gebruikt.

In eerste instantie worden de Elp's geproduceerd door E. coli cellen. De opbrengst na de zuivering van de ELP kan aanzienlijk variëren, afhankelijk van hoe zorgvuldig het protocol wordt uitgevoerd tijdens de cruci...

De creatie van synthetische levende cellulaire systemen wordt meestal benaderd vanuit twee verschillende richtingen. In de top-down methode wordt het genoom van een bacterie gereduceerd tot de essentiële componenten, wat uiteindelijk leidt tot een minimale cel. In de bottom-up benadering, worden kunstmatige cellen geassembleerd de Novo van moleculaire componenten of cellulaire subsystemen, die functioneel moeten worden geïntegreerd in een consistente cel-achtige systeem.
In de de Novo aanpak wordt de compartimenlise ring van de noodzakelijke biochemische componenten meestal bereikt met behulp van membranen gemaakt van fosfolipiden of vetzuren1,2,3,4. Dit komt omdat "moderne" celmembranen voornamelijk bestaan uit fosfolipiden, terwijl vetzuren worden beschouwd als plausibele kandidaten van prebiotische membraanbehuizingen5,6. Voor de vorming van nieuwe membranen of om membraan groei te vergemakkelijken, moeten amfifiele bouwstenen worden geleverd vanaf de buitenkant7 of idealiter door productie binnen een membraneus compartiment met behulp van de overeenkomstige anabole processen4 ,8.
Hoewel lipide-synthese een relatief complex metabolisch proces is, kunnen peptiden vrij gemakkelijk worden geproduceerd met behulp van celvrije genexpressie-reacties9,10. Vandaar, peptide membranen gevormd door amfifiele peptiden vertegenwoordigen een interessant alternatief voor lipide membranen als Behuizingen voor kunstmatige cel nabootst die in staat zijn om te groeien11.
Amfifiele elastïne-achtige di-Block copolymeren (Elp's) zijn een aantrekkelijke klasse van peptiden, die als bouwsteen voor dergelijke membranen12kunnen dienen. Het basis aminozuursequentie motief van ELPs is (gagvp)n, waarbij "a" elk aminozuur kan zijn behalve Proline en "n" het aantal motief herhalingen13,14,15,16,17 . Elp's zijn gemaakt met een hydrofoob blok met voornamelijk fenylalanine voor a en een hydrofiel blok, voornamelijk samengesteld uit glutaminezuur11. Afhankelijk van een parameter en oplossings parameters, zoals pH en zoutconcentratie, vertonen Elp's een zogenaamde inverse temperatuur overgang bij temperatuur Tt, waarbij de peptiden een volledig omkeerbare faseovergang ondergaan van een hydrofiele naar hydrofobe Staat. De synthese van de peptiden kan gemakkelijk worden geïmplementeerd in blaasjes met behulp van de "TX-TL" bacteriële cel extract11,18,19,20,21, die biedt alle benodigde componenten voor gekoppelde transcriptie-en vertaal reacties.
Het TX-TL-systeem werd samen ingekapseld, met de DNA-sjabloon die de Elp's codeert in ELP-blaasjes met behulp van uitdroging-rehydratatie van glas parels als een solide ondersteuning. De vorming van blaasjes gebeurt door rehydratatie van de gedroogde peptiden van het kraal oppervlak11. Andere methoden22 voor de vorming van blaasje kunnen worden gebruikt, die mogelijk een lagere polydispersiteit en grotere blaasje grootten vertonen (bijv. elektro vorming, emulsie faseoverdracht of microfluidics-gebaseerde methoden). Om de levensvatbaarheid van de inkapings methode te testen, kan een transcriptie van de fluorogene aptamer dBroccoli23 ook worden gebruikt11, wat minder complex is dan GENEXPRESSIE met het TX-TL-systeem.
Door de expressie van de membraan bouwstenen in vesiculo en hun daaropvolgende opname in het membraan, beginnen de blaasjes11te groeien. Membraan opname van de Elp's kan worden aangetoond door middel van een FRET assay. Daartoe worden de elp's die worden gebruikt voor de vorming van de initiële blaasje populatie geconjugeerd met fluorescerende kleurstoffen in gelijke delen die een fret paar vormen. Na expressie van niet-gelabelde Elp's in vesiculo en hun opname in het membraan, worden de gelabelde Elp's in het membraan verdund en bijgevolg daalt het FRET-signaal11. Als een veelzijdige en gemeenschappelijke methode voor conjugatie, koper gekatalyseerde azide-alkyne cycloadditie wordt gebruikt. Met het gebruik van een stabiliserende ligand zoals tris (benzyltriazolylmethyl)-amine, kan de reactie worden uitgevoerd in een waterige oplossing met een fysiologische pH zonder de hydrolyse van reactanten11, die geschikt is voor conjugatie reacties waarbij peptiden betrokken zijn.
Het volgende protocol bevat een gedetailleerde beschrijving van de voorbereiding op het kweken van peptidosomes op basis van ELP. De uitdrukking van de peptiden en vesikel vorming met behulp van de glas kralen methode wordt beschreven. Bovendien wordt beschreven hoe u de transcriptie van de fluor Gene dBroccoli aptamer en de transcriptie-Vertaal reactie voor eiwit expressie in de ELP-blaasjes implementeert. Tot slot is er een procedure voor de conjugatie van Elp's met fluoroforen, die kan worden gebruikt om de groei van de vesikel te bewijzen door middel van een FRET assay11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3012-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>733-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN38.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6344.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4432.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P024.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Lucerna Technologies</td>
			<td>410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (&#946;-isopropyl thiogalactoside )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>82.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)</td>
			<td>Baseclick</td>
			<td>BCL-033-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>263.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH stripes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>549.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76180-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W290017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAPol reaction buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap Wipes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8655.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile-filtered (0.22 &#181;m filter)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>XH76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>MRE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth

