Name: in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

Nous remercions le soutien financier par le biais de la DFG TRR 235 (Emergence of Life, projet P15), du Conseil européen de la recherche (accord de subvention no 694410 AEDNA) et de la TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (projet no 9.05) . Nous remercions E. Falgenhauer pour son aide dans la préparation des échantillons. Nous remercions A. Dupin et M. Schwarz-Schilling pour leur aide dans le système TX-TL et pour leurs discussions utiles. Nous remercions N. B. Holland pour les discussions utiles.

1. Expression de polypeptides de l'élastine
<ol><li>Jour 1: Préparation d'une culture de démarrage et fournitures pour l'expression peptide
	<ol>
<li>Préparer et autoclaveexpression des flacons de culture d'expression (4 x 2,5 L) et 3 L de milieu LB. Pour 1 L de lb moyen, ajouter 25 g de poudre LB à 1 L d'eau ultrapure.</li>
		<li>Préparer une culture de démarrage avec 100 ml de milieu LB, 50 l de solution de chloramphenicol filtrée stérile (0,22 m) (25 mg/mL en EtOH) et 50 l de solution de ca...

<ol>
	<li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles.">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li><li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth.">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li><li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes.">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).</li><li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+(ELP)+in+a+cell-free+protein+synthesis+system.">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li><li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Expression,+Aggregation,+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures.">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments.">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers.">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., M&#252;ckl, A., Simmel, F. 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R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution.">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+light+scattering:+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences.">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li></ol>

La réhydratation du film est une procédure courante pour la création de petites vésicules unilamellar. La principale source de défaillance est la mauvaise manipulation des matériaux utilisés dans la procédure.

Initialement, les PEL sont produits par des cellules E. coli. Le rendement après la purification du PEL peut varier considérablement en fonction de la prudence avec soin du protocole au cours de ses é...

La création de systèmes cellulaires vivants synthétiques est généralement approchée à partir de deux directions différentes. Dans la méthode descendante, le génome d'une bactérie est réduit à ses composants essentiels, conduisant finalement à une cellule minimale. Dans l'approche ascendante, les cellules artificielles sont assemblées de novo à partir de composants moléculaires ou de sous-systèmes cellulaires, qui doivent être intégrés fonctionnellement dans un système cellulaire cohérent.
Dans l'approche de novo, la compartimentation des composants biochimiques nécessaires est généralement réalisée à l'aide de membranes faites de phospholipides ou d'acides gras1,2,3,4. C'est parce que les membranes cellulaires "modernes" se composent principalement de phospholipides, tandis que les acides gras sont considérés comme des candidats plausibles des enceintes de membrane prébiotique5,6. Pour la formation de nouvelles membranes ou pour faciliter la croissance des membranes, les blocs de construction amphiphiles doivent être fournis à partir de l'extérieur7 ou idéalement par la production dans un compartiment membranaire en utilisant les processus anabolisants correspondants4 ,8.
Tandis que la synthèse de lipide est un processus métabolique relativement complexe, les peptides peuvent être produits tout à fait facilement utilisant des réactions d'expression de gène cell-libres9,10. Par conséquent, les membranes peptidiques formées par les peptides amphiphiles représentent une alternative intéressante aux membranes lipidiques comme enclos pour les imitations de cellules artificielles qui sont capables de se développer11.
Les copolymères de di-bloc d'élastine amphiphiles (PEL) sont une classe attrayante de peptides, qui peuvent servir de bloc de construction pour de telles membranes12. Le motif de base de séquence d'acide aminé des PEL est (GaGVP)n, où "a" peut être n'importe quel acide aminé excepté la proline et « n » est le nombre de répétitions de motif13,14,15,16,17 . Les PEL ont été créés avec un bloc hydrophobe contenant principalement de la phénylalanine pour un bloc hydrophile et principalement composé d'acide glutamique11. Selon les paramètres d'une solution, tels que le pH et la concentration de sel, les PEL présentent une transition de température dite inverse à la température Tt, où les peptides subissent une transition de phase entièrement réversible d'un hydrophile à l'hydrophobe état. La synthèse des peptides peut être facilement mis en œuvre à l'intérieur des vésicules à l'aide de l'extrait de cellules bactériennes "TX-TL"11,18,19,20,21, qui fournit tous les composants nécessaires pour les réactions couplées de transcription et de traduction.
Le système TX-TL a été encapsulé ensemble, avec le modèle d'ADN codant les PEL en vésicules ELP en utilisant la déshydratation-réhydratation des perles de verre comme un soutien solide. La formation de vésicules se produit par la réhydratation des peptides séchés de la surface de perle11. D'autres méthodes22 pour la formation de vésicules peuvent être utilisées, qui peuvent potentiellement montrer une polydispersity plus faible et de plus grandes tailles de vésicule (par exemple, électro-formation, transfert de phase d'émulsion, ou méthodes microfluidiques). Pour tester la viabilité de la méthode d'encapsulation, la transcription de l'aptamer fluorogénique dBroccoli23 peut alternativement être utilisée11, ce qui est moins complexe que l'expression génique avec le système TX-TL.
En raison de l'expression des blocs de construction de membrane dans vesiculo et de leur incorporation ultérieure dans la membrane, les vésicules commencent à se développer11. L'incorporation de membrane des PEL peut être démontrée par un analyse FRET. À cette fin, les PEL utilisés pour la formation de la population initiale de vésicules sont conjugués avec des colorants fluorescents en parts égales constituant une paire FRET. Lors de l'expression des PEL non étiquetés en vesiculo et de leur incorporation dans la membrane, les PEL étiquetés dans la membrane sont dilués et, par conséquent, le signal FRET diminuede 11. Comme méthode polyvalente et commune pour la conjugaison, le cuivre catalysé azide-alkyne cycloaddition est utilisé. Avec l'utilisation d'un ligand stabilisateur tel que tris (benzyltriazolylmethyl)-amine, la réaction peut être effectuée dans une solution aqueuse à un pH physiologique sans l'hydrolyse des réactifs11, ce qui est approprié pour les réactions de conjugaison peptides.
Le protocole suivant présente une description détaillée de la préparation pour la croissance des peptidosomes à base de PEL. L'expression des peptides et de la formation de vésicule utilisant la méthode de perles de verre sont décrites. En outre, il est décrit comment mettre en œuvre la transcription de l'aptamer fluorogénique dBroccoli et la réaction de transcription-traduction pour l'expression de protéine à l'intérieur des vésicules d'ELP. Enfin, à condition est une procédure pour la conjugaison des PEL avec des fluorophores, qui peut être utilisé pour prouver la croissance de la vésicule par un test FRET11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3012-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>733-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN38.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6344.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4432.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P024.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Lucerna Technologies</td>
			<td>410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (&#946;-isopropyl thiogalactoside )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>82.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)</td>
			<td>Baseclick</td>
			<td>BCL-033-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>263.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH stripes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>549.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76180-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W290017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAPol reaction buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap Wipes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8655.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile-filtered (0.22 &#181;m filter)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>XH76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>MRE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth

La compartimentation des réactions biochimiques est un aspect central des cellules synthétiques. À cette fin, les compartiments de réaction à base de peptides constituent une alternative attrayante aux liposomes ou aux vésicules à base d'acides gras. Extérieurement ou à l'intérieur des vésicules, les peptides peuvent être facilement exprimés et simplifier la synthèse des précurseurs de la membrane. Fourni ici est un protocole pour la création de vésicules avec des diamètres de 200 nm à base de l'élastine amphiphile-comme polypeptides (ELP) en utilisant la déshydratation-réhydratation à partir de perles de verre. Sont également présentés des protocoles pour l'expression et la purification bactériennes du PEL par le biais du cycle de température inverse, ainsi que leur fonctionnalisation covalente avec des colorants fluorescents. En outre, ce rapport décrit un protocole pour permettre la transcription du dbroccoli dBroccoli d'aptamer d'ARN à l'intérieur des vésicules d'ELP comme exemple moins complexe pour une réaction biochimique. Enfin, un protocole est fourni, qui permet dans l'expression vesiculo des protéines fluorescentes et le peptide de membrane, tandis que la synthèse de ce dernier entraîne la croissance vésiculeuse.

Production de vésicules La figure 1 montre des images de microscopie électronique de transmission (TEM) de vésicules préparées avec différentes solutions de gonflement et la méthode des perles de verre (voir aussi Vogele et al.11 ). Pour l'échantillon de la figure 1A, seul le PBS a été utilisé comme solution d'enflure pour prouver la formation de vésicules et déterminer leur taille. Lorsque TX-TL a été u...

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In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Dans Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Présentés ici sont des protocoles pour la création de petits vésicules unilamellar à base de peptides capables de croître. Pour faciliter la production de vesiculo du peptide membranaire, ces vésicules sont équipées d'un système de transcription-traduction et du plasmide codant peptide.

