Name: in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00
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Wir danken der finanziellen Unterstützung durch die DFG TRR 235 (Emergence of Life, Projekt P15), den European Research Council (Fördervertrag Nr. 694410 AEDNA) und die TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (Projekt Nr. 9.05) . Wir danken E. Falgenhauer für ihre Hilfe bei der Probenvorbereitung. Wir danken A. Dupin und M. Schwarz-Schilling für ihre Hilfe beim TX-TL System und nützliche Diskussionen. Wir danken N. B. Holland für die nützlichen Diskussionen.

1. Expression von Elastin-ähnlichen Polypeptiden
<ol><li>Tag 1: Vorbereitung einer Starterkultur und Vorräte für Peptidexpression
	<ol>
<li>Vorbereiten und Autoklavausdruckskulturkolben (4 x 2,5 l) und 3 L LB-Medium. Für 1 L LB Medium 25 g LB-Pulver zu 1 L Reinstwasser hinzufügen.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Starterkultur mit 100 ml LB-Medium, 50 l sterilgefilterter (0,22-m-Filter)-Chloramphenicol-Lösung (25 mg/ml in EtOH) und 50 l sterilgefiltertem (0,22-mm-Filter) Carbenicillin-Lösung (100 mg...

<ol>
	<li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles.">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li><li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth.">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li><li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes.">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).</li><li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+macromolecules+by+lipid+vesicles+under+simulated+prebiotic+conditions.">Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions.</a> Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).</li><li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Template-Directed+RNA+Synthesis+Inside+Model+Protocells.">Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+growth+and+division+of+model+protocell+membranes.">Coupled growth and division of model protocell membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).</li><li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA.">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).</li><li>Chu, H. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+(ELP)+in+a+cell-free+protein+synthesis+system.">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li><li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Expression,+Aggregation,+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures.">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments.">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers.">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., M&#252;ckl, A., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+communication+between+bacteria+and+cell-free+gene+expression+systems+within+linear+chains+of+emulsion+droplets.">Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets.</a> Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).</li><li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0:+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution.">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+light+scattering:+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences.">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li></ol>

Filmrehydratation ist ein gängiges Verfahren zur Herstellung von kleinen unilamellalaren Vesikeln. Die Hauptursache des Versagens ist die falsche Handhabung der im Verfahren verwendeten Materialien.

Zunächst werden die ELPs von E. coli-Zellen produziert. Die Ausbeute nach der ELP-Reinigung kann je nachdem, wie sorgfältig das Protokoll während seiner entscheidenden Schritte durchgeführt wird, erheblich variieren. ...