Compartimenalisatie van biochemische reacties is een centraal aspect van synthetische cellen. Voor dit doel, peptide-gebaseerde reactie compartimenten dienen als een aantrekkelijk alternatief voor liposomen of vetzuur gebaseerde vesicles. Uitwendig of binnen de blaasjes kunnen peptiden gemakkelijk worden uitgedrukt en de synthese van membraan precursoren vereenvoudigen. Hier is een protocol voor het maken van blaasjes met diameters van ~ 200 nm gebaseerd op de amfifiele elastïne-achtige polypeptiden (ELP) met behulp van uitdroging-rehydratatie van glas kralen. Ook zijn de protocollen voor bacteriële ELP expressie en zuivering via inverse temperatuur fietsen, evenals hun covalente functionalisatie met fluorescerende kleurstoffen. Bovendien beschrijft dit verslag een protocol om de transcriptie van RNA aptamer dBroccoli in ELP-blaasjes als een minder complex voorbeeld voor een biochemische reactie mogelijk te maken. Ten slotte wordt een protocol verstrekt, dat toelaat in vesiculo expressie van fluorescerende eiwitten en het membraan peptide, terwijl de synthese van de laatste resulteert in vesikel groei.

Vesicle productie Figuur 1 toont transmissie elektronenmicroscopie (TEM)-beelden van blaasjes, bereid met verschillende zwelling oplossingen en de glas kralen methode (Zie ook vogele et al.11). Voor het monster in Figuur 1awerd alleen PBS gebruikt als zwelling oplossing om de vorming van blaasjes te bewijzen en om hun grootte te bepalen. Toen TX-TL werd gebruikt als zwelling oplossing (Figuur 1b</s...

Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

In Vesiculo synthese van peptide membraan precursoren voor autonome Vesicle groei

Hier gepresenteerd zijn protocollen voor de creatie van peptide-gebaseerde kleine unilamellaire blaasjes in staat van groei. Om de vesiculo productie van het membraan peptide te vergemakkelijken, zijn deze blaasjes uitgerust met een transcriptie-vertaalsysteem en de peptide-encoding plasmide.