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Dans notre protocole, nous utilisons la réhydratation du film à partir de petites perles de verre pour former des compartiments de réaction faits de peptides. Dans les expériences, nous profitons de la simplicité et de la robustesse du protocole. Le principal avantage de cette technique est la capacité d’incorporer même des échantillons sensibles, tels que l’extrait de cellules brutes utilisé.Le contact avec les solvants organiques affectera considérablement l’échantillon. Pour commencer cette procédure, utilisez un concentrateur de vide centrifuge pour concentrer la solution PEL à 1,1 millimolaire. Mélanger 200 microlitres de cette solution concentrée avec 1 250 microlitres d’un mélange de chloroforme et de méthanol de deux à un.Vortex la solution pour bien mélanger. Ensuite, ajoutez 1,5 gramme de perles de verre sphériques à un flacon de fond rond de dix millilitres. Ajouter le PEL et la solution de méthanol chloroforme au flacon du fond rond et agiter délicatement pour mélanger.Connectez le flacon à un évaporateur rotatif. Réglez la vitesse à 150 RPM et réglez la pression à 20 000 pascals pendant environ quatre minutes, jusqu’à ce que le liquide soit évaporé à température ambiante. Il est important d’être prudent lors de l’utilisation de l’évaporateur rotatif en raison d’un retard d’ébullition possible.Après cela, envelopper lâchement du papier d’aluminium autour de l’ouverture de la fiole du fond rond pour éviter la perte de perles de verre et placer le flacon dans un dessiccateur pendant au moins une heure, pour s’assurer que le chloroforme et le méthanol restants sont évaporés. Pour une seule expérience, mélanger 100 milligrammes de perles de verre recouvertes de peptide avec 60 microlitres d’une solution de gonflement. Incuber cet échantillon à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes.Utilisez une centrifugeuse de table pour centrifuger rapidement les échantillons et sédimenter les perles de verre. Ensuite, utilisez une pipette pour recueillir le supernatant, qui contient les vésicules. Tout d’abord, mélanger 100 microlitres de l’ADN plasmide pré-purifié avec 100 microlitres d’alcool Roti-Phénol, chloroforme ou isoamyle dans un tube de micro centrifugeuse pour permettre une meilleure séparation de phase.Inversez doucement le tube jusqu’à six fois et centrifugez à 16 000 fois g et température ambiante pendant cinq minutes. Ajouter ensuite 200 microlitres de chloroforme à la phase supérieure et inverser le tube jusqu’à six fois. Centrifugez l’échantillon à 16 000 fois g et température ambiante pendant cinq minutes.Après cela, pipette le supernatant à un tube séparé et ajouter 10 microlitres de trois acétate de sodium molaire pour les précipitations d’éthanol. Ajouter un millilitre d’éthanol froid à 80 degrés Celsius et conserver l’échantillon à 80 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 16 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.Décanter le supernatant et ajouter un millilitre de froid 70% d’éthanol à 20 degrés Celsius. Centrifugeuse à 16 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le liquide par pipetting, en prenant soin de ne pas déranger la pastille d’ADN.Conserver l’échantillon à température ambiante pendant environ 15 minutes pour évaporer le reste de l’éthanol. Après cela, ajouter de l’eau ultra pure à l’échantillon pour ajuster la concentration de l’échantillon à environ 300 nanomolaires, qui est mesurée par absorption à 260 nanomètres. Pour préparer la réaction transcription-traduction, suivez l’extraction des cellules brutes préparées et le tampon de réaction sur la glace.Pour un mélange de réaction de 60 microlitres, ajouter l’ADN plasmatique à 37,5 microlitres du tampon de réaction, ajouter 28,7 microlitres d’extrait de cellules brutes et remplir d’eau ultra pure à un volume final de 58,8 microlitres. Juste avant le début de la réaction, ajouter 1,2 microlitres de la solution de polymése T7RNA, et pipette de haut en bas pour mélanger. Incuber l’échantillon et une solution de gonflement à 29 degrés Celsius pour la durée de l’expérience, qui est généralement de quatre à huit heures.Les images de microscopie électronique de transmission des vésicules montrent que diverses solutions de gonflement, telles que TX/TL ou même seulement PBS peuvent être employées pour former des vésicules. Pour les deux solutions, la détermination de la taille est un pas en avant. La diffusion dynamique de la lumière montre que les vésicules préparées sans la méthode des perles de verre ont un diamètre de 134 nanomètres, avec une polydispersité de 25%Lorsque des perles de verre sont utilisées, le diamètre se traduit par 168 nanomètres, avec une polydispersité de 21%L’intensité de fluorescence de deux protéines fluorescentes, qui sont exprimées à l’intérieur des vésicules PEL, sont ensuite mesurées à l’aide d’un lecteur de plaque de fluorescence.Il est important de noter qu’après la formation de vésicules, le contenu des vésicules et la solution externe sont les mêmes, donc, l’antibiotique Kanamycine est ajouté à la solution extérieure pour supprimer l’expression des protéines. Comme contrôle, la kanamycine est également ajoutée à la solution de gonflement, auquel cas l’expression de protéine à l’intérieur de la vésicule est supprimée. Cela indique que kanamycine ne diffuse pas à travers la membrane, et supprime l’expression interne en permanence, tout le temps.L’analyse fret est ensuite effectuée pour démontrer l’incorporation du PEL dans la membrane. Lors de l’expression des PEL membranaires, des peptides supplémentaires s’incorporent dans la membrane, ce qui augmente la distance moyenne entre les paires fret, et qui entraîne une augmentation du signal donneur. La technique présentée peut être utilisée pour produire des récipients de réaction simples ou pour créer des cellules artificielles avec des membranes à base de peptide.Le contenu à l’intérieur peut être choisi au besoin. En utilisant ces vésicules peptidiques, nous pouvons maintenant nous attendre à des réactions de synthèse plus complexes en leur sein.

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