Die Schaffung von synthetischen lebenden zellulären Systemen wird in der Regel aus zwei verschiedenen Richtungen angegangen. Bei der Top-Down-Methode wird das Genom eines Bakteriums auf seine wesentlichen Bestandteile reduziert, was letztlich zu einer minimalen Zelle führt. Im Bottom-up-Ansatz werden künstliche Zellen de novo aus molekularen Komponenten oder zellulären Subsystemen zusammengesetzt, die funktional in ein konsistentes zellähnliches System integriert werden müssen.
Im de novo-Ansatz wird die Kompartimentierung der notwendigen biochemischen Komponenten in der Regel mit Membranen aus Phospholipiden oder Fettsäuren1,2,3,4erreicht. Denn "moderne" Zellmembranen bestehen hauptsächlich aus Phospholipiden, während Fettsäuren als plausible Kandidaten präbiotischer Membrangehäuse5,6gelten. Zur Bildung neuer Membranen oder zur Erleichterung des Membranwachstums müssen amphiphile Bausteine von außen7 oder idealerweise durch die Produktion innerhalb eines membranösen Fachs mit den entsprechenden anabolen Verfahren 4 ,8.
Während die Lipidsynthese ein relativ komplexer Stoffwechselprozess ist, können Peptide recht leicht mit zellfreien Genexpressionsreaktionen9,10produziert werden. Daher stellen Peptidmembranen, die durch amphiphile Peptide gebildet werden, eine interessante Alternative zu Lipidmembranen als Gehäuse für künstliche Zellmimiks dar, die11wachsen können.
Amphiphile Elastin-ähnliche Diblock-Copolymere (ELPs) sind eine attraktive Klasse von Peptiden, die als Baustein für solche Membranen dienen können12. Das grundlegende Aminosäuresequenzmotiv von ELPs ist (GaGVP)n, wobei "a" eine beliebige Aminosäure außer Prolin und "n" die Anzahl der Motivwiederholungen13,14,15,16,17 . ELPs wurden mit einem hydrophoben Block erstellt, der hauptsächlich Phenylalanin für a enthält, und einem hydrophilen Block, der hauptsächlich aus Glutaminsäurebesteht 11. Je nach A- und Lösungsparametern wie pH- und Salzkonzentration weisen ELPs einen sogenannten inversen Temperaturübergang bei Temperatur Ttauf, bei dem die Peptide einen vollständig reversiblen Phasenübergang von einem hydrophilen zu hydroben zustand. Die Synthese der Peptide kann einfach in Vesikelmit dem Bakterienzellextrakt "TX-TL" implementiert werden11,18,19,20,21, alle notwendigen Komponenten für gekoppelte Transkriptions- und Übersetzungsreaktionen.
Das TX-TL-System wurde zusammengekapselt, wobei die DNA-Vorlage die ELPs in ELP-Vesikel kodiert, wobei die Dehydrierung-Rehydratation von Glasperlen als feste Stütze verwendet wird. Die Bildung von Vesikel n.A. erfolgt durch Rehydrierung der getrockneten Peptide von der Perlenoberfläche11. Es können andere Methoden22 zur Vesikelbildung eingesetzt werden, die möglicherweise eine geringere Polydispersität und größere Vesikelgrößen aufweisen (z. B. Elektrobildung, Emulsionsphasentransfer oder mikrofluidische Verfahren). Zur Prüfung der Lebensfähigkeit der Verkapselungsmethode kann alternativ die Transkription des fluorogenen Aptamers dBroccoli23 verwendet werden11, was weniger komplex ist als die Genexpression mit dem TX-TL-System.
Durch die Expression der Membranbausteine in vesiculo und deren anschließende Einbindungin die Membran beginnen die Vesikel 11 zu wachsen. Die Membranintegration der ELPs kann durch einen FRET-Assay nachgewiesen werden. Zu diesem Zweck werden die ELPs, die für die Bildung der ursprünglichen Vesikelpopulation verwendet werden, mit fluoreszierenden Farbstoffen in gleichen Teilen konjugiert, die ein FRET-Paar bilden. Bei Expression von nicht gekennzeichneten ELPs in vesiculo und deren Einbau in die Membran werden die beschrifteten ELPs in der Membran verdünnt und damit das FRET-Signal um11abgenommen. Als vielseitige und gängige Methode zur Konjugation wird kupferkatalysierte Azid-Alkyn-Zyklusverwendet verwendet. Mit der Verwendung eines stabilisierenden Liganden wie Tris (Benzyltriazolylmethyl)-amin kann die Reaktion in einer wässrigen Lösung bei einem physiologischen pH-Wert ohne Hydrolyse von Reaktanten11durchgeführt werden, die für Konjugationsreaktionen geeignet ist. Peptide.
Das folgende Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der Vorbereitung für wachsende ELP-basierte Peptidosomen. Die Expression der Peptide und vesikelbildung mit der Glasperlenmethode werden beschrieben. Darüber hinaus wird beschrieben, wie die Transkription des fluorogenen dBroccoli Aptamers und die Transkriptions-Translation-Reaktion für die Proteinexpression innerhalb der ELP-Vesikel implementiert werden kann. Schließlich ist ein Verfahren für die Konjugation von Elp mit Fluorophoren vorgesehen, das verwendet werden kann, um das Vesikelwachstum durch einen FRET-Assay11nachzuweisen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3012-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>733-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN38.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6344.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4432.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P024.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Lucerna Technologies</td>
			<td>410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (&#946;-isopropyl thiogalactoside )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>82.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)</td>
			<td>Baseclick</td>
			<td>BCL-033-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>263.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH stripes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>549.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76180-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W290017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAPol reaction buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap Wipes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8655.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile-filtered (0.22 &#181;m filter)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>XH76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>MRE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth

Die Abteilisierung biochemischer Reaktionen ist ein zentraler Aspekt synthetischer Zellen. Zu diesem Zweck dienen Peptid-basierte Reaktionsfächer als attraktive Alternative zu Liposomen oder fettsäurebasierten Vesikeln. Äußerlich oder innerhalb der Vesikel können Peptide leicht exprimiert werden und vereinfachen die Synthese von Membranvorläufern. Hier ist ein Protokoll zur Herstellung von Vesikeln mit Durchmessern von 200 nm auf Basis der amphiphilen Elastin-ähnlichen Polypeptide (ELP) unter Verwendung von Dehydrierung-Rehydratation aus Glasperlen vorgesehen. Ebenfalls vorgestellt werden Protokolle zur bakteriellen ELP-Expression und -Reinigung über inverseS Temperaturzyklierung sowie deren kovalente Funktionalisierung mit Fluoreszenzfarbstoffen. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht ein Protokoll, das die Transkription von RNA-Aptamer dBroccoli in ELP-Vesikeln als weniger komplexes Beispiel für eine biochemische Reaktion ermöglicht. Schließlich wird ein Protokoll zur Verfügung gestellt, das die Vesiculo-Expression von fluoreszierenden Proteinen und dem Membranpeptid ermöglicht, während die Synthese des letzteren zu einem Vesikelwachstum führt.

Vesikelproduktion Abbildung 1 zeigt Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Bilder von Vesikeln, die mit verschiedenen Schwellungslösungen hergestellt wurden, und die Glasperlenmethode (siehe auch Vogele et al.11). Für die Probe in Abbildung 1Awurde nur PBS als Quelllösung verwendet, um die Bildung von Vesikeln zu beweisen und ihre Größe zu bestimmen. Wenn TX-TL als Quelllösung verwendet wurde (<strong class="xf...

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In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

In Vesiculo Synthese von Peptid Membran Vorläufer für autonomeve Vesikelwachstum

Hier werden Protokolle zur Herstellung von peptidbasierten kleinen unilamellalaren Vesikeln vorgestellt, die wachstumsfähig sind. Um die Vesiculo-Produktion des Membranpeptids zu erleichtern, sind diese Vesikel mit einem Transkriptions-Translation-System und dem Peptid-kodierenden Plasmid ausgestattet.