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

In ons protocol gebruiken we filmrehydratatie van kleine glazen kralen om reactiecompartimenten te vormen die zijn gemaakt van peptiden. In experimenten profiteren we van de eenvoud en robuustheid van het protocol. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om zelfs gevoelige monsters op te nemen, zoals het gebruikte ruwe celextract.Contact met organische oplosmiddelen zal het monster aanzienlijk beïnvloeden. Gebruik om deze procedure te starten met een centrifugaalvacuümconcentrator om de ELP-oplossing te concentreren op 1,1 millimolar. Meng 200 microliter van deze geconcentreerde oplossing met 1,250 microliter van een twee-op-een chloroform en methanolmengsel.Vortex de oplossing om grondig te mengen. Voeg vervolgens 1,5 gram bolvormige glazen kralen toe aan een tien milliliter ronde bodemkolf. Voeg de ELP en chloroforme methanoloplossing toe aan de ronde bodemkolf en schud voorzichtig om te mengen.Sluit de kolf aan op een roterende verdamper. Pas de snelheid aan op 150 RPM en regel de druk ongeveer vier minuten op 20.000 pascalen, totdat de vloeistof bij kamertemperatuur verdampt is. Het is belangrijk om voorzichtig te zijn bij het gebruik van de roterende verdamper als gevolg van mogelijke kokende retardatie.Daarna wikkel je aluminiumfolie losjes rond de opening van de ronde bodemkolf om het verlies van glazen kralen te voorkomen en plaats je de kolf minstens een uur in een desiccator, om ervoor te zorgen dat de resterende chloroforme en methanol worden verdampt. Voor een enkel experiment, meng 100 milligram van het peptide bedekte glazen kralen met 60 microliter van een zwelling oplossing. Broed dit monster vijf minuten lang uit op 25 graden Celsius.Gebruik een tafelblad centrifuge om de monsters snel te centrifugeren en sediment de glazen kralen. Gebruik vervolgens een pipet om de supernatant te verzamelen, die de akeltjes bevat. Meng eerst 100 microliter van het vooraf gezuiverde plasmide-DNA met 100 microliter van roti-fenol, chloroform of isoamylalcohol in een microcentrifugebuis om een betere fasescheiding mogelijk te maken.Draai de buis voorzichtig tot zes keer om en centrifuge op 16.000 keer g en kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens 200 microliter chloroform toe aan de bovenste fase en keer de buis tot zes keer om. Centrifugeren het monster op 16.000 keer g en kamertemperatuur gedurende vijf minuten.Pipet hierna de supernatant aan een aparte buis en voeg 10 microliter van drie molaire natriumacetaat toe voor ethanolneerslag. Voeg een milliliter koude ethanol toe bij 80 graden Celsius en bewaar het monster een uur lang op 80 graden Celsius. Vervolgens centrifugeren het monster op 16,000 keer g en vier graden Celsius gedurende 15 minuten.Decanteer de supernatant en voeg een milliliter koude 70% ethanol toe bij 20 graden Celsius. Centrifuge op 16.000 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens de vloeistof door pipetten, voorzichtig te zijn om de DNA-pellet niet te verstoren.Bewaar het monster ongeveer 15 minuten op kamertemperatuur om de resterende ethanol te verdampen. Voeg hierna ultra zuiver water toe aan het monster om de monsterconcentratie aan te passen aan ongeveer 300 nanomolar, die wordt gemeten door absorptie op 260 nanometer. Om de transcriptie-vertaling reactie voor te bereiden, volg de voorbereide ruwe celextractie en de reactiebuffer op ijs.Voor een 60 microliter reactie mix, voeg het plasma-DNA tot 37,5 microliter van de reactiebuffer, voeg 28,7 microliter ruw celextract toe en vul met ultra zuiver water tot een eindvolume van 58,8 microliter. Vlak voordat de reactie begint, voeg 1,2 microliter van de T7RNA polymerase oplossing, en pipet op en neer te mengen. Incubeer het monster en een zwellingsoplossing bij 29 graden Celsius voor de duur van het experiment, dat meestal vier tot acht uur is.Transmissie elektronenmicroscopie beelden van akeltjes tonen aan dat verschillende zwelling oplossingen, zoals TX / TL of zelfs alleen PBS kan worden gebruikt om vesicles te vormen. Voor beide oplossingen is groottebepaling een stap voorwaarts. Dynamische lichtverstrooiing toont aan dat vesicles bereid zonder de glazen kralen methode resulteren in een diameter van 134 nanometer, met een polydispersiteit van 25%Wanneer glazen kralen worden gebruikt, resulteert de diameter in 168 nanometer, met een polydispersiteit van 21%De fluorescentieintensiteit van twee fluorescerende eiwitten, die worden uitgedrukt in de ELP-fluitjes, worden vervolgens gemeten met behulp van een fluorescentieplaatlezer.Het is belangrijk op te merken dat na de vorming van blaasjes, de inhoud van de blaasjes en de buitenste oplossing hetzelfde zijn, dus het antibioticum Kanamycine wordt toegevoegd aan de buitenoplossing om eiwitexpressie te onderdrukken. Als controle wordt Kanamycine ook toegevoegd aan de zwellingsoplossing, in welk geval eiwitexpressie in de blaas in wordt onderdrukt. Dit geeft aan dat Kanamycine niet diffuus door het membraan, en onderdrukt interne expressie voortdurend, de hele tijd.De FRET-test wordt vervolgens uitgevoerd om elp-integratie in het membraan aan te tonen. Bij expressie van het membraan nemen extra peptiden op in het membraan, wat de gemiddelde afstand tussen de FRET-paren verhoogt en resulteert in een toename van het donorsignaal. De gepresenteerde techniek kan worden gebruikt om eenvoudige reactiecontainers te produceren of om kunstmatige cellen te maken met op peptide gebaseerde membranen.De inhoud binnenin kan naar behoefte worden gekozen. Door het gebruik van deze peptide vesicles, kunnen we nu vooruit kijken op meer complexe synthese reacties binnen hen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Axon Stretch groei: de Mechanotransductie van neuronale groei

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

Goud Nanostar Synthese met een Silver Zaad gemedieerde groei Methode

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generatie en terugwinning van β-cel sferoïden Van Step-groei PEG-peptide Hydrogelen

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Analyse van buisvormig membraan Netwerken in hartspiercellen van boezems en kamers

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescentie Resonance Energy Transfer om te studeren vormveranderingen in membraaneiwitten Uitgedrukt in zoogdiercellen

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelectrolyte Complex voor Heparine Binding Domain osteogeen Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Synthese van monocyt-targeting Peptide Amfifiel micellen voor beeldvorming van atherosclerose

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Kweken van zoogdiercellen in driedimensionale Peptide steigers

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...