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

In unserem Protokoll verwenden wir die Filmrehydratation aus kleinen Glasperlen, um Reaktionsfächer aus Peptiden zu bilden. In Experimenten profitieren wir von der Einfachheit und Robustheit des Protokolls. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, auch empfindliche Proben, wie den verwendeten Rohzellextrakt, zu integrieren.Der Kontakt mit organischen Lösungsmitteln wird die Probe erheblich beeinflussen. Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie einen Zentrifugalvakuumkonzentrator, um die ELP-Lösung auf 1,1 Millimolar zu konzentrieren. Mischen Sie 200 Mikroliter dieser konzentrierten Lösung mit 1, 250 Mikrolitern eines Zwei-zu-Eins-Chlor-Und-Methanol-Gemischs.Wirbel die Lösung gründlich zu mischen. Als nächstes fügen Sie 1,5 Gramm kugelförmige Glasperlen zu einem zehn Milliliter runden Bodenkolben hinzu. Fügen Sie die ELP- und Chloroform-Methanol-Lösung in den runden Bodenkolben und schütteln Sie sie vorsichtig.Schließen Sie den Kolben an einen Rotationsverdampfer an. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 150 Umdrehungen pro Minute ein und regulieren Sie den Druck für etwa vier Minuten auf 20.000 Pascal, bis die Flüssigkeit bei Raumtemperatur verdampft ist. Es ist wichtig, vorsichtig zu sein, wenn Sie den Rotationsverdampfer aufgrund einer möglichen Siedeverzögerung verwenden.Danach die Aluminiumfolie locker um die Öffnung des runden Bodenkolbens wickeln, um den Verlust von Glasperlen zu verhindern und den Kolben mindestens eine Stunde lang in einen Trockenkörper zu legen, um sicherzustellen, dass die verbleibenden Chloroformen und Methanolverdampfen verdampfen. Für ein einzelnes Experiment 100 Milligramm der Peptid bedeckten Glasperlen mit 60 Mikroliter einer Schwellungslösung mischen. Inkubieren Sie diese Probe bei 25 Grad Celsius für fünf Minuten.Verwenden Sie eine Tischzentrifuge, um die Proben schnell zu zentrifugieren und die Glasperlen zu sedimentieren. Verwenden Sie dann eine Pipette, um den Überstand zu sammeln, der die Vesikel enthält. Mischen Sie zunächst 100 Mikroliter der vorgereinigten Plasmid-DNA mit 100 Mikrolitern Roti-Phenol, Chloroform oder Isoamylalkohol in einem Mikrozentrifugenrohr, um eine bessere Phasentrennung zu ermöglichen.Umdrehen Sie das Rohr bis zu sechs Mal und Zentrifugen bei 16.000 mal g und Raumtemperatur für fünf Minuten. Dann 200 Mikroliter Chloroform in die obere Phase geben und das Rohr bis zu sechsmal invertieren. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 mal g und Raumtemperatur für fünf Minuten.Danach den Überstand in ein separates Rohr pipette und 10 Mikroliter drei Molnatriumacetat für die Ethanolfällung hinzufügen. Fügen Sie einen Milliliter kaltes Ethanol bei 80 Grad Celsius hinzu und lagern Sie die Probe bei 80 Grad Celsius für eine Stunde. Als nächstes zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 mal g und vier Grad Celsius für 15 Minuten.Dekantieren Sie den Überstand und fügen Sie einen Milliliter kaltes 70%Ethanol bei 20 Grad Celsius hinzu. Zentrifuge bei 16.000 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie dann die Flüssigkeit durch Pipettieren, wobei Sie darauf achten, das DNA-Pellet nicht zu stören.Die Probe bei Raumtemperatur ca. 15 Minuten aufbewahren, um das restliche Ethanol zu verdampfen. Fügen Sie anschließend ultrareines Wasser in die Probe ein, um die Probenkonzentration auf ca. 300 Nanomolar anzupassen, die durch Absorption bei 260 Nanometern gemessen wird. Um die Transkriptions-Translation-Reaktion vorzubereiten, folgen Sie der vorbereiteten Rohzellextraktion und dem Reaktionspuffer auf Eis.Für einen 60-Mikroliter-Reaktionsmix die Plasma-DNA zu 37,5 Mikrolitern des Reaktionspuffers hinzufügen, 28,7 Mikroliter Rohzellextrakt hinzufügen und mit ultrareinem Wasser auf ein Endvolumen von 58,8 Mikroliter füllen. Unmittelbar bevor die Reaktion beginnt, 1,2 Mikroliter der T7RNA-Polymerase-Lösung und Pipette nach oben und unten geben, um sie zu mischen. Inkubieren Sie die Probe und eine Schwellungslösung bei 29 Grad Celsius für die Dauer des Experiments, die in der Regel vier bis acht Stunden beträgt.Transmissionselektronenmikroskopiebilder von Vesikeln zeigen, dass verschiedene Quelllösungen, wie TX/TL oder auch nur PBS, zur Bildung von Vesikeln verwendet werden können. Für beide Lösungen ist die Größenbestimmung ein gerader Schritt. Dynamische Lichtstreuung zeigt, dass Vesikel, die ohne die Glasperlenmethode hergestellt werden, zu einem Durchmesser von 134 Nanometern führen, mit einer Polydispersität von 25%Wenn Glasperlen verwendet werden, ergibt sich der Durchmesser in 168 Nanometern, mit einer Polydispersität von 21%Die Fluoreszenzintensität von zwei fluoreszierenden Proteinen, die in den ELP-Vesikeln exprimiert werden, wird dann mit einem Fluoreszenzleser gemessen.Es ist wichtig zu beachten, dass nach der Vesikelbildung der Inhalt der Vesikel und der äußeren Lösung gleich sind, so dass das Antibiotikum Kanamycin der äußeren Lösung zugesetzt wird, um die Proteinexpression zu unterdrücken. Als Kontrolle wird Kanamycin auch der Quelllösung zugesetzt, wodurch die Proteinexpression im Inneren des Vesikels unterdrückt wird. Dies deutet darauf hin, dass Kanamycin nicht durch die Membran diffundiert, und unterdrückt den inneren Ausdruck ständig, die ganze Zeit.Der FRET-Assay wird dann durchgeführt, um die ELP-Inkorporation in die Membran nachzuweisen. Bei expression der Membran-ELPs werden zusätzliche Peptide in die Membran integriert, was den durchschnittlichen Abstand zwischen den FRET-Paaren erhöht und zu einer Erhöhung des Spendersignals führt. Die vorgestellte Technik kann verwendet werden, um einfache Reaktionsbehälter zu produzieren oder künstliche Zellen mit Peptid-basierten Membranen zu erstellen.Der Inhalt im Inneren kann nach Bedarf ausgewählt werden. Durch die Verwendung dieser Peptidvesik, können wir jetzt auf komplexere Synthesereaktionen in ihnen freuen.

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